TGFβ1反义寡核苷酸对大鼠肝脏星状细胞激活及其胶原生成的抑制作用

为探讨 TGFβ1 反义寡核苷酸 (antisense oligonucleotides,ASON)对大鼠肝脏星状细胞活化及其胶原生成的作用 ,作者合成了特异性的 TGFβ1 硫代磷酸 ASON及其对照 (正义 ,错义寡核苷酸 ) ,并将其加入至培养的肝脏星状细胞中。通过细胞免疫化学方法分析 α- SMA的表达来观察肝脏星状细胞的活化 ,肝脏星状细胞产生TGFβ的水平用生物学方法测定 ,以 3H-脯氨酸掺入抑制率的测定观察胶原生成的变化。结果 :针对 TGFβ1 m RNA转译起始区的 ASON在终浓度为 1 0 μm ol/ L 时 ,能明显地抑制体外培养的肝脏星状细胞的激活、TGFβ1 的产生及其胶原的生成能力 ,而对照组寡核苷酸在相同浓度下未见抑制效应。上述结果表明 ,ASON对肝脏星状细胞无损伤作用。 TGFβ1 ASON可能成为一种潜在的抗肝纤维化治疗的药物。     

TGFβ1反义寡核苷酸对大鼠肝脏星状细胞激活及其胶原生成的 …

为探讨ＴＧＦβ１反义寡核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ,ＡＳＯＮ）对大鼠肝脏星状细胞活化及其胶原生成的作用,作者合成了特异笥的ＴＧＦβ１硫代磷酸ＡＳＯＮ及其对照（正义,错义寡核苷酸）,并将其加入至培养的肝脏星状细胞中。通过细胞免疫化学方法分析α－ＳＭＡ的表达来观察肝脏星状细胞的活化,肝脏星状细胞产生ＴＧＦβ的水平用生物学方法测定,以＾３Ｈ－脯氨酸掺入抑制率的测定观察胶原     

阳离子脂质体介导的TGFβ1反义寡核苷酸对大鼠肝脏星 …

为探讨阳离子脂质体介导的ＴＧＦβ１反义寡核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＡＳＯＮ）对大鼠肝脏星状细胞激活及其胶原生成的作用，作者合成了特异性的针对ＴＧＦβｍＲＮＡ转译超始区的硫代磷酸ＡＳＯＮ及其对照（正义、错义寡核苷酸），并和阳离子脂质体形成复合物。通过测定细胞内＾３２Ｐ标记的ＡＳＯＮ的放射量来观察ＡＳＯＮ的细胞摄入率，用细胞免疫化学分析α－ＳＭＡ的表达来观察星状细胞     

阳离子脂质体介导端粒酶反义寡核苷酸促进对HeLa细胞生长的抑制作用

目的 考察阳离子脂质体(CL)为载体的反义寡核苷酸(ASODN)序列对HeLa细胞的抑制作用.方法 选择以人端粒酶模板RNA(hTR)和人逆转录酶催化亚基(hTERT)为靶点的两种ASODN,用3β[N-(N‘,N‘-二甲氨基乙基)氨甲酰基]-胆固醇(DC-Chol)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)制备CL,考察其形态和粒径分布,并用其介导反义寡核苷酸转染HeLa细胞,通过噻唑蓝比色法(MTT)研究对细胞的抑制作用.结果 CL外观呈圆形,粒径均匀,在体外能够有效转染反义hTR和反义hTERT寡核苷酸序列(anti-hTR,anti-hTERT).CL/ASODN处理后的HeLa细胞,72 h后的存活率为(19.82±12.19)%(antihTR,2.0 μmol·L-1)和(16.59±4.10)%(anti-hTERT,2.0 μmol·L-1),而相同浓度游离的ASODN没有发现抑制作用.CL/ASODN复合物能够在120 h内持续抑制HeLa细胞的生长.结论 CL能够有效提高ASODN对HeLa细胞的抑制作用,作为端粒酶抑制剂的新型非病毒载体,具有良好的应用前景.     

