种植体周围炎对成骨细胞增殖分化及成骨功能影响的体外研究

利用体外分离培养的种植体周围炎来源和正常组织来源人成骨细胞（osteoblast,OB）,观察炎性微环境对其增殖、分化成熟的影响。探讨种植体周围炎对OB功能的影响,期望能为临床种植修复提供相关的理论基础。首先进行成骨细胞原代及传代培养,然后对细胞爬片进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色,光镜下观察计数ALP阳性OB数,并将细胞爬片用茜素红进行钙结节染色,光镜下观察钙结节,计数并拍照,均用于成骨细胞鉴定;传代第三代细胞,收集细胞上清液分别进行ALP活性检测及应用放射免疫方法测定骨钙素（osteocalcin,OCN）含量。原代培养的细胞呈现OB的形态学特征,ALP染色阳性,钙结节茜素红染色呈橘红色钙化结节,此两项结果证实培养细胞为OB;传代细胞种植体来源的细胞,ALP阳性OB数量减少,钙结节数量及骨钙素数值降低。种植体周围炎引发的炎性微环境降低成骨细胞的增殖分化及成骨功能。     

雌激素对成骨细胞增殖及TGF-β_1、IGF-1 mRNA表达的影响

目的初步探讨雌二醇(E2)在体外对大鼠成骨细胞(OB)增殖及转化生长因子-β1(TGF-β1)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因表达的影响。方法以大鼠OB为体外实验模型,用MTT法检测OB的增殖情况,实时荧光定量PCR法检测成TGF-β1、IGF-1基因的表达。结果 10-9~10-6mol/L浓度E2的可促进OB的增殖,以10-7mol/L为最高峰值。10-5mol/L组与对照组比较有抑制作用,但差异无统计学意义(P>0.05)。E2可增加TGF-β1、IGF-1 mRNA的表达,且呈浓度依赖关系。结论雌激素促进OB增殖及TGF-β1和IGF-1基因的表达,这可能是雌激素促进骨形成的重要机制之一。     

转化生长因子β对成骨细胞增殖、BMP-2及Cbfal基因表达的影响

目的：通过转化生长因子β（TGF-β）对体外成骨细胞增殖、骨形态蛋白-2（BMP-2）及核心结合因子1（Cbfal）基因表达的影响,探讨TGF-β对骨代谢影响的可能机制。方法：不同浓度的TGF（0、0.01、100ng/ml）刺激体外培养的大鼠成骨细胞,采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力,用半定量RT-PCR法检测成骨细胞BMP-2、Cbfal基因的表达。结果：TGF-β可明显促进成骨细胞增殖（P〈0.05）,并促进成骨细胞BMP-2、Cbfal基因的表达（P〈0.01）,具有浓度依赖性。结论：TGF-β可促进成骨细胞的增殖、分化及成熟,可能是通过增强BMP-2、Cbfal基因的表达来实现的。     

巴戟天丸组方对Aβ损伤成骨细胞的作用及基于网络药理学的机制研究

目的 探讨巴戟天丸组方对Aβ损伤成骨细胞的骨形成作用及其机制。方法 以新生24 h Wistar大鼠所分离的成骨细胞为研究对象,用 Aβ1-42 寡聚体对成骨细胞进行损伤,并用巴戟天丸组方水提物进行药物干预。分别采用MTT法、碱性磷酸酶（ALP）活性检测、过氧化氢酶（CAT）活性检测、超氧化物歧化酶（SOD）活性检测、谷胱甘肽（GSH）活性检测以及丙二醛（MDA）活性检测。采用蛋白质印迹法检测骨形成相关蛋白骨形态发生蛋白2（BMP2）、成骨特异性转录因子（RUNX-2）、骨保护蛋白（OPG）的表达水平;明确巴戟天丸组方对Aβ损伤成骨细胞的作用后,采用网络药理学方法对潜在的作用机制进行预测。结果 巴戟天丸组方可显著促进Aβ损伤成骨细胞的增殖,提高 ALP、SOD、GSH 活性,抑制MDA活性,并促进骨形成相关蛋白BMP2、RUNX-2、OPG的表达。网络药理学分析显示,巴戟天丸组方发挥改善Aβ损伤成骨细胞的作用主要与AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路以及神经活性配体与受体的相互作用通路等有关。结论 明确巴戟天丸组方具有改善Aβ损伤成骨细胞的作用,并通过网络药理学方法探究其相关作用通路,为传统方剂巴戟天丸抗骨质疏松的临床应用提供借鉴。     

