成骨细胞条件培养液对BMSCs诱导分化作用研究

目的 探讨大鼠成骨细胞条件培养液对同种大鼠BMSCs的成骨诱导分化作用,为骨组织工程种子细胞的获得寻找一种新方法 . 方法 健康1周龄SD大鼠10只,雌雄不限,体重20～30 g,采用贴壁法和酶消化法分别获得BMSCs和成骨细胞,并进行鉴定.无菌条件收集第1～5代成骨细胞培养液上清,与完全培养基1:1混合,制备成骨细胞条件培养液,与第2代BMSCs共培养为诱导组,相同代次BMSCs与完全培养液共培养为对照组.倒置相差显微镜下观察共培养后BMSCs形态变化,MTT法检测BMSCs生长情况,免疫组织化学染色检测共培养后BMSCs的ALP、Col Ⅰ、骨钙素(osteocalcin,OCN)蛋白的表达,采用RT-PCR检测Col Ⅰ、OCN mRNA的表达. 结果 诱导组共培养7 d BMSCs体积变大,细胞由长梭形展开为扁平形和多边形,并带有突起;9 d细胞呈集落状生长.细胞生长曲线示BMSCs数量随培养时间延长而增加,对照组增殖能力较诱导组强;诱导培养4～7 d,对照组细胞数量与诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05).诱导组培养12 d,ALP染色呈阳性表达;18 d 出现钙结节;21 d Col Ⅰ和OCN呈阳性表达;对照组均呈阴性表达.RT-PCR检测示诱导组培养21 d有Col Ⅰ、OCN mRNA表达,对照组未见表达. 结论 体外大鼠成骨细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠BMSCs向成骨样细胞分化的作用.     

体外诱导BMSCs向软骨分化的方法研究进展

目的全面了解目前体外诱导BMSCs向软骨分化的方法,为软骨组织工程研究提供参考。方法广泛查阅近年来有关软骨组织工程中诱导BMSCs向软骨分化的文献,并进行综合分析。结果目前BMSCs诱导成软骨方法主要是添加外源性生长因子,其中TGF-β家族被公认为最重要的诱导和调节因子。其他重要的诱导方法包括添加多种化学因子、物理因素、转基因技术和微环境诱导等方法,但这些方法仍存在诱导效率低、诱导效果不稳定的问题。结论诱导方法的进展促进了BMSCs在软骨组织工程中的应用,建立更高效、简便、安全的诱导方法仍是软骨组织工程领域重要研究课题之一。     

骨髓干细胞向上皮细胞分化的研究进展

骨髓于细胞具有多向分化潜能,可以向肺、肝、皮肤等组织的上皮细胞分化,因此在细胞移植治疗、基因治疗和组织工程种子细胞方面具有潜在的应用价值。文中对骨髓干细胞向上皮细胞分化的研究现状和分化机制的讨论进行介绍,并分析存在的问题和今后的临床应用前景。     

尿路上皮细胞分化特异性糖蛋白与膀胱癌

膀胱癌是泌尿外科最常见的恶性肿瘤 ,发病率居全身肿瘤的第 5位 ,其中移行细胞癌占 95 % [1] 。近年发现一组尿路上皮细胞分化特异性糖蛋白Uro plakins(UPs) ,主要表达在尿路移行上皮的伞状细胞层 ,中间层细胞也有少量表达[2 ] 。UPs与细胞分化和肿瘤形成有密切关系 ,在膀胱癌的诊断和防治中有一定意义 ,现综述如下。一、UPs简介哺乳动物膀胱上皮是移行上皮 ,由基底层细胞、中间层细胞、腔面伞状细胞组成。人们通过电子显微镜观察到伞状细胞表面 70 %～ 90 %被直径 0 .3～ 0 .5μm的脂样斑块覆盖 ,这些斑块的腔表面厚度 (8nm)约是胞质内…     