阳离子脂质体介导的反义c-myb寡核苷酸对脑胶质瘤生长的抑制作用研究

目的　观察阳离子脂质体 lipofect AMINE介导的反义 c- myb寡核苷酸 (L ipo AON)对肿瘤生长的影响。方法　取雄性 Wistar大鼠 48只 ,行脑内 C6胶质瘤接种 ,术后 6天 ,将携瘤大鼠随机分成 L ipo AON组、反义 c- myb寡核苷酸组 (AON组 )、阳离子脂质体 lipofect AMINE组 (L ipo组 )和生理盐水对照组 (NS组 ) ,每组各 12只。经大鼠右股静脉给药 ,间隔 1天后 ,再次用同法经大鼠左股静脉等量给药。给药后严密观察各组大鼠饮食、四肢活动及体重变化情况 ,并于给药后第 4天和第 10天每组分别处死 6只大鼠 ,进行肿瘤的生长情况和大体形态学观察。结果　 L ipo AON组在静脉给药期间及停药后的短期内其肿瘤生长被明显抑制 ,c- m yb表达下调 ;而 AON组、L ipo组与 NS组相比 ,其肿瘤生长未见抑制现象 ,c- myb表达亦未见下调。但随着停药时间的延长 ,L ipo AON对肿瘤的抑制作用下降。结论　 1阳离子脂质体 L ipofect AMINE作为 c- m yb AON转移载体 ,使水溶性 c- myb AON容易透过 BBTB进入瘤内发挥治疗作用 ,且具有操作简单、安全、转染率高等特点 ;2 L ipo AON对 C6胶质瘤生长有明显抑制作用 ,用反义技术抑制 c- myb的表达在胶质瘤的治疗中具有研究前景 ;3 L ipo AON对胶质瘤生长的抑制作用随时间延长而下降 ,如何让     

阳离子脂质体对反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒作用的促进

目的 :考察阳离子脂质材料 3β [N (N′,N′ 二甲基胺乙基 )胺基甲酰基 ]胆固醇 (3β [N (N′,N′ dimethylaminoethane) carbamoyl]cholesterol,DC chol)与反义寡核苷酸 (antisenseoligodeoxynucleotide ,asODN)的结合能力及asODN阳离子脂质体的细胞毒性和抗病毒活性。方法 :以DC chol从水相中萃取asODN的萃取率评价不同条件下DC chol与asODN的作用力 ;通过四唑盐比色法检测含DC chol的阳离子脂质体对HepG2 2 .2 .1 5的细胞毒性 ;以酶联免疫法 (ELISA)检测细胞上清培养液中HBsAg和HBeAg的含量 ,考察不同asODN阳离子脂质体的抗病毒活性。结果 :当正负电荷比 >0 .6时 ,DC Chol能有效的从水相中萃取asODN (萃取率 80 %～ 1 0 0 % ) ;碱性条件和强离子 (Na+ /Cl-)的存在不利于DC Chol与asODN的作用 ;DC chol阳离子脂质体具有一定的细胞毒性 ,在低质量浓度时 (0 .84～ 2 6 .94mg·L-1 )脂质体的细胞毒性与DC chol浓度成正比 ;当asODN在 1 .2 5～ 5 .0 0 μmol·L-1时 ,其抗病毒活性与剂量相关 ;脂质体可提高asODN对乙肝病毒的抗病毒活性 ,其中阳离子脂质体对asODN抗病毒活性的促进作用较明显 (从 6 0 %到 95 % )。结论 :表面修饰DC Chol阳离子脂质体能有效地促进asODN的抗乙肝病毒活性。     

阳离子脂质体介导的反应c—myb寡核苷酸对脑胶质瘤生长的抑制作用研究

目的：观察阳离子脂质体lipofectAMINE介导的反义c-myb寡核苷酸（LipoAON)对肿瘤生长的影响。方法：取雄性Wistar大鼠48只，行脑内C6胶质瘤接种，术后6天，将携瘤大鼠随机分成LiPoAON组，反义c-myb寡核苷酸组（AON组），阳离子脂质体lipofectAMINE组（Lipo组）和生理盐水对照组（NS组），每组各12只，经大鼠右股静脉给药，间隔1天后，再次用同法经大鼠左股静脉等量给药，给药后严密观察各组大鼠饮食，四肢活动及体重变化情况，并于给药后第4天和第10天每组分别处死6只大鼠，进行肿瘤的生长情况的大体形态学观察。结果：LipoAON组在静脉给药期间及停药后的短期内其肿瘤生长被明显抑制,c-myb表达下调，而AON组，Lipo组与NS组相比，其肿瘤生长未见抑制现象，c-myb表达亦未见下调，但随着停药时间的延长，LipoAON对肿瘤的抑制作用下降，结论：（1）阳离子脂质体LipofectAMINE作为c-myb AON转移载体，使水溶性c-myb AON容易透过BBTB进入瘤内发挥治疗作用，且具有操作简单，安全，转染率高等特点；（2）LipoAON对C6胶质瘤生长有明显抑制作用，用反义技术抑制c-myb的表达在胶质瘤的治疗中具有研究前景，（3）LipoAON对胶质瘤生长的抑制作用随时间延长而下降，如何让c-myb AON在瘤内高效，持久，稳定地表达和发挥治疗作用，是值得进一步探讨的课题。     

