自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血性疾病14例

背景：血管病变引起的肢体缺血性疾病不仅仅是肢体动脉主干发生病变,还常常伴有微循环障碍,通常所采用的动脉搭桥或动静脉转流术只能解决主干动脉阻塞,不能改善微循环障碍,因而其临床效果并不十分理想。近年来,基于内皮祖细胞的自体外周血干细胞移植已成为治疗此类疾病的新方法。 目的：观察自体外周血干细胞移植对下肢缺血性疾病的治疗效果。 方法：选择2004-09/2006-07在泸州医学院附属医院住院经下肢血管造影确诊的下肢动脉症闭塞患者14例,共23条患肢,临床表现为患肢痛,冷感,间歇性跛行,皮温降低,足背动脉搏动减弱或消失,皮色发生变化及皮肤溃疡,严重者趾或足坏死破溃。采用血细胞分离机采集自身外周血单个核细胞制成干细胞混悬液,于患肢一次性按4 cm ×4 cm间距做干细胞混悬液肌肉注射,每点注射1 mL,沿缺血下肢动脉走行采取多点肌肉注射。12个月后对移植前后临床症状主观指标和辅助检查客观指标进行评估。 结果与结论：自体外周血干细胞移植后12个月患者肢体疼痛、患肢冷感明显减轻,皮肤温度升高,间歇跛行距离延长。5例缺血性足溃疡患者的足部创面基本愈合。9例实施了下肢血管造影检查,其中7条患肢侧支血管丰富。未见骨髓动员并发症,1例患者发生外周血单个核细胞移植并发症,患肢移植部位剧烈疼痛,所有疼痛均于移植后第3天缓解。提示自体外周血干细胞移植对于下肢缺血性疾病是一种安全、可行、可选择的治疗方式。     

骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨

背景：骨髓间充质干细胞在不同诱导条件下具有向中胚层组织细胞如成骨细胞、成软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞等分化的能力。 目的：验证用组织工程方法诱导分化骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨损伤的效果。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2005-05-03/2007-12-30在沈阳医学院临床中心实验室完成。 材料：20只两三月龄的健康新西兰白兔,雌雄不限。 方法：①诱导分化体外培养的兔骨髓间充质干细胞。实验组加入地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C培养1周,再将转化生长因子β替换碱性成纤维细胞生长因子培养3周;以不加诱导剂细胞做对照。②取20只兔,建立膝关节软骨缺损模型,随机分为3组。实验组10只膝关节内植入经诱导的骨髓间充质干细胞;对照组植入未经诱导的骨髓间充质干细胞;空白对照组植入生理盐水。分别于术后2,4,6,8周时处死实验组处死2只,对照组和空白对照组各处死1只进行各项指标检测。 主要观察指标：①细胞形态学。②碱性磷酸酶活性的测定。③大体标本观察。④X射线观察。⑤组织切片观察。 结果：①经诱导的骨髓间充质干细胞,细胞形态发生明显变化,逐渐由长梭形变为多角形,类似于软骨细胞样形态。②骨髓间充质干细胞经诱导4周后,其碱性磷酸酶活性明显增强(P < 0.05)。③术后8周,实验组标本修复组织表面光滑,与周围软骨间界限模糊不清;X射线表现为关节间隙变宽,软骨下骨质囊变得到改善;组织切片观察显示与正常软骨细胞基本上一致。 结论：自体间充质干细胞移植可修复关节软骨损伤。     

无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复坐骨神经缺损

背景：作者前期已经成功将无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经,并证明可以促进周围神经再生。 目的：构建组织工程人工神经,观察和验证桥接大鼠坐骨神经缺损后的神经功能恢复情况。 方法：成年雄性SD大鼠60只构建大鼠坐骨神经15 mm缺损模型。随机分成3组,每组20只。桥接大鼠坐骨神经缺损,实验组采用组织工程人工神经,空白对照组采用无细胞组织工程神经支架,自体神经对照组采用自体神经移植。桥接后12周通过大体观察、胫骨前肌湿质量、组织学等方法分析坐骨神经组织学及功能恢复情况。 结果与结论：桥接术后12周：实验组大鼠肢体可以支撑着地,钳夹大鼠手术侧足底皮肤出现逃避反射,足底皮肤s-100蛋白染色呈阳性反应。实验组与自体神经移植组胫骨前肌湿质量比差异无显著性意义(P > 0.05)。实验组辣根过氧化物酶逆行示踪实验显示脊髓、后根神经节均可见数量不等的辣根过氧化物酶标记阳性细胞。实验组移植物与自体神经移植组有髓神经纤维数、髓鞘厚度、神经组织面积比较差异无显著性意义。实验结果验证了无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复大鼠坐骨神经缺损,可以促进神经组织学的修复重建和功能的恢复。     