人输卵管上皮细胞培养液对人精子活力的影响

哺乳动物输卵管是精子获能、受精和早期胚胎发育的重要场所，并通过其分泌的物质协助完成上述过程。为了解其对精子活力的影响，我们观察了月经中期人输卵管上皮细胞培养液和管腔液对人精子活动率、平均运动速度、高活力精子比例及活动指数的影响。结果在共育不同时间后对上述指标均有显著促进作用，输卵管上皮细胞培养液的作用强于管腔液。说明人输卵管上皮细胞培养液可提高人精子活动能力和生存能力。     

兔羊膜上皮细胞向兔软骨细胞诱导的研究

目的 观察兔羊膜上皮细胞(AECs)向兔软骨细胞诱导分化的特性.方法 获得兔新鲜羊膜组织,去除外膜组织,并剪碎,胶原酶消化法进行原代培养.经传代培养、细胞形态观察后,用软骨细胞诱导培养液使AECs向软骨细胞分化,并以组织化学和免疫组织化学染色进行鉴定,电镜观察细胞形态检测软骨细胞特征性表现、细胞活性噻唑蓝(MTT)比色法检测.结果 兔羊膜上皮细胞具有前期胚胎干细胞的多向分化潜能,采用酶消化法可快速分离培养原代细胞.MTT比色法显示第3代传代细胞活性、增殖能力较高,未进行软骨细胞诱导的细胞未显示出软骨细胞的特征性表现,经软骨细胞诱导分化后,组织化学和免疫组织化学检测表明其能较好的表现软骨细胞特征.结论 兔AECs无伦理学限制,且具有前期胚胎干细胞的多向分化潜能,有望成为软骨细胞组织工程学新型的种子细胞.     

人体尿道粘膜上皮细胞的连续培养

目的：探讨人尿道粘膜上皮细胞体外培养技术，为构建组织工程化尿道提供种子细胞。方法：取尿道下裂患者尿道粘膜，经中性蛋白酶和胰蛋白酶消化，获取粘膜上皮细胞接种于含8％胎牛血清培养基中连续培养，观察细胞形态变化及生、增殖过程。结果：体外培养细胞长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观，体外可连续传9-10代，生长期50-60d。细胞角质蛋白免疫组织化学染色阳性，透射电镜下可见上皮细胞间特有的桥粒结构。结论：尿道粘膜上皮细胞可在体外连续培养，4代以内的培养细胞可用于组织工程化尿道的构建。     

诱导表皮干细胞向汗腺上皮细胞分化的研究

目的通过探索体外诱导表皮干细胞向汗腺上皮分化可能性,为汗腺组织工程探索新的种子细胞来源。方法分别收集正常皮肤表皮细胞．利用流式细胞仪多参数分选表皮干细胞;于不同时间点连续观察,不同浓度EGF（50～1000ng／mL）作用于表皮干细胞后的细胞生长动力学变化,免疫荧光鉴定汗腺细胞表型（NHE-1,NKCC-1）流式细胞仪分析不同浓度EGF对于细胞的毒性。结果50ng／mL和100ng／mL EGF对表皮细胞促增殖能力明显,且二者无显著差异（P〉0．05）：500ng／mL和1000ng／mL EGF抑制细胞增殖。1000ng／mL EGF对细胞增殖的抑制作用更明显（P〈0．05）。表皮干细胞经过50ng／mLEGF诱导后表达汗腺上皮相对特异性标记NHE-1及NKCC-1。结论表皮干细胞可成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。50ng／ml EGF可作为相对优化的表皮干细胞诱导条件。     