Genistein对大鼠肝脏星状细胞激活的抑制作用

目的：探索酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein对肝脏星状细胞（HSC）激活的抑制作用。方法：采用链霉蛋白酶、胶原酶原位灌注及Nycodenz一步密度梯度主了心法分离大鼠HSC，并进行体外培养使之激活。用四唑盐比色法（MTT法）检测Genistein作用24、48和72小时对HSC增殖的抑制作用；用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察Genistein作用后HSC的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，HSC激活的标志之一）表达的变化。结果：MTT检测显示，10^-5-10^-9mol/L浓度的Genistein作用24、48、和72小时对HSC增殖有抑制作用，并以10^-7mol/L的Genistein作用48小时的抑制作用最明显。LSCM观察显示，10^-6和10^-7mol/L的Genistein作用48小时可使α-SMA表达明显减弱。结论：一定浓度的Genistein能明显抑制HSC的活化和增殖，有可能成为抑制肝纤维化的潜在药物。     

Genistein对大鼠肝脏星状细胞激活的抑制作用

目的　探索酪氨酸蛋白激酶抑制剂 Genistein对肝脏星状细胞 (HSC)激活的抑制作用。方法　采用链霉蛋白酶、胶原酶原位灌注及 Nycodenz一步密度梯度离心法分离大鼠 HSC,并进行体外培养使之激活。用四唑盐比色法 (MTT法 )检测 Genistein作用 2 4、4 8和 72小时对 HSC增殖的抑制作用 ;用激光扫描共聚焦显微镜(L SCM)观察 Genistein作用后 HSC的 α-平滑肌肌动蛋白 (α- SMA,HSC激活的标志之一 )表达的变化。结果　MTT检测显示 ,10 - 5～ 10 - 9mol/ L 浓度的 Genistein作用 2 4、4 8和 72小时对 HSC增殖有抑制作用 ,并以 10 - 7mol/ L 的 Genistein作用 4 8小时的抑制作用最明显。 L SCM观察显示 ,10 - 6和 10 - 7mol/ L 的 Genistein作用 4 8小时可使 α- SMA表达明显减弱。结论　一定浓度的 Genistein能明显抑制 HSC的活化和增殖 ,有可能成为抑制肝纤维化的潜在药物     

反义寡核苷酸抑制TGFβ1诱导人肾小管上皮细胞表达CTGF

目的研究结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,AS)转染人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HKC)后对转化生长因子β1(TGFβ1)诱导CTGF表达的抑制作用.方法采用脂质体转染试剂DOTAP,包裹针对CTGF的反义寡核苷酸转染HKC.用MTT比色法检测DOTAP对细胞增殖的影响,用荧光显微镜和荧光分光光度计检测5′异硫氰酸荧光素(5′FITC)标记的AS在细胞内的分布,用RT-PCR和免疫组化分别检测TGFβ1和AS对CTGFmRNA和蛋白表达的影响.结果MTT比色:不同浓度(0、3.3、6.7、10μl/ml)的DOTAP对细胞增殖的影响无明显差异(P＞0.05).荧光检测:DOTAP能高效地介导AS转染入HKC.RT-PCR和免疫组化:浓度为40μg/ml的TGFβ1能诱导HKC表达CTGFmRNA和蛋白,同时加入DOTAP-AS复合物后(DOTAP浓度为6.7μl/ml,AS浓度为1μg/ml),CTGFmRNA和蛋白的表达明显下降(P＜0.01).结论DOTAP能高效低毒地把CTGF反义寡核苷酸转染入HKC,进而能有效地封闭TGFβ1所诱导的CTGF表达.     

阳离子脂质体介导β干扰素基因转染对人胶质瘤细胞的抑制作用

目的:建立阳离子脂质体载体,介导β干扰素(IFN-β)基因转染人胶质瘤细胞系,观察其生长抑制作用.方法:以反相蒸发法制备含IFN-β的阳离子脂质体载体,转染SK-MG-1胶质瘤细胞系.MTT法观察其生长抑制情况,流式细胞技术检测肿瘤细胞的凋亡.结果:阳离子脂质体介导IFN-β基因转染可抑制SK-MG-1细胞的生长,抑制作用强于IFN-β蛋白.IFN-β蛋白和基因转染可以诱发SK-MG-1细胞的凋亡.结论:阳离子脂质体可作为一种有效的载体应用于胶质瘤的基因治疗中.IFN-β可抑制胶质瘤细胞系SK-MG-1的生长,诱发凋亡.     

