包裹左旋多巴/苄丝肼PLGA微球通过Tau蛋白/△FosB信号通路治疗异动症大鼠的实验研究

目的 探讨可缓释包裹左旋多巴/苄丝肼微球对异动症大鼠的治疗作用及其机制.方法 通过注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)制作帕金森病(Parkinson disease,PD)大鼠模型,制模成功的PD大鼠模型接受左旋多巴(25mg/kg)/苄丝肼(12.5mg/kg)腹腔注射21 d制作异动症大鼠模型.将异动症大鼠分成普通剂型组(n=13)和微球组(n=13)两组.普通剂型组给予普通剂型左旋多巴/苄丝肼皮下注射(按体质量左旋多巴12 mg/kg、苄丝肼15mg/kg),微球组给予等剂量包裹左旋多巴/苄丝肼微球皮下注射.分别于治疗第1、5、10、15和第20天,在大鼠腹腔注射阿扑吗啡后计数其旋转圈数,并于治疗3周后对大鼠进行异常不自主运动(AIM)评分(包括上肢、口面部和轴性3部分).另设PD组和假手术组大鼠各13只.以Western Blot检测大鼠纹状体区△FosB、Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白水平,免疫组织化学法测定大鼠纹状体区磷酸化Tau蛋白阳性细胞水平.结果 普通剂型组大鼠在治疗后的第1、5、10、15和20天阿扑吗啡诱导的旋转圈数分别为221±34.4、180±25.4、123±17.3、91±13.1、84±10.7,微球组大鼠的旋转圈数分别为223±35.1、172±26.8、131±18.7、97±14.9、82±10.5,两组各时点分别比较差异均无统计学意义(P＞0.05).微球组大鼠轴性AIM、上肢AIM、口面AIM评分分别为6.5±0.9、4.1±0.5、5.8±0.7,均低于普通剂型组大鼠(分别为10.3±1.9、6.3±0.9、8.2±1.2)(均P＜0.05).Western blot结果显示,普通剂型组大鼠纹状体△FosB水平[(620.7±48.3)％]高于PD组[(290.2±31.5％)](t=2.11,P＜0.05),但低于微球组[(320.5±32.8)％](t=4.56,P＜0.01).普通剂型组纹状体区磷酸化Tau蛋白水平[(340.4±27.1)％]高于PD组[(130.4±21.5)％](t=2.67,P＜0.05),微球组[(134.6±14.1)％]低于普通剂型组(t=4.13,P＜0.01).免疫组化结果示,普通剂型组大鼠纹状体区磷酸化Tau蛋白阳性细胞指数为(14.6±2.3)×104,高于PD组[(6.9±1.1)×104](t=3.98,P＜0.01),微球组[(7.2±1.1)×104]明显低于普通剂型组(t=3.76,P＜0.01).结论 微球治疗减轻了异动症大鼠的症状,其原因可能是由于可缓释包裹左旋多巴/苄丝肼微球通过影响Tau蛋白/△FosB信号通路的活性,进而改善了异动症大鼠的症状.     