羊膜和结膜基质诱导胚胎干细胞分化为上皮样细胞的初步研究

目的观察小鼠胚胎干细胞在保存人羊膜及兔眼表结膜基质上分化的情况。方法36只新西兰兔随机分为3组，每组12只。A组：将表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的小鼠ES-GFP细胞用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记后行实验兔结膜下移植；B组：将小鼠ES—GFP细胞接种到人羊膜上共培养4d，用BrdU标记后移植到实验兔结膜缺损区；C组：采用保存羊膜移植到实验兔兔结膜缺损区。分别于移植后1、2、3、4，6和8周，摘取各组实验眼行荧光显微镜、组织学和免疫组织化学检查，荧光检测ES-GFP细胞在组织中的荧光表达，组织学检查移植到结膜基质的ES-GFP细胞的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况；免疫组织化学检测移植到结膜基质的带有BrdU标记的ES．GFP细胞CK3／CK12和CK13的表达。结果小鼠ES-GFP细胞接种到人羊膜后能在羊膜上贴附生长，与羊膜共培养4d后部分ES-GFP细胞分化为多角形上皮样细胞，免疫组化显示β1整合素阳性。将负载有ES—GFP细胞的羊膜移植到兔结膜缺损区，术后荧光显微镜可在结膜上皮层检测到绿色荧光带，免疫组织化学检测结膜上皮层CK13表达阳性，CK3／CK12表达阴性，在重建的结膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞，未见异常增殖细胞。结论采用保存人羊膜负载小鼠ES细胞行兔结膜移植，小鼠ES细胞能在兔结膜基质存活并增殖。     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞的研究

目的探讨表皮生长因子(EGF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为上皮细胞的可行性。方法抽取小型香猪的骨髓，经密度梯度离心分离纯化MSCs，培养扩增后。用含EGF的不同介质诱导，观察细胞形态的变化，免疫组织化学染色和流式细胞仪鉴定角蛋白的表达。结果免疫组织化学染色显示EGF诱导后3d MSCs角蛋白表达较弱，7d角蛋白表达增强。流式细胞仪检测发现EGF诱导后3d表达角蛋白的MSCs较少(3％)，7d表达角蛋白的细胞数量明显增加(13％)。结论MSCs在体外EGF诱导下可能分化为上皮细胞。     

角质形成细胞条件培养液对成纤维细胞增殖与胶原分泌影响的研究

目的 探讨正常的角质形成细胞对成纤维细胞生物学行为的影响。方法 组织块法培养成纤维细胞，分别加入12．5％、25％与50％浓度的角质形成细胞条件培养液为实验组，加入不含血清DMEM为对照组，采用MTT、羟脯氨酸比色法测定成纤维细胞增殖、胶原合成；以流式细胞仪测定50％浓度角质形成细胞条件培养液组及对照组成纤维细胞生长周期。结果细胞增殖测定，各实验组吸光度（A）值与对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）；随浓度增高，A值增加，25％及50％浓度组与12．5％浓度组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；25％及50％浓度组间比较，差异无统计学意义（P〉0．01）。胶原合成测定中，各实验组A值与对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．01）；各实验组组间比较，差异无统计学意义（P〉0．01）。细胞周期测定见，50％浓度组可明显促进成纤维细胞通过G1／S及S／G1限制点，S期及G1／M期细胞与对照组相比明显增多，G0／G1期细胞与对照组相比明显减少，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论 正常角质形成细胞的上清液可促进成纤维细胞的增殖，但对其胶原分泌影响不明显。     

