抗曲霉硫氧还蛋白还原酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备烟曲霉硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TR)GliT单克隆抗体(单抗)并进行鉴定。方法取重组烟曲霉TR蛋白免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,筛选分泌抗TR抗体的杂交瘤细胞,有限稀释法克隆化。用ELISA法测定抗体效价,IsoStrip鉴定抗体类、型,用western blot、免疫荧光分析技术和免疫组化染色鉴定单抗的特异性。结果筛选到1株稳定分泌抗TR单抗(Anti-TR1)的杂交瘤细胞,抗体亚类为IgG1,轻链为κ型。ELISA法测定效价为5×105,能够与烟曲霉分泌蛋白及菌丝中天然TR特异性结合,还可与基因重组TR特异性结合。免疫荧光检测表明,该株单抗与烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉菌丝均发生反应,是曲霉属特异性的抗体。病理组织免疫组化染色结果显示,该抗体可与曲霉菌丝产生特异性反应。结论获得了1株持续分泌高效价抗曲霉属特异性抗TR单抗的交杂瘤细胞株,为进一步的研究奠定了基础。     

烟曲霉硫氧还蛋白还原酶双抗体夹心ELISA法的建立及初步应用

目的建立检测烟曲霉硫氧还蛋白还原酶Gli T(thioredoxin reductase Gli T,TR)的双抗体夹心ELISA法,并用于几种真菌培养上清液中TR蛋白的检测。方法纯化鼠抗人TR单克隆抗体并进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。以纯化羊抗TR多克隆抗体为包被抗体,HRP标记鼠抗人TR单克隆抗体为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法。用方阵滴定法确定包被抗体和检测抗体的最适浓度;对方法的精密度、特异性和最低检测限进行评价;比较分析其检测3种常见曲霉(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉)培养上清中天然TR蛋白的能力,并与3种常见假丝酵母菌(白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌)作比较。结果方阵滴定的结果显示最适包被抗体浓度为1μg/m L,最适检测抗体的稀释度为1∶3 000。抗原最低检测限达2.25ng/m L。重组TR浓度为5 ng/m L和20 ng/m L时,批内和批间变异系数分别为8.57%、12.69%和6.73%、10.45%。阻断实验显示该法有较好的特异性,阻断率达84.7%。该法可以检出烟曲霉24 h培养上清中的天然TR,TR含量与烟曲霉菌丝含量呈正相关。本法与另2种曲霉和3种假丝酵母菌培养上清无交叉反应。结论成功建立并优化了检测烟曲霉TR抗原的ELISA法。该法具有良好的精密度及特异性,对烟曲霉感染有潜在的诊断价值。     

烟曲霉硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的原核表达及抗原性分析

摘要：目的：克隆烟曲霉硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TR）基因并构建原核表达载体,获得烟曲霉TR重组蛋白,并鉴定其抗原性。 方法：用RT-PCR方法从烟曲霉总RNA中扩增出TR cDNA片段,克隆至pMD18-T载体,并转化E.coli JM109。经序列分析证实后,提取重组克隆质粒双酶切获得目的基因,与表达载体pET28a(+)连接,转化E.coli BL21（DE3）,筛选重组表达质粒。用异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导重组融合蛋白表达,用SDS-PAGE及免疫印迹法分析重组蛋白质,并用亲和层析柱进行纯化。 结果：构建了含TR全长基因的重组表达质粒,IPTG诱导后可高效表达。免疫印迹结果表明该重组蛋白质可被侵袭性曲霉病患者血清识别。 结论：成功构建了重组表达质粒pET28a(+)/TR,并在大肠埃希菌中获得了高效表达,重组蛋白质具有良好的抗原性,为进一步研究奠定了基础。     

硫氧还蛋白还原酶与循环系统疾病

硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)是一种包含黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adeninedinucleotide,FAD)结构域的二聚体硒蛋白,是唯一能够催化形成还原型硫氧还蛋白的硒酶。由于其广泛的底物特异性,能参与到各种氧化还原、炎症、细胞凋亡等生理过程中。由TrxR、硫氧还蛋白(Trx)和还原型辅酶(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate,NADPH)组成了硫氧还蛋白系统。硫氧还蛋白系统是细胞内最重要的抗氧化系统之一,同     