高糖环境中吡格列酮对MC3T3-E1成骨细胞的作用及其机制

目的观察高糖环境下吡格列酮对MC3T3-E1成骨细胞的作用并探讨其可能机制。方法高糖(22.5 mmol·L~(-1))环境培养MC3T3-E1细胞,分为对照组,吡格列酮2.5、5、10μmol·L~(-1)组,干预24、48 h。检测细胞增殖活性、凋亡率、骨钙素和碱性磷酸酶(ALP)分泌水平,以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、成骨因子runt相关基因2(Runx2)和骨形态蛋白2(BMP-2)mRNA的表达水平。并分析PPARγ、Runx2的表达与骨钙素、ALP、BMP-2的相关性。结果在相同干预时限,吡格列酮各组MC3T3-E1成骨细胞增殖活性、骨钙素和ALP的分泌水平、Runx2 mRNA和BMP-2 mRNA的表达均低于对照组,凋亡率和PPARγmRNA的表达高于对照组(P<0.05)。随吡格列酮浓度增加,细胞增殖活性、骨钙素和ALP的分泌、Runx2 mRNA和BMP-2 mRNA的表达均降低,而细胞凋亡率和PPARγmRNA的表达增高(P<0.05)。与干预24 h相比,干预48 h时相同浓度吡格列酮组细胞增殖活性,骨钙素和ALP的分泌水平,PPARγ、Runx2、BMP-2 mRNA的表达或无变化或略增加。结论高糖环境下吡格列酮对成骨细胞有损害作用,促进PPARγ表达、抑制Runx2的表达可能为其作用机制之一。     

2,3-二氢-7-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-异烟腙抗骨质疏松作用的体外活性研究

目的：在已有的研究基础上,从我们合成的一系列化合物中筛选出具有抗骨质疏松活性的化合物I（2,3-二氢-7-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-异烟腙）,对其体外活性进行研究。方法：以雌二醇（E2）作为阳性对照,以细胞增殖作用、碱性磷酸酶（ALP）活性和骨钙素（OCN）分泌为指标考察该化合物对成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖和分化的影响。结果：化合物I在10^-6mol/L浓度时对体外培养的细胞有较好的促进作用,显著增加细胞数量（125.73%,与对照组比较P〈0.05）,提高ALP活性（108.49%,与对照组比较P〈0.05）,且能够促进骨钙素分泌（109.00%,与对照组比较P〈0.05）,以上作用均可被雌激素受体（ER）阻断剂tamoxifen阻断。结论：化合物I具有促进成骨细胞增殖分化的作用,其机制可能与ER激动有关。     

巴戟天丸防治D-半乳糖损伤成骨细胞骨丢失的作用及机制研究

目的 研究巴戟天丸防治D-半乳糖（D-gal）损伤成骨细胞骨丢失的作用及机制。方法 采用新生24 h Wistar大鼠提取的原代成骨细胞,利用D-gal对细胞进行干预,并给予巴戟天丸提取物行药物治疗。分别采用MTT法和碱性磷酸酶试剂盒评价细胞的增殖和分化水平;采用DCFH-DA荧光探针对成骨细胞内活性氧（ROS）水平进行测定。采用Western blotting法对磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、蛋白激酶B(AKT)、血红素氧合酶1(HO-1)、醌NADPH脱氢酶1(NQO1)等氧化相关蛋白的表达进行检测,并采用免疫荧光法测定细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)的核内表达水平。结果 巴戟天丸能显著提高D-gal干预细胞的增殖水平和ALP活性,并显著降低细胞内ROS水平。巴戟天丸能够显著促进细胞AKT蛋白的磷酸化,提高HO-1、NQO1的表达水平,进而激活PI3K/AKT信号通路。此外,巴戟天丸提取物还可显著促进成骨细胞核内Nrf2的表达,激活Nrf2信号通路,促进骨形成。结论 本研究首次明确了巴戟天丸可防治D-半乳糖损伤引起的成骨细胞骨丢失,其作用机制可能与调控PI3K/AKT和Nrf...     