羟基磷灰石/聚氨酯复合骨诱导再生膜的细胞相容性及自身降解性能*☆

目的：骨诱导再生膜材料对骨组织损伤后的重建和再生起着屏蔽和诱导的作用。拟进一步验证羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）/聚氨酯（Polyurethane，PU）复合骨诱导再生膜体内外的细胞相容性和降解性能。 方法：实验于2007-03/07在四川大学华西口腔医学国家重点实验室及四川大学纳米生物材料研究中心完成。①HA/PU复合膜制备成10 mm×10 mm大小，选择成熟的成骨细胞株MG63，体外细胞培养，在1，4，7 d内观察细胞在膜上的生长和增殖情况，并采用MTT法测定细胞的增殖率，判断其细胞的毒性。②把HA/PU复合膜制备成直径1.5 mm大小，选择健康的SD雌性大鼠3只，在脊柱一侧肌肉内埋植HA/PU复合膜，在1，4，12周后取出。以苏木精-伊红染色和Masson染色，组织切片观察材料的细胞相容性和自身降解性。 结果：①HA/PU复合膜上细胞增殖良好，无坏死和悬浮细胞出现，细胞在膜上的增殖能力均高于MG63的增殖能力（P < 0.05），细胞毒性为0级。②组织学切片观察，1~4周时材料在体内依旧是有形固体，材料被周围组织包裹，有巨噬细胞聚集，未见多核细胞，胶原纤维逐渐变得致密。12周时，材料发生降解，有纤维组织长入，周围与组织结合良好，未见有炎症发生。 结论：HA/PU复合膜具有良好的细胞相容性和自身降解性能，可作为骨组织诱导再生膜材料。     

表皮生长因子干预小鼠非黏附骨髓间充质干细胞成纤维细胞集落形成及向神经元样细胞的分化**

背景：非黏附骨髓间充质干细胞在体外可以不断形成成纤维细胞集落形成单位，并且可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞，表现出一定的多分化潜能。 目的：探讨表皮生长因子对非黏附骨髓间充质干细胞形成成纤维细胞集落的影响，及其在体外向神经细胞分化的能力。 方法：分离小鼠双侧股骨、胫骨，全骨髓法分离总骨髓细胞，采用反复转移非黏附的骨髓细胞培养法纯化非黏附骨髓间充质干细胞。取第5代总骨髓细胞和非黏附骨髓间充质干细胞，加入含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的神经细胞诱导液培养2周。观察非黏附骨髓细胞产生成纤维细胞集落形成单位的能力，表皮生长因子对成纤维细胞集落形成单位的影响，甲苯胺蓝和免疫细胞化学染色鉴定相关蛋白的表达。 结果与结论：总骨髓细胞、反复转移的非黏附骨髓间充质干细胞均能够不断产生成纤维细胞集落形成单位。给予表皮生长因子处理后，非黏附骨髓间充质干细胞成纤维细胞集落形成单位的效率明显增高。诱导2周后，免疫细胞化学染色显示，总骨髓细胞和非黏附骨髓间充质干细胞均表达神经细胞特异性蛋白NeuN和NF-200；经甲苯胺蓝染色在部分细胞中可见神经元特异性标记尼氏体。证实表皮生长因子可有效促进小鼠非黏附骨髓间充质干细胞形成成纤维细胞集落形成单位的效率，经反复转移的非黏附骨髓间充质干细胞能够诱导分化为神经细胞。     

胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植对宿主肝功能的影响及安全性评估**☆

背景：体外诱导胚胎干细胞分化为肝细胞已有不少成功的报道，但其体内移植后能否有效整合入宿主肝板、在肝内能否进一步生长分化并表达肝细胞功能以及成瘤的风险等情况目前还不清楚。 目的：应用治疗性肝再生模型进行胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植, 观察其在肝组织替代、体内的生长分化及成瘤性情况。 设计：随机对照动物实验。 单位：中山大学附属第二医院小儿外科。 材料：选用BALB/c小鼠24只为受体，鼠龄6~8周，体质量20~ 35 g，雌雄不拘购自广州市实验动物中心。实验所用胚胎干细胞源性肝干细胞由作者所在课题组诱导胚胎干细胞分化而成。小鼠胚胎干细胞株E14由本院干细胞中心提供。 方法：实验于2006-07/2007-06在中山大学附属第二医院干细胞研究中心完成。将24只小鼠随机分为2组：肝再生模型+干细胞移植组和肝切除+干细胞移植组，每组12只。前组分两次按50 mg/kg剂量腹腔内注射倒千里光碱(retrorsine) ，间隔2周，第2次注射4周后行70%肝部分切除制造肝损伤；然后经门静脉分别移植1×105羟基荧光素乙酰乙酸（CFDA-SE）荧光标记的细胞入小鼠肝内进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植。后组在行70%肝部分切除制造肝损伤模型后进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植。 主要观察指标：荧光显微镜下观察移植细胞组受体鼠肝脏内分布、整合与体内生长分化情况。2周后行白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)、血清白蛋白水平检测其功能状况。将胚胎干细胞源性肝干细胞注入治疗性肝再生小鼠肝内，将未分化的胚胎干细胞移植入小鼠腋区皮下作为对照，观察胚胎干细胞源性肝干细胞体内成瘤情况。 结果：①肝干细胞在受体鼠肝内生长情况：CFDA SE标记的胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植1周，受体小鼠肝实质内可见散在绿色荧光分布。2周后，肝实质内绿色荧光分布区域明显扩大，且可见类似肝索样结构排列。②肝功能：共焦白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)结果表明，受体小鼠肝组织内可见标记细胞表达白蛋白阳性信号（呈黄色荧光），肝再生模型+干细胞移植组和肝切除+干细胞移植组血清白蛋白水平则无明显差异（P > 0.05）。③肝干细胞移植安全性：6周内未见畸胎瘤形成，而将未分化的胚胎干细胞移植入小鼠腋区皮下6周后则可见畸胎瘤形成。 结论：胚胎干细胞源性肝干细胞移植入治疗性肝再生模型小鼠肝内后可有效在肝内能进一步生长分化并部分表达肝细胞功能；且此移植安全性较好。     