间歇性负压培养对人BMSCs骨保护素和骨保护素配体mRNA表达水平的影响

目的 探讨间歇性负压对体外培养的人BMSCs骨保护素(osteoprotegerin,OPG)mRNA和骨保护素配体(osteoprotegerin ligand,OPGL)mRNA表达水平的影响. 方法 2008年1月由2例髋关节骨性关节炎行人工关节置换患者自愿捐赠骨髓,分离并体外培养人BMSCs,取第3代细胞.实验组进行负压诱导,设置压力为50 kPa,30 min/次,2次/d,间歇性负压干预2周;对照组于普通CO2培养箱中常规培养.倒置相差显微镜下观察细胞形态,并通过实时定量PCR检测OPG mRNA和OPGL mRNA表达水平. 结果 实验组细胞增殖速度略低于对照组,细胞逐渐由梭形向多角形转变,有数个突起,数目和形态不定,10～14d细胞融合成单层,2周后逐渐形成多个散在致密岛状结构;对照组细胞大部分为梭形.间歇性负压培养2周后,与对照组比较,实验组细胞OPG mRNA表达水平显著提高,OPGL mRNA表达水平显著降低,OPGL mRNA与OPG mRNA比率显著下降,差异均有统计学意义(P＜0.01). 结论 间歇性负压促进入BMSCsOPG表达,同时抑制其OPGL表达.     

BMSCs对消化道损伤的修复作用

目的 探讨BMSCs对消化道损伤的修复作用及其机制.方法 查阅近年来关于BMSCs对消化道损伤修复作用的文献,并进行回顾和综合分析.结果 BMSCs具有自我复制、增殖和多向分化潜能,在消化道损伤修复中作用重大.其可能作用机制为BMSCs能迁移至消化道损伤组织,抑制宿主免疫应答;去分化和再分化;直接分化为消化道上皮干细胞或消化道上皮细胞;与消化道上皮干细胞或成熟上皮细胞融合;参与损伤后微环境的重建.结论 BMSCs参与消化道损伤修复,在消化系统疾病的治疗中具有广阔的应用前景.     

BMSCs构建组织工程软骨的研究进展

目的综述BMSCs构建组织工程软骨的进展。方法查阅近10年来有关BMSCs构建组织工程软骨的文献，并进行综述。结果支架为软骨细胞的生长提供了理想的环境，细胞因子和基因修饰可促进BMSCs分化为软骨细胞，三者在软骨组织工程中具有重要作用。结论三维支架的改良、合理使用细胞因子及基因修饰技术的提高，将推动临床上软骨重建技术的发展。     

多孔CPC组织工程肋骨支架制备及BMSCs在其表面增殖黏附的实验研究

目的 通过形态学观察、细胞黏附和细胞增殖实验观察多孔CPC材料作为组织工程肋骨支架的可行性. 方法 取幼猪骨髓分离培养BMSCs并传代,另自制5 mm×5 mm×5 mm大小的多孔CPC材料,micro-CT观察孔径、孔隙率及羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)含量,并与人正常松质骨作对比.取24孔培养板,于孔内置入多孔CPC材料1块,共15块,调整第1代BMSCs浓度为6×10s个/mL,将细胞悬液150 μL滴加到多孔CPC材料上,置于孵育箱中复合培养4、12、24 h后,收集细胞并计数,计算细胞黏附率:行倒置相差显微镜观察、MTT法检测多孔CPC材料表面BMSCs的生长情况:扫描电镜观察接种BMSCs 7 d的多孔CPC材料,并与单纯多孔CPC材料和正常人松质骨对比. 结果 BMSCs与多孔CPC材料复合培养4、12、24 h的细胞黏附率分别为28.00%±0.98%、46.70%4±1.14%和48.50%±1.18%.MTT法检测细胞与材料复合培养1、2、3、4、5、6 d的吸光度(A)值分别为1.103 ±0.214、1.557 ±0.322、1.920 ±0.178、2.564 ±0.226、2.951 ±0.415和3.831 ±0.328,呈明显上升趋势.倒置相差显微镜下可见细胞生长旺盛,贴壁良好,未出现毒性反应.micro-CT检查示多孔CPC材料的孔径均衡,且互相连通,HA含量为(1 101.222 8 ±0.618 4)mg/ccm,孔隙率为70.26%±0.45%;人正常松质骨HA含量为(1 072.552 3 ±0.744 2)mg/ccm,孔隙率为72.82%±0.51%;两组比较差异无统计学意义(P>0.05).扫描电镜观察单纯多孔CPC材料孔径与正常人松质骨孔径大小、结构相似,且互相连通;BMSCs在多孔CPC材料表面排列有序,细胞呈片状,部分呈簇状,细胞形态呈多边形,细胞间可见较多细胞间质. 结论 多孔CPC材料结构和成分均接近正常人松质骨,BMSCs在其表面生长良好,适合作为组织工程肋骨支架材料,但其对细胞的黏附性有待进一步改善.     