鬼针草总黄酮对肝纤维化大鼠肝星状细胞TGF-β1信号传导通路的影响

目的研究外源性转移生长因子-β1(transforming growth factor betal,TGF-β1)对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的激活作用,观察鬼针草总黄酮(total flavonoids of Bidens Bipinnata L,TFB)对HSC中smad2/7和Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达的影响,以探讨TFB抗肝纤维化的作用及分子机制。方法采用Collagenase Ⅳ胶原酶原位肝灌注法分离HSC,MTT法观察TFB对TGF-β1刺激下HSC增殖的作用,ELISA法检测HSC自分泌TGF-β1和产生Ⅰ型胶原的影响;RT-PCR法观察分析TFB对TGF-β1刺激下HSC中smad2/7和Ⅰ型胶原基因表达的影响;Westernblot法观察TFB对TGF-β1刺激下HSC中smad2蛋白表达的影响。结果TGF-β1明显促进HSC增殖、自分泌TGF-β1和产生胶原,促进HSCsmad2、Ⅰ型胶原mRNA及smad2蛋白的表达,明显抑制smad7mRNA表达(P<0.05),TFB作用后,TGF-β1刺激的HSC中smads2mRNA、蛋白和Ⅰ型胶原mRNA表达受到抑制,smad7mRNA表达明显上调。结论TFB抗肝纤维化作用可能与其阻断HSCTGF-β1通路进而阻断HSC的活化、增殖有关。     

葛根对大鼠成骨细胞增殖分化影响的血清药理学实验

目的：观察葛根含药血清对新生大鼠颅骨成骨细胞增殖分化的影响。方法：将32只SD大鼠随机分为实验组与对照组，在同等条件下制备葛根处理大鼠含药血清和对照血清，观察不同采血时间及血清添加量对成骨细胞增殖和碱性磷酸酶（ALP）的影响。结果：葛根末次灌胃后1～2小时采血的含药血清对成骨细胞增殖和ALP的作用明显（P〈0．01），随着含药血清添加量的增加，对成骨细胞增殖和ALP的作用明显增强（P〈0．01）。结论：含葛根处理大鼠血清可促进成骨细胞增殖和分化。     

巴戟天寡糖对成肌细胞增殖及分化的影响

目的：观察了巴戟天寡糖对成肌细胞增殖分化的作用，并初步探讨其机制。方法：采用离体纯化培养的乳鼠双侧后肢骨骼肌成肌细胞的方法，以常规细胞培养为正常对照、5-氮杂胞苷（10μmol／L）为阳性对照，以①成肌细胞形态学变化。②免疫组化法鉴定结蛋白（Desmin）。③免疫组化法测定转化生长因子β1（TGF-β1）和增殖细胞核抗原（PCNA）。④生长曲线的绘制。⑤MTT（Methyl Thiazolyl Tetrazolium）法检测巴戟天寡糖对成肌细胞增殖的影响为指标，观察巴戟天寡糖100μg／ml、300μg／ml、500μg／ml三种浓度对其增殖及分化的影响。结果：1．成肌细胞培养24h后可见大量折光率强的圆形细胞贴壁；48h后见大量梭形或纺锤形的单个核细胞出现；72h后梭形细胞的数量逐渐增加，成肌细胞细长，并相互拉网，细胞从单个核期进入合体细胞阶段；培养第5天后，在镜下可观察到分化状态较好的肌管有自发性搏动的收缩现象。2．成肌细胞desmin胞浆呈阳性反应，细胞核外周及胞浆呈棕黄色。3．巴戟天寡糖两组单核成肌细胞及多核初生肌管内胞浆中TGF-β1均呈阳性反应。结果表明在一定剂量范围内，巴戟天寡糖对成肌细胞内TGF-β1的表达有增强作用，过大剂量时反而抑制其表达。4．巴戟天寡糖各剂量组单核成肌细胞及初生肌管内细胞核的PCNA阳性反应均较对照组强，且随剂量递增而显强阳性反应。5．原代成肌细胞生长培养48h后开始增生，早期增殖较快，倍增时间为5d，6、7d进入平稳期。6．巴戟天寡糖以剂量方式促进成肌细胞增殖，且各组与对照组相比均有显著差异，在500μg／m剂量达到最大效应（P〈0．05）。结论：巴戟天寡糖具有明显促进成肌细胞增殖及分化的作用，可在一定剂量范围内增加成肌细胞的TGF-β1表达，但是剂量过高反而抑制其表达,其原因还需进一步深入探讨。PCNA可作为成肌细胞增殖的一种标志物。     