阳离子脂质体介导提高反义寡聚脱氧核苷酸转染卵巢癌细胞株SKOV3／mdr1的效率

多药耐药基因（MDRI）编码的P－糖蛋白（Pgp,P-170)是导致卵巢癌化疗失败的重要原因之一。本研究将针对MDR1基因的硫代反义寡聚脱氧核苷酸导入卵巢癌耐药细胞株SKOV3．mdr1,观察其对该细胞株P170表达的影响。反义寡聚脱氧核苷酸（MDR1－AS）通过阳离子脂质体介导或单纯转染的方式导入SKOV3／mdr1细胞,将正义寡聚脱氧核苷酸（MDR1－S）同样导入细胞为对照。经以旨质体介导的1．6μmol/LMDR1-AS转染后,Pgp阳性的细胞百分数从100％降至48．7％,经过16μmol/L和10μmol/L两个浓度的单纯MDR1－AS转当柏,Pgp阳性细胞的百分数也从100％分别降至52．6％和86．7％,因此,通过阳离子脂质体介导可大大提高反义寡核苷酸转染的效率。     

脂质体介导hTERT反义寡核苷酸对HL60细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究经脂质体介导转染端粒酶逆转录酶(hTERT)反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖、凋亡的影响.方法 运用四唑盐比色(MTT)法检测HL-60细胞的增殖、Annexin VFITC/PI双标记法细胞早期凋亡流式检测法检测HL-60细胞的凋亡.结果 hTERT ASODN组(终浓度10 μmol/L)、脂质体介导hTERT ASODN组(终浓度0.5 μmol/L)均能抑制HL60细胞增殖,诱导HL-60细胞凋亡,两组比较差异无显著性.各ASODN组对HL-60的抑制作用及诱导凋亡作用均弱于阿糖胞苷(终浓度10 μmol/L)(P<0.01).结论 脂质体的介导增强了hTERT AS0DN抑制HL-60细胞增殖及诱导凋亡的作用效果.脂质体介导hTERT ASODN有可能成为化疗外治疗急性白血病的有益补充.     

脂质体介导的CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞粘附功能的影响

目的：观察脂质体介导的CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞粘附功能的影响，探讨CD44分子在原发性开角型青光眼(POAG)发病过程中可能的作用。方法：采用硫代修饰的CD44反义寡核苷酸，通过脂质体导人体外培养的人眼小梁细胞，RT—PCR、Western印迹及MTT法观察CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞CD44基因表达及粘附功能的影响。结果：RT—PCR及Western印迹结果提示：CD44反义寡核苷酸抑制人眼小梁细胞CD44表达。MTT法检测显示：CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞与细胞外基质透明质酸的粘附起抑制作用且呈浓度依赖性。结论：CD44反义寡核苷酸抑制人眼小梁细胞与细胞外基质透明质酸的粘附，粘附分子CD44可能参与了POAG发病过程。     

磷酸胆碱聚合物载TGF—β1反义寡核苷酸转染血管外膜成纤维细胞对TGF—β1的影响

目的观察新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70能否有效地转染针对转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的反义寡核苷酸（AS—ODN）进入到血管外膜成纤维细胞中及转染后对血管外膜成纤维细胞内TGF-β1表达的影响,为MPC30-DEA70,聚合物作为药物基因治疗载体在心血管疾病中的运用奠定基础。方法组织贴块法培养大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞;应用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察MPC30-DEA70／TGF-β1AS-ODN（FAM标记）在细胞内的分布和定位;流式细胞仪（FCM）检测二者的细胞转染效率、荧光强度;免疫印迹实验（Western blot）检测TGF-β1细胞内表达。结果①原代培养的细胞呈纺锤形,多角形或者不规则形,细胞核较大,数量1～2个不等,轮廓清楚,核仁大而明显,呈椭圆形;②激光共聚焦显微镜观察到FAM标记的基因复合物多数分布在细胞核周围;③流式结果显示转染效率及荧光强度随N／P比增加而明显增大;④Western blot结果显示随着N／P比值的增大,TGF-β1的蛋白表达明显下降（P〈0．05）。结论MPC30-DEA70,能够携带TGF-β1-AS—ODN进入离体培养的大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞,并能下调TGF—β1蛋白的表达。     