无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞修复大鼠坐骨神经缺损

背景：作者前期试验已成功制备了天然可生物降解的无细胞神经移植物并证明其可促进周围神经再生。 目的：无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经并观察其修复大鼠坐骨神经缺损促进运动功能恢复的效果。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2008-06/2009-02在辽宁医学院附属第一医院医学组织工程实验室完成。 材料：180~200 g成年健康雄性Wistar大鼠，用于制备无细胞神经移植物，100~120 g成年健康雄性Wistar大鼠，用于制备骨髓间充质干细胞，将骨髓间充质干细胞植入并与无细胞神经支架联合培养构建组织工程人工神经。 方法：180~200 g成年健康雄性SD大鼠60只构建坐骨神经15 mm缺损模型，随机分成3组，每组20只。①实验组采用组织工程人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损。②空白对照组采用组织工程神经支架桥接大鼠坐骨神经缺损。③自体神经对照组采用自体神经移植桥接大鼠坐骨神经缺损。 主要观察指标：术后12周通过大体观察、电生理检测、组织学和小腿三头肌湿质量等方法分析评价运动功能恢复情况。 结果：①术后12周，实验组大鼠手术侧足趾可以分开，并且可以支撑着地；实验组大鼠再生神经传导速度与自体神经对照组相比，差异无显著性意义。②术后12周，实验组组织化学染色可见腓肠肌内有呈AchE阳性的运动终板整齐地排列于腓肠肌的中上部形成终板带，经结合镀银染色后可见再生的神经束及发出的分支与运动终板相连。③实验组与自体神经对照组胫骨前肌湿质量比差异无显著性意义。 结论：无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞桥接大鼠坐骨神经缺损具有促进其运动功能恢复的作用。     

短期免疫抑制同种异体肢体移植大鼠周围神经的损伤与再生

背景：肢体移植后肢体生存时间的延长和移植后肢体功能的恢复是关系到肢体同种异体移植能否在临床广泛开展的决定性因素。 目的：观察短期免疫抑制治疗对肢体移植后神经再生和功能恢复的影响。 方法：将30只SD大鼠随机分为3组。短期组：肢体移植后应用免疫抑制剂14 d；长期组：肢体移植后长期应用免疫抑制剂直到取材。对照组单纯肢体移植组术后腹腔内注射生理盐水。术后采用足迹分析、免疫组织化学对组织形态观察评价神经再生和功能恢复的情况。 结果与结论：短期组与长期组的功能恢复无明显差别(P > 0.05)，均明显优于对照组(P < 0.05)。组织形态观察显示短期组神经功能恢复优于对照组(P < 0.05)，短期组与长期组神经纤维再生差异无显著性意义。长期组有3只大鼠因为免疫抑制剂影响导致死亡，对照组与短期组均没有动物模型死亡现象。结果提示，短期应用免疫抑制治疗可迅速减轻周围神经损伤后发生的免疫排斥反应，从而快速改善周围神经损伤后再生的微环境，提高神经的再生速度和质量，取得了与长期应用免疫抑制剂同样的效果而没有致命的不良反应，对于临床应用免疫抑制剂有潜在的意义。 关键词：肢体移植；环磷酰胺；功能恢复；神经再生；大鼠     