大黄素对大鼠体外颅骨成骨细胞的影响

目的观察大黄素对体外大鼠颅骨成骨细胞细胞周期、骨钙素含量、骨结节数目和面积、Ⅰ型胶原mRNA表达的影响。方法在成骨细胞体系中加入不同浓度的大黄素,应用流式细胞术、放射免疫测定法、茜素红染色法及RTPCR的方法观察大黄素对大鼠颅骨成骨细胞的增殖、骨钙素含量、骨结节数目和面积、Ⅰ型胶原mRNA表达的影响。结果大黄素可刺激成骨细胞分泌骨钙素。低浓度的大黄素可上调Ⅰ型胶原基因的表达,高浓度时则降低Ⅰ型胶原的基因表达。结论大黄素可以刺激成骨细胞分泌骨钙素和增加Ⅰ型胶原mRNA的表达。     

黄连素对高糖环境下成骨细胞MC3T3-E1的影响

目的:研究黄连素在高糖环境下对成骨细胞MC3T3-E1的影响作用。方法:建立体外细胞高糖培养环境,用黄连素进行干预,通过碱性磷酸酶试剂盒分别检测细胞内和细胞分泌的ALP水平;通过实时荧光定量PCR技术检测成骨细胞相关矿化基因RUNX2、ALP、OCN、COL-1的mRNA表达量。结果:高糖显著抑制了细胞的ALP活性和分泌;黄连素干预促进了成骨细胞ALP的活性和分泌,并可以显著提高成骨细胞相关矿化基因RUNX2、 ALP、 OCN、COL-1的mRNA表达量。结论:黄连素对高糖环境下的成骨细胞的ALP分泌和成骨相关基因的表达有显著促进作用,可逆转高糖导致的细胞成骨能力的降低。     

福莫特罗对雌激素刺激大鼠成骨细胞分化与增殖的影响

目的 研究β_2肾上腺素受体阻滞剂福莫特罗对雌激素刺激大鼠成骨细胞分化与增殖的影响.方法 将不同浓度的福莫特罗加入到含雌激素(17β-E_2)培养的第二代大鼠成竹细胞中,分别于培养3、6、9、12 d后,用PNPP法检测成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性,采用ELISA方法检测骨钙素浓度,用MTT法检测成骨细胞的增殖率.结果 福莫特罗可降低雌激素刺激成骨细胞碱性磷酸酶活性,并抑制成骨细胞细胞增殖,尤其当其浓度为10~(-5)及10~(-5)mol/L时.并降低成骨细胞骨钙素.结论 福莫特罗能够显著抑制雌激素刺激大鼠成骨细胞的分化和增殖作用.     