BMSCs在肿瘤治疗中的研究进展

目的 综述BMSCs在肿瘤治疗中的研究进展.方法 广泛查阅近年国内外相关文献,对BMSCs肿瘤趋向性、与肿瘤组织生长的相互关系以及作为肿瘤治疗运载细胞的研究进行回顾性总结与分析.结果 BMSCs对肿瘤组织具有体内定向迁移能力,可抑制或促进肿瘤组织生长,可以作为肿瘤基因治疗的运载细胞;但BMSCs具有向肿瘤转化的可能.结论 BMSCs可能成为肿瘤治疗的良好运载细胞,但尚需进一步研究,以加强其在肿瘤治疗中的安全性.     

经等离子体修饰并复合BMSCs的组织工程神经研究

目的探讨经等离子体修饰的PLGA神经导管复合BMSCs后修复大鼠坐骨神经缺损的疗效。方法取30只新生SD大鼠股骨及胫骨骨髓,培养获得原代BMSCs,并传至第3代。将PGA和PLA按90∶10摩尔比例混合,制备PLGA神经导管,对其进行等离子体修饰。取30只4周龄SD大鼠,制备右后肢坐骨神经1cm缺损模型。按修复材料不同随机分成3组(n=10),实验组:第3代BMSCs复合经等离子体修饰PLGA神经导管;对照组:第3代BMSCs复合普通PLGA神经导管;自体组:自体神经。术后6周观察大鼠的行走步态变化,测定坐骨神经功能指数(sciatic function index,SFI)、电生理变化、腓肠肌湿重恢复率,采用再生神经轴突图像分析评价神经修复效果。结果术后大鼠均存活至实验完成。术后6周,实验组和自体组大鼠行走步态恢复情况较对照组好。实验组、对照组及自体组SFI分别为—51.02±6.54、—58.73±7.87及—48.73±3.95,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组运动神经传导速度及波幅明显高于对照组(P<0.05),但与自体组差别不明显(P>0.05),对照组与自体组差异有统计学意义(P<0.01)。实验组、对照组及自体组腓肠肌湿重恢复率分别为56.13%±4.27%、43.14%±6.52%、59.47%±3.85%,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组有髓神经纤维密度、直径及髓鞘厚度均高于对照组(P<0.05),低于自体组(P<0.05);对照组与自体组差异有统计学意义(P<0.01)。结论复合BMSCs的等离子体PLGA神经导管能有效促进周围神经的再生,为研制新型的组织工程神经修复周围神经缺损提供新的思路。     