血浆硫氧还蛋白还原酶水平检测对宫颈癌早期诊断的价值研究

目的 检测和分析血浆硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin redyctase,TrxR)在宫颈癌和宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)患者中的水平变化,探讨其在宫颈癌早期辅助诊断中的价值。方法 选取2018年1～9月在南通市肿瘤医院确诊的78例宫颈癌和18例CIN患者及同期20例健康对照者的血浆,记录患者临床资料。运用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)检测血浆TrxR浓度; 同时对以上实验者的血浆用电化学发光法(electrochemical luminescence immunoassay,ECL)检测鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCCA)。统计分析二者对宫颈癌早期诊断的价值以及血浆TrxR与宫颈癌临床病理参数间的关系。结果 健康对照组、CIN组和宫颈癌组TrxR水平分别为2.46(0.98,4.21)μg/L,4.38(1.26,6.37)μg/L和5.98(4.02,15.01)μg/L,CIN组TrxR水平较健康对照组显著升高(U=33.5),宫颈癌组TrxR水平较健康对照组也显著升高(U=17.0),差异均有统计学意义(P<0.001)。健康对照组、CIN组和宫颈癌组SCCA水平分别为1.34(0.52,2.06)μg/L,1.61(0.72,2.34)μg/L和7.12(2.76,20.53)μg/L,CIN组较健康对照组SCCA水平升高,差异有统计学意义((U=48.1,P<0.01),宫颈癌组SCCA水平较健康对照组显著升高,差异有统计学意义(U=27.2,P<0.001)。受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)显示血浆TrxR诊断宫颈癌的曲线下面积(aera under curve,AUC)是0.840(95%CI:0.761～0.902),敏感度和特异度分别为92.3%和68.4%,约登指数为60.7%。而血浆SCCA诊断宫颈癌的AUC是0.822(95%CI:0.740～0.886),敏感度和特异度分别为65.4%和86.8%,约登指数为52.2%。病理分期I/II期与III/IV期相比,TrxR水平差异无统计学意义(U=662.0,P=0.500 4),SCCA水平两组间差异有统计学意义(U=452.0,P=0.004 8)。宫颈癌患者TrxR水平与年龄、病理类型和FIGO分型无关(均P>0.05),而与细胞分化程度相关(U=496.0,P=0.034)。结论 TrxR水平的检测有助于宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的早期诊断,对于宫颈癌的早期预警和及早干预有着积极的意义。     

大鼠脊髓损伤模型中硫氧还蛋白还原酶的表达及其作用

目的：探讨大鼠脊髓损伤模型中硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase，TR）的动态表达及其作用。方法：成年Wister大鼠36只，随机分为6组，每组6只。建立大鼠脊髓压迫伤模型，以原位杂交法测定脊髓损伤后不同时间TR的动态变化。结果：脊髓压迫伤后2hTR mRNA表达开始增高，6—12h达到高峰，24h开始下降，48h降到正常水平。结论：脊髓损伤后TR合成增加，通过抗氧化、清除自由基及抑制细胞凋亡，对脊髓损伤有保护作用。     

蚯蚓组织中硫氧还蛋白还原酶抑制剂初探

目的 研究蚯蚓组织成份对硫氧还蛋白系统的影响。方法 乙酸盐缓冲液抽提蚯蚓组织成份,不同处理的蚯蚓提取液与硫氧还蛋白系统反应,在340nm波长处,用NADPH作为被监测的反应底物来动态监测硫氧还蛋白还原酶（TrxR)的催化活性。结果 蚯蚓提取液与TrxR单独作用后,监测底物NADPH的吸光值几乎不发生变化。蚯蚓提取液的溶剂及煮沸后的上清液不具有以上作用。结论 蚯蚓组织中含有能够抑制TrxR活性的物质,该物质的化学本质为蛋白质。     

硫氧还蛋白还原酶在肺癌疗效监测中的应用

目的 探讨血浆硫氧还蛋白还原酶(TR)在肺癌化疗疗效监测中的价值.方法 将482例肺癌患者依据化疗疗效分为治疗未获益组(211例)和治疗获益组(271例),检测所有患者TR、癌胚抗原(CEA)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC-Ag)、细胞角蛋白19片段(CYFRA 21-1)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胃泌素释放肽前...     

外周血血管内皮生长因子和硫氧还原蛋白还原酶水平对卵巢癌的诊断价值

目的 探讨外周血血管内皮生长因子(VEGF)和硫氧还蛋白还原酶(TrxR)水平对卵巢癌的诊断价值。方法 收集54例卵巢癌患者(卵巢癌组),40例卵巢良性病变患者(良性病变组),80例体检健康者(健康组)外周血标本,分别测定人附睾蛋白4(HE4)、VEGF和TrxR水平。分析外周血VEGF和TrxR表达水平对卵巢癌的诊断价值及其在卵巢癌手术前后与临床病理特征之间的关系。用受试者工作特征(ROC)曲线评价各指标对卵巢癌辅助诊断的价值。结果 3组间HE4、VEGF和TrxR水平比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。外周血VEGF、TrxR水平与卵巢癌FIGO分期、病理分型及是否转移无相关性(P>0.05)。Spearman相关性分析结果表明HE4和VEGF(r=0.530,P<0.001)、HE4和TrxR(r=0.581,P<0.001)、VEGF和TrxR(r=0.566,P<0.001)水平均呈正相关。VEGF、TrxR水平用于区分卵巢癌和良性病变时的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.715、0.770;用于区分卵巢癌和健康者时,AUC分别为0.95...     