ERK通路参与可持续释放左旋多巴微球减少帕金森病运动并发症的实验研究

目的观察聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)包裹的可释放左旋多巴/苄丝肼的微球对帕金森病(PD)大鼠运动症状及异动症发生的影响并探讨其机制。方法利用PLGA包裹左旋多巴或苄丝肼制成微球,采用高效液相法测定微球在大鼠体外释放左旋多巴/苄丝肼的浓度。6-羟基多巴胺(6-OHDA)腹腔注射制备PD大鼠模型,将造模成功的PD大鼠分为PD组、左旋多巴处理组和微球处理组,并设假手术组,各组12只。给予左旋多巴处理组大鼠皮下注射左旋多巴(12mg/kg)和苄丝肼(15mg/kg),给予微球处理组大鼠皮下注射含同等剂量左旋多巴和苄丝肼的微球。于治疗的第1、7、14天计数大鼠经阿扑吗啡诱导的旋转圈数。2周后行大鼠异常不自主评分(AIM)并利用Western blot检测大鼠纹状体区细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的磷酸化水平。结果体外释放试验结果显示微球内的左旋多巴/苄丝肼均匀缓慢释放,第7天时左旋多巴和苄丝肼释放量分别达到91.2%%和97.1%。治疗2周后,微球处理组大鼠和左旋多巴处理组大鼠阿扑吗啡诱导的旋转圈数均明显下降(均P<0.05),但在治疗的第1、7、14天两组比较无明显统计学差异。微球处理组大鼠于治疗后的第1、2、4、6、8、10、12、14天的AIM评分(轴性+上肢+口面)与左旋多巴处理组大鼠有统计学差异(均P<0.05)。Western blot结果显示左旋多巴处理组大鼠纹状体ERK1/2水平较PD组和假手术组明显升高(均P<0.05)。微球处理组大鼠纹状体ERK1/2磷酸化水平较左旋多巴处理组大鼠明显降低(P<0.01)。结论微球皮下注射可以改善PD大鼠的运动症状,同时可以减少PD大鼠异动症的发生,这可能与微球释放的左旋多巴持续性刺激PD大鼠从而减少ERK1/2的磷酸化水平有关。     

CB1受体激动剂WIN55212-2改善帕金森病运动并发症的实验研究

目的探讨CB1受体激动剂WIN55212-2对左旋多巴诱发的运动并发症的行为学及细胞学作用。方法通过6-OHDA立体定向注射至大鼠右侧前脑内侧束建立PD动物模型,成功的PD大鼠模型分别接受左旋多巴/苄丝肼(50mg/kg加12.5mg/kg苄丝肼,每天2次)+溶剂、左旋多巴/苄丝肼+WIN55212-2(1mg/kg)腹腔注射,共持续21d。评估用药后大鼠的旋转反应时间、剂峰旋转圈数变化和关期发生率;采用Western blot方法检测纹状体信号转导蛋白DARPP-32(Thr75)和ERK1/2(Thr202/Tyr204)的磷酸化表达。结果长期联合应用WIN55212-2和左旋多巴,缓解了左旋多巴单独用药所致的PD大鼠旋转反应时间缩短、剂峰旋转圈数增加的趋势,并明显降低关期发生频率。WIN55212-2与左旋多巴合用显著降低了纹状体内DARPP-32(Thr75)的磷酸化;但未使ERK1/2磷酸化表达降低至对照组水平。结论激动CB1受体可能有益于预防帕金森病运动并发症。     

左旋多巴诱导帕金森病异动症与纹状体DARPP-32磷酸化的关系

目的观察帕金森病(PD)异动症(LID)大鼠模型纹状体区多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白-32(DARPP-32)蛋白Thr75位点磷酸化表达数量及表达位点的改变。方法给予PD大鼠模型左旋多巴治疗21d,评估大鼠行为学变化;采用免疫荧光和Western blot检测大鼠纹状体区DARPP-32蛋白Thr75位点磷酸化表达数量和表达部位的改变情况。结果 PD大鼠长期使用左旋多巴出现类似于人类LID行为学表现。免疫荧光结果显示PD组和LID组大鼠损伤侧DARPP-32(Thr75)的表达多位于强啡肽阳性神经元。Western blot结果显示PD组大鼠损伤侧DARPP-32(Thr75)表达为(159.90±7.22)%,与假手术组比较升高(P<0.05);LID组大鼠损伤侧纹状体DARPP-32(Thr75)的表达为(52.60±4.45)%,与假手术组和PD组比较降低(P<0.05)。结论纹状体黑质投射神经元内DARPP-32蛋白Thr75位点磷酸化表达的改变可能参与了LID的发病。     