引导骨组织再生技术结合碱性成纤维细胞生长因子和骨保护素修复犬牙槽骨缺损

背景：多种生长因子能有效促进牙周组织再生。 目的：观察骨保护素和碱性成纤维细胞生长因子对牙槽骨骨缺损的修复作用。 方法：在4只杂种犬下颌两侧的第3，4前磨牙根分叉区造牙槽骨缺损，每只犬的一侧为实验组，另一侧为对照组。实验组置胶原膜并于缺损部位牙龈注射携带骨保护素和碱性成纤维细胞生长因子基因的重组腺病毒，对照组仅注射重组腺病毒或不做处理。 结果与结论：缺损修复4周后，实验组和对照组在X射线和组织学等方面差异不显著。12周后，实验组X射线可见骨缺损区新生骨量明显增加，组织学见新生牙槽骨已充满根分叉区，骨小梁致密；对照组X射线可见骨缺损区新生骨量增加，但未达到根分叉顶，组织学见骨缺损区有大量新生牙槽骨但未充满根分叉区。说明引导骨组织再生技术结合骨保护素和碱性成纤维细胞生长因子可促进犬牙槽骨缺损的修复。     

外周血干细胞与组织工程骨复合移植修复犬牙周骨缺损过程中转化生长因子β的表达*

背景：外周血干细胞是一类具有多分化潜能的前体细胞,有分化为成骨的潜能,组织工程骨作为细胞移植的载体,与受体组织和种子细胞有良好的相容性。转化生长因子β是骨缺损修复的重要调节因子，有诱导外周血干细胞分化增殖为成骨细胞的作用。 目的：观察外周血干细胞与组织工程骨复合移植修复牙周骨缺损中转化生长因子β的表达。 设计：以细胞为对象的观察实验。 单位：西安交通大学口腔医院。 材料：实验于2003/2006年在西安交通大学口腔医院完成。实验动物由西安交通大学医学院（原西安医科大学）动物试验中心提供。实验动物均采用氯胺酮肌肉诱导后,肌内注射速眠新麻醉后进行手术或处死取材，对动物处置符合动物伦理学标准。 方法：抽取犬外周血干细胞，制成细胞悬液备用。取健康仔猪髂骨制作脱钙脱蛋白生物组织工程骨,浸入犬外周血干细胞细胞悬液中备用。将10 只健康杂种犬分成实验组和对照组,每组5 只。自犬下颌左右侧尖牙之间沿唇侧牙龈沟处达牙槽嵴,再转向双侧前庭沟切开,形成一个梯形瓣，向下翻瓣暴露唇侧骨板，在下颌侧切牙之间用涡轮钻制备 2 cm×2 cm×1 cm 的骨缺损区,实验组植入外周血干细胞-组织工程骨，对照组不移植外周血干细胞,仅移植组织工程骨。术后2，3，4，8，12周采用免疫组织化学方法观察外周血干细胞分化增殖成为成骨细胞过程中转化生长因子β的表达。 主要观察指标：①光镜和透射电镜观察外周血干细胞转化成为成骨细胞的形态学变化和细胞器的结构功能。②免疫组织化学方法测量外周血干细胞在转化成为成骨细胞的过程中转化生长因子β的表达。 结果：实验组在外周血干细胞-组织工程骨移植后2 周,即见骨缺损区边缘转化生长因子β呈弱阳性表达,4~8 周骨缺损区中心区域可见大量的成骨细胞、成纤维细胞和胶原纤维呈现强阳性表达,12 周骨缺损区已完全修复。对照组组织工程骨移植后8~12 周,仅在骨缺损边缘区域呈转化生长因子β弱阳性表达。 结论：当用外周血干细胞和组织工程修复犬牙周骨缺损时，转化生长因子β能诱导外周血干细胞分化和增殖为成骨细胞。     

深低温冻储同种异体气管移植并骨髓间充质干细胞移植后气管上皮细胞血管内皮生长因子的表达

背景：深低温冷冻后的组织可以保持其原有的活力和组织完整性，并能消减抗原性。 目的：静脉移植骨髓间充质干细胞合并深低温处理供体气管后进行同种异体气管移植，观察骨髓间充质干细胞在促进上皮再生和再血管化后的作用。 方法：用深低温冻储2 周和6 周的气管进行Wistar大鼠同种异体气管移植后，用PKH-26标记的3~5代骨髓间充质干细胞经鼠尾静脉移植入受体内，等量的磷酸盐缓冲液注射作为实验对照。观察供体气管的组织学和血管内皮生长因子蛋白表达。 结果和结论：骨髓间充质干细胞移植合并深低温冻储后的移植气管结构完整，软骨无变性坏死；深低温6 周的移植气管上皮再生情况优于2 周。骨髓间充质干细胞移植组的上皮细胞表达血管内皮生长因子水平高于磷酸盐缓冲液对照组。结果提示，骨髓间充质干细胞移植合并深低温冻储6 周后移植气管存活期好于深低温冻储2周；骨髓间充质干细胞能够促进移植物周围新生血管的增加，从而促进气管损伤的修复。     