柚皮苷对乳鼠成骨细胞增殖及c-fos、c-jun表达的影响

目的研究柚皮苷(naringin)对体外培养的小鼠成骨细胞增殖及c-fos和c-jun表达的影响。方法取第1代BALB/c小鼠颅盖骨成骨细胞,将柚皮苷以0.1、1、10μmol·L-1 3种浓度分别加入新生大鼠颅骨成骨细胞培养液中,MTT法观察各组对成骨细胞的增殖作用并绘制细胞生长曲线,用PNPP法测定成骨细胞内碱性磷酸酶(alkaliphos-phatase,ALP)活性,RT-PCR法检测成骨细胞c-fos和c-jun的转录水平。结果细胞生长曲线显示各组成骨细胞数量均随时间延长而增加,中、高浓度的柚皮苷能提高成骨细胞的ALP活性,促进c-fos mRNA表达(P<0.01),对成骨细胞c-jun mRNA表达增强作用不明显(P>0.05)。结论低浓度柚皮苷(0.1μmol·L-1)对骨更新作用不明显,而中、高浓度的柚皮苷(1、10μmol·L-1)能通过上调c-fos mRNA表达,促进成骨细胞的生成功能,增强骨更新。柚皮苷不是通过促进c-jun表达来促进成骨细胞增殖与分化的。     

人参皂苷Rd对高糖所致HMC表达TGF-β1的影响

目的 考察人参皂苷Rd对高糖条件下人肾小球系膜细胞（human mesangial cells,HMC）增殖及对HMC分泌的转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。方法 将人肾小球系膜细胞分为正常血糖组、高糖对照组、高糖＋药物组（5组,人参皂苷Rd浓度分别为6.25,12.5,25,50,100μg.mL 1）,分别于24,48,72 h用MTT法检测细胞增殖情况;实时定量荧光PCR检测TGF-β1的mRNA的表达;ELISA试剂盒检测HMC分泌TGF-β1的量。结果 高糖对HMC的增殖无明显影响,但能显著促进HMC分泌TGF-β1的功能,并上调TGF-β1 mRNA的表达,与正常血糖组比较具有统计学意义;而不同浓度的人参皂苷Rd对高糖所致HMC合成、分泌TGF-β1的功能均有不同程度的抑制作用,其中,浓度为12.5,25,50,100μg.mL 1的人参皂苷Rd效果显著,具有显著性差异（P〈0.05）,且能下调TGF-β1 mRNA的表达。结论 人参皂苷Rd可以减少高糖状态下HMC合成和分泌的TGF-β1蛋白的量以及下调TGF-β1 mRNA的表达。     

川续断皂苷Ⅵ诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的研究

目的探讨川续断皂苷Ⅵ(akebia saponin D)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的影响。方法用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,选择合适的培养基,传代扩增。采用不同浓度的川续断皂苷Ⅵ对大鼠MSCs定向诱导分化,MTT法观察各组对MSCs的增殖作用并绘制细胞生长曲线;观察MSCs诱导分化过程中成骨细胞内碱性磷酸酶(alkaliphosphatase,ALP)活性;采用ELISA法检测MSCs诱导分化过程中骨钙素(Osteo-calcin,OC)的含量;RT-PCR方法检测MSCs诱导分化过程中核心结合因子α-1(Cbfα1)mRNA表达。结果细胞生长曲线显示各组MSCs数量均随时间延长而增加,中、高浓度的川续断皂苷Ⅵ能明显提高MSCs分化为成骨细胞的ALP活性和骨钙素的含量,且使Cbfα1 mRNA的表达升高。结论川续断皂苷Ⅵ具有促进大鼠体外MSCs向成骨细胞增殖和分化的作用,这一作用可能与其升高Cbfα1 mRNA的表达有关。     