硫氧还蛋白还原酶活性检测试剂盒在恶性肿瘤辅助诊断中的价值

目的 探讨硫氧还蛋白还原酶(TR)活性检测试剂盒在恶性肿瘤辅助诊断中的价值.方法 检测不同地区、不同检验机构1 122例健康人群TR活性,差异有无统计学意义;检测84例恶性肿瘤患者TR活性,并与健康人群比较,差异有无统计学意义,通过ROC曲线对检测结果进行分析评价.结果 北京体检机构的TR活性均值为(2.6±4.1)U/mL,武汉体检机构的TR均值为(2.6±3.7)U/mL,湖北中医药大学附属医院的TR均值为(2.4±3.5)U/mL,各组间TR活性水平差异无统计学意义(P>0.05);肿瘤组TR活性均值为(9.2±6.4)U/mL,健康组TR活性为(2.5±3.7)U/mL,两者间差异有统计学意义(P<0.05).固定健康组和肿瘤组的样本比例为4∶1,不同的样本量间TR活性差异无统计学意义(P>0.05).ROC曲线下面积为0.812±0.029.结论 组间均数比较U检验和ROC曲线评价均显示,TR活性检测试剂盒用于与异常增生密切相关的肿瘤生长的临床血样检测具有重要的实用价值.     

半乳甘露聚糖试验对侵袭性曲霉感染诊断价值的回顾性分析

目的回顾性分析Platelia Aspergillus EIA法检测血清半乳甘露聚糖(GM)对侵袭性曲霉病(IA)的诊断价值。方法根据诊断标准回顾性地将诊断分为确诊、临床诊断、拟诊及排除IA,并根据患者的基础疾病及是否接受影响免疫功能的药物分为:恶性血液病及造血干细胞移植术后(HSCT)组(A组),使用了影响免疫功能药物但非恶性血液病及HSCT患者组(B组),非恶性血液病及HSCT且未使用影响免疫功能药物的患者组(C组),分析GM实验在各组患者中的以及总的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。结果781例患者,最终确诊8例,临床诊断33例,拟诊189例,排除IA 551例。230例不能排除真菌感染的患者中160例GM阳性,阳性率69.6%,其中确诊6例,临床诊断24例,拟诊130例。GM实验总的敏感性、特异性、NPV分别为73.2%、81.7%、97.6%。在不同类型的患者中敏感性和特异性存在差异,A组的敏感性、特异性分别为85.7%、88.4%,B组为81.2%、81.4%,C组为45.5%、78.7%;不同类型的患者GM试验结果吸光率指数(AI)的中位数分别为A组2.78,B组1.8...     

检测抗烟曲霉分泌蛋白抗体的ELISA法及其诊断价值

目的建立检测人血清中抗烟曲霉特异性抗体的ELISA法,评估该法在侵袭性烟曲霉病(IA)诊断中的价值。方法用沙氏液体培养基震荡培养烟曲霉,TCA/丙酮沉淀法分离菌体蛋白和培养上清中的分泌蛋白。用烟曲霉播散感染的家兔血清及确诊IA患者血清,分别与菌体蛋白和分泌蛋白进行免疫印迹分析,选择反应强的分泌蛋白作为包被抗原,建立测定抗烟曲霉特异抗体的ELISA,并对方法的精密度和特异性进行考察、确定cut off值。对实验动物模型血清以及5例确诊、24例临床诊断为IA的患者血清样本进行测定,并与血清半乳甘露聚糖(GM)测定结果进行比较。结果免疫印迹结果显示培养获得的烟曲霉分泌蛋白与感染动物和病人血清均呈现强反应,以其作为包被抗原建立的ELISA法精密度良好,批内CV=12.0%,批间CV=8.1%;阻断试验证实此法对烟曲霉抗体具特异性。依据200份健康人血清测定结果,取吸光度(A)值1.03作为cut-off值。健康人抗体阳性率为2.0%(4/200),IA患者阳性率41.4%(12/29),二者差异显著(P<0.01)。2例临床诊断病人血清GM试验阴性,但抗体阳性,占8.3%(2/24)。实验感染的家兔均在感染后1周内测...     