神经生长因子对合并神经损伤胫骨骨折早期愈合的影响

背景：正常骨组织和骨痂中有神经生长因子及其受体的表达,同时局部给予外源性神经生长因子对骨折愈合有促进作用，周围神经损伤后的骨折，骨痂质量受明显影响。 目的：验证周围神经损伤后局部应用神经生长因子对骨折早期愈合的影响。 设计、时间及地点：随机分组设计，对照动物实验，于2007-05/11在解放军济南军区总医院动物实验中心完成。 材料：选用健康雄性Wistar大白鼠48只，体质量(220±20) g；神经生长因子注射液，厦门北大之路生物工程有限公司生产，批号20070502。 方法：Wistar大白鼠48只分成4组，每组24肢体。①盐水组：胫骨骨折+盐水注射。②神经损伤盐水组：神经损伤+胫骨骨折+盐水注射。③神经生长因子组：胫骨骨折＋神经生长因子注射。④神经损伤神经生长因子组：神经损伤+胫骨骨折+神经生长因子注射。先行测量胫骨中点处周径，然后在胫骨上段前侧楔形开槽,再于腹股沟韧带水平切除股神经约10 mm。对侧作胫骨开槽，暴露但不切除神经。股神经切除侧同时行坐骨神经切除约10 mm，对侧作切口暴露。术后盐水组和神经损伤盐水组肌注生理盐水，每侧肢体0.1 mL/d；神经生长因子组和神经损伤神经生长因子组肌注神经生长因子，每侧肢体0.1 mL (0.2 U)/d。 主要观察指标：术后2周、4周测量小腿周径、X射线线摄片、标本湿质量、骨痂计量学观察。 结果：①神经损伤侧小腿萎缩明显，神经生长因子促进肌肉恢复。②神经损伤侧标本湿质量及骨痂量较对侧多。③2周及4周时，神经损伤盐水组、神经损伤神经生长因子组骨痂均较对侧多，但类骨质多,缺乏正常骨小梁结构。神经生长因子组、神经损伤神经生长因子组骨痂相对少而质密，骨小梁排列规则。 结论：伴有或不伴有神经损伤的骨折，局部注射神经生长因子都可抑制破骨细胞活动，使成骨能力增强，促进骨折愈合。     

自体外周血及骨髓干细胞移植治疗糖尿病下肢动脉闭塞：随机对照

目的：观察自体外周血干细胞和骨髓干细胞联合移植治疗糖尿病下肢闭塞症的临床疗效。 方法：选择2003-09/2007-01河南省人民医院二内内分泌科194例糖尿病下肢闭塞症患者，随机分为对照组（n=95）和干细胞移植组（n=99）,2组均接受内科综合治疗，在此基础上对干细胞移植组进行干细胞移植，95例患者双侧肢体行自体干细胞移植，3例仅缺血较重的一侧肢体行自体干细胞移植，1例因一侧肢体截肢，另一侧行肢体干细胞移植，干细胞移植的肢体为194条，患者对治疗知情同意，并经医院伦理委员会批准。对干细胞移植组患者进行外周血干细胞动员，每天给予人重组粒细胞集落刺激因子450~600 u，皮下注射，第5天局部麻醉下从髂骨处抽取自体骨髓血200 mL，在实验室将骨髓沉淀、离心，分离等处理后制备40 mL干细胞悬浊液备用。第6 天应用COBE6.1血细胞分离机单采单个核细胞，总量60~120 mL。将两种干细胞悬液按3cmx3cm距离进行缺血肢体移植术，移植后2周观察症状、体征改变。 结果：①干细胞移植组疼痛症状明显缓解、好转、无效的肢体分别为94个、 96个、4个，对照组分别7个、156个、27个，2组间显效率及无效率差异显著（P < 0.01）。②干细胞移植组冷感明显缓解、好转、无效的肢体分别为126个、 63个、5个，对照组分别为6个、158个、26个，2组间显效率及无效率差异显著（P < 0.01）。③干细胞移植组间歇性跛行明显缓解、好转、无效的肢体分别为138个、 47个、9个，对照组分别为13个、152个、25个，2组间显效率及无效率差异显著（P < 0.01）。所有患者未出现并发症和不良反应。 结论：自体外周血干细胞移植治疗糖尿病足是一种简便、安全、有效的治疗方法。     