脂质体介导的c-myc反义硫代寡核苷酸诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的　探讨c myc反义硫代寡核苷酸 (antisensephosphorothioateoligodeoxynucleotide ,APSODN)对胃癌SGC 790 1细胞凋亡的影响。方法　人工合成c mycAPSODN ,通过脂质体转染法处理人胃癌细胞系SGC 790 1后 ,于不同时间收集细胞 ,采用Northernblot、Westernblot检测c myc基因mRNA及蛋白表达 ,采用TUNEL方法检测凋亡指数 ,以流式细胞仪检测细胞周期。结果　TUNEL显示c mycAPSODN可诱导胃癌SGC 790 1细胞凋亡 ,并与APSODN的浓度和处理时间有关。流式细胞仪检测显示细胞阻滞于G0 /G1期。结论　c mycAP SODN可诱导胃癌细胞凋亡。     

反义核酸抑制TGF—β1表达及对肝纤维化调节的研究

反义核酸抑制ＴＧＦ┐β１表达及对肝纤维化调节的研究博士生论文摘要ＳｔｕｄｙｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＴＧＦ┐β１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏ┐ｇｅｎｅｓｉｓｂｙａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ梁志清何振平...     

β1肾上腺素能受体反义寡核苷酸对高血压大鼠主动脉的保护作用

目的比较以阳离子脂质体载体（DOTAP/cholesterol）介导的β1肾上腺素能受体反义寡核苷酸（β1-ASODN）与卡维地洛（Carvedilol）对核因子κB（NF-κB）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）在自发性高血压大鼠（SHR）大血管中表达的影响,探讨其对血管的保护机制。方法18只雄性12周龄SHR随机分为反义（ASODN）组（n=6,尾静脉注射β1-ASODN1.0mg/kg每2周一次,共4次）;反向（INODN）组（n=6,尾静脉注射β1-INODN1.0mg/kg,每2周一次,共4次）,Carvedilol组（n=6,30mg/（kg.d）,灌喂8周）。用免疫组化测各组主动脉NF-κB、MCP-1的表达,ELISA法测血清MCP-1含量。结果8周后,INODN组与ASODN组和Carvedilol组比较,血压均有明显差异（P〈0.01）,NF-κB、MCP-1表达和血清MCP-1含量增加（P〈0.01）。ASODN组与Carvedilol组之间血压无明显差异（P〉0.05）,主动脉组织中NF-κB、MCP-1表达和血清MCP-1含量两组之间无明显差异（P〉0.05）。结论β1-ASODN具有持久的降压作用,并具有降压外对高血压大鼠主动脉的保护作用。     

脂质体包裹DNMT1反义寡核苷酸诱导白血病细胞株孕酮受体去甲基化的实验研究

目的研究脂质体包裹DNA甲基转移酶(DNMT1)反义寡核苷酸转染对白血病细胞株孕酮受体(Progesterone Receptor，PR)启动子甲基化及表达的影响，探讨甲基化基因治疗的新途径。方法人工合成的DNMT1反义寡核苷酸MG88用脂质体包裹后转染白血病细胞株，用RT-PCR检测DNMT1、PRBmRNA表达的变化以及用MSP分析PRA、PRB甲基化状态的改变。结果用MG88转染白血病细胞株后，DNMT1 mRNA显著下降；PRA、PRB启动子出现脱甲基化，PRB mRNA表达显著上升。结论DNMT1反义寡核苷酸MC88可以诱导白血病细胞PR脱甲基化，使PRB mRNA表达升高，为DNA甲基化基因治疗的实验性研究提供了可能。     

β1整合素反义寡核苷酸对人结肠癌细胞黏附和侵袭抑制作用

目的 研究β1整合素反义寡核苷酸(ASODN)对人结肠癌HT-29细胞侵袭的抑制作用.方法 以脂质体为载体将硫代磷酸修饰的β1整合素ASODN及无义寡核苷酸(NSODN)转染人结肠癌HT-29细胞,通过RT-PCR及Western-Blot试验,分别测定ASODN组、NSODN组和空白对照组β1整合素mRNA和蛋白的表达,MTT法和Transwell小室法分别测定其黏附力和侵袭力.结果 与NSODN组和空白对照组相比较,ASODN 组中β1整合素 mRNA 和蛋白表达强度明显降低;ASODN组和NSODN组转染的人结肠癌HT-29细胞侵袭力均下降,但前者下降较为明显.结论β1整合素ASODN转染HT-29细胞后,通过降低其β1整合素mRNA和蛋白表达水平,从而抑制其对细胞外基质的侵袭.