盐酸四环素缓释微球对大鼠成骨细胞活性的影响

目的 观察盐酸四环素缓释微球对体外培养的成骨细胞活性的影响.方法 体外分离培养SD大鼠成骨细胞并通过形态学观察、碱性磷酸酶(ALP)钙-钴法染色鉴定其细胞生物学特征;将盐酸四环素聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)微球、盐酸四环素分别与成骨细胞共培养,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各实验组成骨细胞的增殖情况,通过碱性磷酸酶活性测定法检测各实验组成骨细胞中ALP的活性,免疫组化Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ type)染色观察各实验组成骨细胞中Ⅰ型胶原的表达情况.结果 盐酸四环素-PLGA微球能显著促进SD大鼠成骨细胞的增殖,同时增强了ALP的表达,其效应持续时间高于盐酸四环素组和空白对照组,Ⅰ型胶原在3组细胞中的表达无显著差异.结论 制备的盐酸四环素-PLGA微球具有缓释促进成骨细胞增殖和增加ALP活性的作用,在骨创伤的修复重建治疗中具有潜在的应用价值.     

体外培养的新生大鼠成骨细胞形态及功能的时相性变化

目的：探索大鼠成骨细胞（OB）在体外不同时间的形态及功能变化。方法：在为期28天的细胞培养中动态观察了新生大鼠头盖骨OB的活细胞形态变化,并与其皮肤成纤维细胞（FB）的形态变化作了比较,测定了OB中I型原胶原羧基端前肽（PICP）,骨钙素（BGP）和碱性磷酸酶（ALP）的表达量变化。结果：OB与FB在早期散在分布时形态相似,汇合以后两者逐渐出现差异,OB在28天才可用Von Kossa法染到明显钙盐沉着;PICP,BGP分别于初始植入后第7,19天有表达高峰,ALP在12－16天和≥28天有两个表达高峰。结论：体外培养的大鼠OB形态及功能呈动态变化并具有高度趋同性。     

铬离子对成骨细胞的毒性及对Tnfrsf17基因的影响

目的观察Cr3+对成骨细胞SaO2的细胞毒性以及在Cr3+的作用下对成骨细胞Tnfrsf17基因的表达的影响。方法体外培养SaO2成骨细胞,MTT法检测细胞活力,ALP试剂盒检测成骨细胞碱性磷酸酶的分泌情况,Von Kossa试剂盒检测细胞钙结节形成。通过Rt-PCR及Western检测Cr3+对Tnfrsf17表达的影响。结果在Cr3+的刺激作用下,与对照组相比,成骨细胞在相应时间节点细胞活性和钙结节形成明显受限,ALP的分泌呈时间与剂量依赖性的降低。在Cr3+的刺激作用下,0.1、1.3和150 mg各干预组与对照组相比,Tnfrsf17的基因表达水平及蛋白表达水平在24、48和72 h后均有所下降。结论 Cr3+对成骨细胞有细胞毒性而且可以下调Tnfrsf17基因及其蛋白产物的表达。     

啤酒花经抗氧化途径减轻Aβ损伤成骨细胞作用研究

目的 探讨啤酒花改善β-淀粉样蛋白（Aβ）损伤成骨细胞的骨形成作用及其机制。方法 以新生24 h Wistar大鼠所分离的成骨细胞为研究对象,用Aβ_1-42寡聚体对成骨细胞进行损伤,并用啤酒花提取物进行药物干预。分别采用MTT法、碱性磷酸酶（ALP）活性检测以及茜素红染色法评价成骨细胞的增殖、分化及骨矿化水平,流式细胞仪检测成骨细胞凋亡。采用蛋白质印迹法检测骨形成相关蛋白及氧化应激Nrf2、FoxO1通路蛋白的表达水平,并用免疫荧光检测FoxO1蛋白的入核表达。结果 啤酒花提取物可显著促进Aβ损伤成骨细胞的增殖,提高ALP活性及骨矿化结节水平,抑制细胞凋亡率,并促进骨形成相关蛋白I型胶原酶（COL-I）及骨桥蛋白（OPN）的表达。此外,啤酒花提取物可显著激活Aβ损伤成骨细胞的Nrf2和FoxO1信号通路,促进该氧化应激信号通路相关蛋白的表达,通过抗氧化维持骨代谢平衡。结论 本研究表明啤酒花具有减轻Aβ损伤成骨细胞的作用,初步阐明其作用机制与抗氧化有关,为抗骨质疏松作用机制及药物研发提供了新思路。