兔自体脂肪干细胞成骨诱导后经皮注射修复骨缺损★

目的：探索兔自体脂肪干细胞、成骨诱导后的脂肪干细胞联合骨形态发生蛋白-2/纤维蛋白胶（bone morphogenetic protein-2/ Fibrin glue，BMP-2/ FG）经皮移植到骨缺损后体内成骨能力的差异。 方法：实验于2006-08/2007-11在北京军区总医院全军骨科研究所完成。①实验材料：清洁级日本大耳白兔，2.0~2.5 kg,雌雄不限，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：制作新西兰大白兔桡骨中段15 mm骨缺损模型35侧，随机分为5组，每组7侧：未诱导细胞组、诱导细胞组、未诱导细胞+BMP-2/FG组、诱导细胞+ BMP-2/FG组、空白对照组。未诱导细胞组、诱导细胞组直接用生理盐水重悬未诱导脂肪干细胞和经成骨诱导的脂肪干细胞，未诱导细胞+BMP-2/FG、诱导细胞+ BMP-2/FG组分别用含20 g/L 骨形态发生蛋白-2、5 g/L纤维蛋白原的生理盐水重悬未诱导和经成骨诱导的脂肪干细胞。③实验评估: X射线片观察各组骨缺损修复情况，并进行生物力学检测。 结果：①12周时，未诱导细胞+BMP-2/FG组、诱导细胞+ BMP-2/FG组在骨缺损区新生骨的数量明显优于未诱导细胞组、诱导细胞组(P均 < 0.05)。②术后4周X射线显示，未诱导细胞+BMP-2/FG组、诱导细胞+ BMP-2/FG组阻射密度值高于其他组(P均 < 0.05)，未诱导细胞组与诱导细胞组无差别。术后8，12周时，诱导细胞组高于未诱导细胞组，未诱导细胞+BMP-2/FG、诱导细胞+ BMP-2/FG组均高于其他组，诱导细胞+ BMP-2/FG组高于未诱导细胞+BMP-2/FG组(P均 < 0.05)。③生物力学检测显示，未诱导细胞+BMP-2/FG组、诱导细胞+ BMP-2/FG组桡骨标本的四点弯曲断裂载荷均明显高于其他组，并且诱导细胞+ BMP-2/FG组高于未诱导细 胞+BMP-2/FG组(P均 < 0.05)。未诱导细胞组与诱导细胞组无差别。 结论: 成骨诱导脂肪干细胞及联合BMP-2/FG移植后8周和12周时具有更强的成骨能力，可作为种子细胞应用于骨组织工程。     

骨形态发生蛋白2基因复合纤维蛋白凝胶/ 聚乳酸-聚己内酯双相支架修复节段性骨缺损★

背景：骨形态发生蛋白2基因转染骨髓基质干细胞后，可促进其增殖分化并诱导异位骨形成。但这种方法操作复杂，体外细胞扩增需时较长，不便于临床应用。 目的：将人工骨经骨形态发生蛋白2腺病毒载体与纤维蛋白凝胶和聚乳酸/聚己内酯处理，移植修复骨缺损。 设计：随机对照动物实验。 单位：实验于2003-09/2004-12在吉林大学中日联谊医院中心实验室完成。 材料：聚乳酸/聚己内酯生物可降解材料块由中国科学院长春应用化学研究所提供，孔隙直径150~250 μm，孔隙率90%以上；实验动物为3月龄新西兰大耳白兔60只。 方法：于新西兰大耳白兔双侧桡骨中段造成1.5 cm骨缺损，分别植入4种经不同方法处理的人工骨：①Ad-BMP-2组：骨形态发生蛋白2腺病毒载体＋纤维蛋白凝胶＋聚乳酸/聚己内酯。②重组BMP-2组：重组骨形态发生蛋白2＋纤维蛋白凝胶＋聚乳酸/聚己内酯；③对照基因组：β-半乳糖酐酶基因腺病毒载体＋纤维蛋白凝胶＋聚乳酸/聚己内酯。④PLA/PCL组：纤维蛋白凝胶＋聚乳酸/ 聚己内酯。 主要观察指标：术后4，8，12组周摄双侧前肢正位X射线片测定骨痂灰度（代表新骨密度）；苏木精-伊红染色观察骨缺损修复情况，爱辛蓝和Vankossa染色观察软骨形成及矿化；电镜观察骨细胞成熟、支架降解吸收情况；术后12周行生物力学检测评价新骨抗弯强度。 结果：术后12周Ad-BMP-2组缺损区在成骨活跃程度、骨再生量和再生髓腔结构等方面均显著优于重组BMP-2组，其骨缺损得到了较彻底的修复。对照基因组和PLA/PCL组均不能产生骨性愈合。 结论：聚乳酸/聚己内酯协同纤维蛋白凝胶运载骨形态发生蛋白2基因修复节段性骨缺损可达到较好的效果。     