侵袭性肺曲霉病实验室检测方法的研究进展

侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)是指曲霉菌菌丝生长侵入肺实质而引起的感染性疾病,具有发病急性、进展迅速、病死率高的特点。长期中性粒细胞缺乏、血液系统恶性肿瘤发生、造血干细胞或实体器官移植、长期大剂量糖皮质激素或免疫抑制剂使用、遗传性或获得性免疫缺陷状态是感染侵袭性肺曲霉病的危险因素。早期诊断和及时治疗是良好预后的关键。但由于该病缺乏典型的临床表现,早期诊断尤为困难。传统的组织病理学、细胞病理学及分离培养的方法可以确诊IPA,但灵敏度低。近年来,一些非培养实验室检测方法逐渐得到应用,如半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)试验、(1,3)-β-D葡聚糖(BDG)试验(G试验)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术、免疫层析侧流装置(lateralflow device,LFD)技术等,本文就此类检测方法诊断IPA作一综述。     

Microsatellite typing of Aspergillus fumigatus isolates recovered from deep organ samples of patients with invasive aspergillosis

Microsatellite typing was used to analyze 41 Aspergillus fumigatus isolates from 9 patients with proven invasive aspergillosis hospitalized in 2 different centers. No strains were shared between patients. For 8 of 9 patients, a single genotype was found for the isolates recovered from all anatomic sites involved.     

侵袭性肺曲霉菌病诊断方法的研究进展

侵袭性曲霉菌病(invasive aspergillosis,IA)是免疫功能低下患者最常见的侵袭性真菌感染,致死率高。由于曲霉菌孢子飘浮于空气中而易被吸入,IA中以侵袭性肺曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)最常见。然而,由于临床表现不典型,诊断金标准即病理学依据获得困难,IPA的诊断仍具挑战性,尤其是在疾病早期阶段。因此,寻找简便、快速、准确性高的诊断方法具有重要意义。本文就目前IPA的诊断进展作一综述。     

Evaluating the use of PCR for diagnosing invasive aspergillosis

Introduction: Aspergillus species, primarily Aspergillus fumigatus, are still the most emerging fungal pathogens. Within recent years, novel molecular methods have been developed to improve the diagnosis of life-threatening invasive aspergillosis in high risk patients. Especially patients with malignant hematological diseases undergoing intensive chemotherapy are at risk and mortality rates are exceptionally high, in part due to difficulties and delays in establishing a microbiologic diagnosis. Early diagnosis and treatment are crucial for an adequate therapeutical management, but, however, are hardly achieved in the clinical setting because most of the current conventional diagnostic tools either lack specificity or acceptable sensitivity at the critical early phase of the infection.

Areas covered: To review the clinical value, advantages and problems as well as drawbacks of molecular approaches, especially polymerase chain reaction (PCR)-based assays to detect genomic DNA of Aspergillus species in clinical samples of immunocompromised, especially hematological patients at high risk for IA, a comprehensive review of the literature was performed and expert opinion was expressed.

Expert commentary: The results of numerous attempts to diagnose invasive aspergillosis by PCR-based detection of fungal genome in clinical samples highlight the potential of the PCR technique to improve early diagnosis of invasive aspergillosis in patients with hematological malignancies during intensive antineoplastic treatment, combined with imaging surveillance and serologic diagnostic tools. Further comparative validation of reliable assays in prospective multicenter studies is mandatory and urgently needed in order to establish a harmonization and standardization, so that ‘gold standard assays’ may be incorporated into diagnostic and therapeutic algorithms that improve the prognosis of patients with life-threatening infections caused by Aspergillus species.     

Combination therapy for chronic invasive rhinocerebral aspergillosis in a clinically immunocompetent patient

Background: Adequate therapy for chronic invasive rhinocerebral aspergillosis in immunocompetent patients is controversial. The incidence of the disease is high in the Sudan and the Middle East. Misinterpretation of diagnostic criteria, failure to verify tissue invasion of fungi, and a lack of understanding of the pathophysiology of various forms of fungal rhinosinusitis lead to controversies in nomenclature, diagnosis, and therapy.Objective: The aim of this report was to detail the clinical presentation and the endoscopic and imaging study findings of a patient with invasive Aspergillus rhinosinusitis with endocranial and orbital extension. This patient was treated with surgical débridement and a combination of antifungal drugs and immunomodulatory therapy.Methods: Endoscopic débridement and high-dose liposomal amphotericin B, in combination with flucytosine and immunomodulators, were used to treat this patient.Results: After treatment, the patient experienced 3 years of disease-free follow-up.Conclusion: Surgical débridement and high-dose systemic combined antifungal therapy with immunomodulatory drugs produced an excellent long-term result for this apparently immunocompetent patient with extensive invasive fungal rhinosinusitis with cerebral and orbital involvement.