血小板裂解液对大鼠BMSCs成骨分化的干预效应

目的 观察血小板裂解液(platelet lysate,PL)对大鼠BMSCs成骨诱导分化的干预效应.方法 成年健康清洁级Wistar大鼠24只,体重250～300 g,雌雄不限.取16只大鼠心内采血,采用3次离心结合反复冻融法制备PL,ELISA法测定PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量.另取8只大鼠,采用全骨髓分离培养法扩增传代BMSCs,取第4代细胞按1×104/cm2接种行成骨诱导培养.按诱导培养液的不同,实验分为3组,A、B组基础诱导培养基中分别含终浓度为5%和1%的PL,C组仅含基础诱导培养基.倒置相差显微镜动态观察各组细胞形态变化及生长状况;诱导培养7d,各组行ALP染色;诱导培养2、8、10d,ALP/总蛋白含量确定ALP活性;诱导培养20 d,茜素红染色观察矿化结节形成并定量分析.结果 PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量分别为(300±30)、(140±25)、(80±35)和(70±20)pg/mL.倒置相差显微镜观察,各组BMSCs形态逐渐发生改变,出现类成骨细胞样形态特征;A组细胞形态变化不及B、C组明显,但细胞增殖较快:20 d A组细胞仍密集生长,ECM中形成的矿物沉积显著少于B、C组.诱导培养7 d,A组细胞胞浆中有少量颗粒,ALP染色呈弱阳性;B、C组细胞胞浆中有大量棕褐色颗粒,ALP染色呈强阳性.诱导培养2、8、10d,ALP活性定量分析示A组显著低于B组和C组(P<0.05).诱导培养20d,茜素红染色显示A、B、C组钙结节数量分别为(7.67±1.10)、(12.87±0.81)和(15.59±1.25)个;矿化结节面积分别为(161 778.70±44 550.80)、(337 349.70±56 083.24)和(415 921.70±71 725.39)像素;A组均明显低于B组和C组(P<0.05),B、C组间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 PL 是多种生长因子的承载体系,以剂量依赖方式抑制BMSCs成骨诱导中ALP活性和矿化结节形成.     

辛伐他汀联合BMSCs治疗激素性股骨头坏死的实验研究

目的 单纯BMSCs治疗激素性股骨头坏死的效果尚不理想,探讨辛伐他汀联合BMSCs治疗激素性股骨头坏死的可行性. 方法 取24只新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs,取第2代细胞制备为1×107/mL,细胞悬液,与明胶海绵复合.取70只新西兰大白兔经耳缘静脉注射10.μg/kg脂多糖,24 h后臀肌注射20 mg/kg甲基强的松龙琥珀酸钠,共3次,每次间隔24 h,制备股骨头坏死模型.选取制备成功的48只,随机分为4组,每组12只.A组不作任何处理B组单纯减压,并于减压通道植入明胶海绵;C组减压同时植入复合BMSCs的明胶海绵;D组减压同时植入复合BMSCs的明胶海绵,每日灌服辛伐他汀(10 mg/kg)至处死.观察动物一般情况,于术后4、8周各组取6只行MRI扫描后,处死取股骨头行组织学及免疫组织化学染色,扫描电镜观察. 结果 术后8周C、D组动物走路姿势逐步好转.术后4周各组MRI未见明显坏死区信号改变,8周时A组可见坏死低信号区明显扩大,B组无变化,C组范围缩小,D组明显缩小.组织病理学观察,术后4周A组见空骨陷窝,无新生毛细血管;B组空骨陷窝较多,有少量新生毛细血管;C、D组空骨陷窝减少,坏死区有大量增生活跃的成骨细胞及新生毛细血管.D组空骨陷窝阳性数及微血管密度分别为19.30±1.52和7.08±1.09,与其他组比较差异有统计学意义(P＜0.05).术后8周,A组可见部分骨小梁断裂;B组减压孔道有纤维性骨痂形成;C组空骨陷窝少见,髓腔形态不规则;D组大量新生骨形成,髓腔较规则,髓内脂肪细胞大小及分布均匀.D组空骨陷窝阳性数及微血管密度分别为11.31±1.28和12.37±1.32,与其他组比较差异有统计学意义(P＜0.05),与术后4周比较差异有统计学意义(P＜0.05).扫描电镜观察术后8周,A组骨小梁见多处断裂塌陷,骨小梁表面未见骨细胞,髓腔内有大量脂肪细胞堆积;B组部分骨小梁可见裂痕;C组骨小梁不致密;D组骨小梁结构规整致密,成骨细胞多,骨细胞及基质胶原纤维正常,髓腔规则. 结论 辛伐他汀能促进BMSCs成骨及成血管化,辛伐他汀联合BMSCs治疗激素性股骨头坏死具有较好的应用前景.