胶原膜引导下同种骨颗粒修复兔桡骨节段性缺损

背景：胶原膜是一种可吸收引导成骨材料,同种异体骨是较为理想的骨替代材料,但单独应用均有其不足,拟将两种材料结合使用以期达到理想效果。 目的：利用膜引导组织再生技术,观察胶原膜复合同种骨颗粒修复兔桡骨节段性骨缺损的成骨速度和质量,并与单纯胶原膜进行比较。 设计、时间及地点：同体对照观察实验,于2004-09/2005-02在中国辐射防护研究院医用组织库中心实验室完成。 材料：胶原膜规格20 mm×20 mm,由北京天新福医疗器材有限公司提供。同种异体骨颗粒按美国组织库标准制备,直径0.2~0.7 mm,由山西省医用组织库提供。 方法：健康成年新西兰大白兔40只,制备双侧15 mm桡骨缺损模型,采用同体对照方法,实验侧（左侧）缺损区移植胶原膜及同种骨粒,对照侧（右侧）仅移植胶原膜。 主要观察指标：光镜组织学观察骨缺损愈合情况,计算机图像分析仪计算骨小梁的成骨面积,扫描电镜观察缺损再生修复情况。 结果：①光镜组织学变化：实验侧新骨增生明显,迅速,以膜性化骨及软骨内化骨的方式由骨缺损周围向中央成骨或以同种骨粒为中心由周围向骨粒内成骨,最后骨膜形成,新髓腔不断扩大、再通,骨重建顺利,缺损修复完成。对照侧成骨方式以软骨化骨为主,新骨形成较同期实验侧慢,新骨成熟度不如实验组。②成骨面积图像分析：结果显示术后2,4,8周新生骨小梁成骨面积均大于同期对照侧（P < 0.05）。③扫描电镜观察：术后8周实验侧有较多分泌胶原的成骨细胞和带有较多突起的骨细胞,钙盐沉积,骨质排列开始有序。对照侧软骨与类骨质互相存在,低倍下骨基质排列无序,胶原纤维编织样排列。术后12周实验侧骨质排列有序,胶原粗大排列整齐,大量骨细胞方向有序,大量钙盐沉积,可见哈佛氏管和血管。对照侧骨质排列有序,但胶原纤维较细、基质钙化程度不如实验侧。 结论：两种方法均能成骨修复缺损,但胶原膜复合同种异体骨粒组成骨速度快,且成骨质量优于单纯胶原膜组。     

人骨形态发生蛋白2基因活化纳米骨浆的成骨能力***☆

背景：纳米骨浆在骨缺损修复过程中仅起支架和骨传导作用，不具备骨诱导能力。 目的：观察人骨形态发生蛋白2(human bone morphogenetic protein -2，hBMP-2)基因活化纳米骨浆的异位诱导成骨能力和修复骨缺损效果。 时间及地点：实验于2006-06/2007-03在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室和协和医院骨科实验室完成。 材料：将纳米骨浆与hBMP-2基因真核表达质粒相复合，形成hBMP-2基因局部释放系统。 方法：实验一：昆明种小鼠24只右侧大腿后群肌袋注射纳米骨浆+hBMP-2质粒作为实验侧，其中12只小鼠左侧大腿后群肌袋注射纳米骨浆+空白质粒为对照侧1，另12只左侧注射纳米骨浆为对照侧2。实验二：新西兰白兔54只，其中6只作左桡骨中段骨缺损，不植入材料，为空白对照；另48只制成双侧桡骨中段15 mm骨缺损模型，随机分成3组，缺损处分别植入 hBMP-2+纳米骨浆、空白质粒+纳米骨浆、纳米骨。 主要观察指标：实验一：采用放射学、分子生物学和组织形态学等方法检测成骨基因hBMP-2表达和诱导成骨效应。②实验二：取桡骨标本作影像学检查、组织学观察和生物力学检测。 结果：实验一：小鼠术后2，4周实验侧有hBMP-2表达。实验侧术后2周出现大量软骨组织和呈岛状散在分布的骨组织，术后4周可见大量成骨组织，新生骨相互融合生长并形成较为成熟的板层骨和骨小梁结构；对照侧未见骨组织形成。实验侧碱性磷酸酶活性明显高于对照侧(P < 0.01)。实验二：术后12周空白对照组骨缺损无愈合，其余3组骨缺损均修复。植入hBMP-2+纳米骨浆组的碱性磷酸酶水平、成骨速度及新生骨力学强度均明显优于植入空白质粒+纳米骨浆或纳米骨组（P < 0.05）。 结论：经组织学、影像学及生物力学的综合检测验证，纳米骨浆复合hBMP-2质粒后，具有一定的骨诱导作用，植入体内后成骨速度、质量及力学强度较单纯的纳米骨浆明显增强，能够有效修复骨缺损。     

同种异体肢体移植特异性免疫耐受诱导方案

背景：通过诱导受体产生免疫耐受能够解决移植领域存在的许多问题,如长期应用免疫抑制剂带来的毒副作用,慢性排斥反应等。 目的：观察联合应用亚致死量放射线照射、氟达拉滨及骨髓腔内骨髓移植对诱导大鼠同种异体肢体移植产生特异性免疫耐受的影响。 设计、时间及地点：随机同期对照动物实验,于2004-01/2008-12在哈尔滨医科大学完成。 材料：40只雄性Wistar大鼠随机分成4组：单纯移植组、氟达拉滨组、骨髓移植组、氟达拉滨＋骨髓移植组,每组各10只。40只SD大鼠为骨髓移植供体。供体DA大鼠用于皮肤移植实验。 方法：制作同种异体右后肢移植模型,单纯移植组仅进行肢体移植;氟达拉滨组在肢体移植前1 d,受体给予亚致死量60Co照射及腹腔内注射氟达拉滨50 mg/kg;骨髓移植组肢体移植当天受体接受供体骨髓腔内骨髓移植1×1012 L-1,10 μL;氟达拉滨+骨髓移植组受体联合应用亚致死量照射、注射氟达拉滨及骨髓腔内骨髓移植。 主要观察指标：观察移植物排斥反应征象及存活情况,并对氟达拉滨+骨髓移植组产生免疫耐受大鼠进行SD大鼠及DA大鼠皮肤移植及脾细胞中细胞因子mRNA检测。 结果：与其他实验组比较,氟达拉滨＋骨髓移植组移植物发生排斥反应的时间及存活时间均显著延长(P < 0.01)。氟达拉滨+骨髓移植组大鼠仅对第3方DA大鼠的皮肤呈现强烈的免疫反应,移植皮肤初为水疱、渗出,逐渐溃疡、糜烂、焦痂、变黑坏死。 与单纯移植组比较,氟达拉滨+骨髓移植组大鼠Th1型细胞因子的表达明显降低,而Th2型细胞因子的表达明显增高。 结论：氟达拉滨与骨髓移植联合方案可以诱导大鼠同种异体肢体移植产生特异性免疫耐受。     

复合成骨细胞藻酸盐凝胶的体内成骨效应**☆

目的：为使骨缺损的治疗简便可行，又要保证可靠的骨修复效果，实验将成骨细胞复合于藻酸钙水凝胶中，直接经皮注射动物体内了解其成骨情况。 方法：实验于2006-01/2007-07在十堰市太和医院生命科学研究所实验室完成。将培养的兔骨髓基质成骨细胞复合于1.5%藻酸钠溶液，再加入葡萄糖酸钙，制备成骨细胞密度为1×1010 L-1、钙离子浓度为50 mmol/L的藻酸钙水凝胶。将20只健康成年新西兰大白兔左侧背部经皮注射成骨细胞-藻酸钙水凝胶复合物(实验侧)，右侧注射单纯藻酸钙水凝胶(对照侧)。于术后4，8，12周分别行X射线检查及组织学观察成骨情况。 结果：20只健康成年新西兰大白兔均进入结果分析。X射线和组织学观察表明，实验侧成骨活跃，骨再生迅速，12周内，新生骨组织明显增多，且新生骨组织趋向成熟，X线片显示高密度影;而对照侧未见骨组织出现。 结论：复合成骨细胞的藻酸钙凝胶经皮注射植入在动物体内异位成骨可靠、确切。     

肌肉转录调节因子和连接蛋白43转基因成纤维细胞移植对心肌梗死大鼠脑钠素及梗死面积的影响

背景：研究表明基因工程将成纤维细胞改造为可兴奋细胞是可能的；而真皮成纤维细胞是机体内数量最大的“种子细胞库”。 目的：观察肌肉转录调节因子（myogenic determination,MyoD）和连接蛋白43(connexin 43,Cx43)基因共转染真皮成纤维细胞后在心肌梗死部位原位移植对急性心肌梗死大鼠血浆脑钠素浓度和心肌梗死面积的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006-06/2007-03在同济大学附属东方医院细胞治疗室和上海中医药大学动物实验中心完成。 材料：雄性SD大鼠60只随机分成正常对照组、心肌梗死对照组、正常移植组和心肌梗死移植组，每组15只。 方法：结扎左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型。4周后再次开胸在自结扎远端紧靠结扎处，心肌梗死区与非梗死区交界处用微量注射器将100 μL经BrdU标记的MyoD/Cx43-FB细胞悬液(细胞数1.0×106 )注入左冠状动脉前降支，在结扎远端已缺血的心肌上用同样的针头于靠近心尖部、室间隔部、左室前侧壁缺血的心肌上多点多位置将另外100 μL移植细胞悬液注入到心肌内，深度约4 mm；对照组同法等量注入未含细胞的DMEM细胞培养液。 主要观察指标：细胞移植前和移植后1 d，1，2，4周动态检测血浆脑钠素浓度；同时监测各组大鼠心率、动脉压、左心室内压及左心室等容收缩期室内压最大上升速率和下降速率等血流动力学指标的变化；4周后处死大鼠取心肌标本染色后测定心肌梗死面积。 结果：①免疫组织化学检测结果显示心肌瘢痕区边缘有BrdU阳性细胞存在。②细胞移植可显著改善心肌梗死大鼠的血流动力学。③心肌梗死对照组和心肌梗死移植组大鼠的血浆脑钠素浓度较正常对照组和正常移植组明显升高(P < 0.01)；在移植后1 d、1周、2周心肌梗死移植组与心肌梗死对照组血浆脑钠素浓度差异无显著性意义，4周后明显降低（P < 0.01）。④心肌梗死移植组的梗死面积显著小于心肌梗死对照组(P < 0.01)。 结论：MyoD和Cx43基因联合转染成纤维细胞后原位移植修复坏死心肌组织，能减小梗死面积。