DARPP-32磷酸化参与天芪平颤颗粒缓解帕金森病运动并发症的发生

目的研究天芪平颤颗粒对帕金森病(PD)运动并发症大鼠异常不自主行为学及纹状体DARPP-32(Thr75)磷酸化表达的影响,探讨长期左旋多巴使用后天芪平颤颗粒对异动症(LID)的作用机制。方法 6-羟基多巴胺(6-OHDA)制备PD大鼠模型并给予左旋多巴治疗4周,制备LID大鼠模型,将LID大鼠随机分为5组,分别给予大鼠生理盐水(LID模型组)、左旋多巴(西药组)以及小、中、大剂量天芪平颤颗粒组,另设假手术组(n=5)为对照组,并用免疫组化和Western blotting法观察各组大鼠纹状体内磷酸化DARPP-32(Thr75)的表达情况。结果长期使用左旋多巴后,PD大鼠出现刻板运动和进行性增加的对侧旋转等行为学改变。天芪平颤颗粒可明显缓解LID大鼠的不自主运动行为。免疫组化结果显示,西药组磷酸化DARPP-32(THr75)表达较LID模型组降低〔(3.53±0.20)×104 vs.(3.85±0.30)×104,P<0.05〕,大、中、小剂量中药组磷酸化DARPP-32(THr75)表达量分别为(8.54±0.17)×104、(8.10±0.31)×104、(7.06±0.69)×104,较西药组升高(P<0.05)。Western blotting结果与免疫组化基本一致,西药组磷酸化DARPP-32(THr75)灰度值与LID模型组比较无统计学差异〔(0.97±0.24)×106 vs.(1.08±0.12)×106,P>0.05〕,大、中、小剂量中药组大鼠纹状体磷酸化DARPP-32(THr75)灰度值分别为(2.40±0.09)×106、(2.37±0.16)×106、(1.44±0.14)×106,较西药组升高(P<0.05)。结论天芪平颤颗粒可降低LID大鼠的异常不自主运动评分,其机制可能是通过逆转磷酸化DARPP-32(THr75)表达的进一步下降,从而抑制了PKA通路的过度活化;DARPP-32磷酸化参与了治疗PD运动并发症的机制。     

细胞外信号调节激酶通路在帕金森病运动并发症中的作用

目的 探讨细胞外信号调节激酶(ERK)通路在左旋多巴诱发的运动并发症中的作用.方法 通过6-羟多巴胺立体定向注射至大鼠前脑内侧前脑束建立帕金森病(PD)动物模型.对建模成功的PD大鼠每日2次左旋多巴(50 mg/kg 加12.5 mg/kg苄丝肼)腹腔注射,持续22 d.在第23天注射左旋多巴前,给予PD大鼠ERK特异性的抑制剂PD98059处理.评估旋转反应时间及剂峰旋转圈数,采用蛋白免疫印迹法检测纹状体区ERK1/2 磷酸化表达情况.结果 长期使用左旋多巴处理使PD大鼠损伤侧纹状体ERK1/2 磷酸化水平显著增强(155.6%±6.5%), 而PD98059 可明显降低ERK1/2磷酸化水平(85.4%±5.6%).同时,PD98059逆转了左旋多巴所诱导的PD大鼠旋转时间的缩短,减少了剂峰旋转次数.此外,蛋白激酶C(PKC)抑制剂能部分减轻ERK1/2磷酸化水平(101.2%±6.2%,与左旋多巴+溶剂组相比较t=3.2,P<0.05).结论 PD运动并发症的发生可能与纹状体ERK通路的激活有关,并且ERK通路的激活部分是PKC所依赖的;抑制ERK通路活性的药物可能是治疗PD运动并发症的一种新的治疗方式.     

FosB/△FosB在左旋多巴治疗帕金森病大鼠诱发异动症中的表达与作用

目的探讨FosB/△FosB在左旋多巴治疗帕金森病大鼠诱发异动症中的表达与作用。方法左侧内侧前脑束(MFB)立体定位注射6-羟多巴胺(6-OHDA)制备偏侧帕金森病(PD)大鼠模型,筛选出完全毁损和部分毁损的偏侧PD大鼠模型。完全毁损与部分毁损左旋多巴治疗组PD大鼠分别给予左旋多巴治疗,完全毁损生理盐水治疗组PD大鼠给予生理盐水治疗,假手术大鼠为对照组。每组实验终点,旋转行为评估药物疗效,免疫组织化学技术检测纹状体区FosB/△FosB表达水平。结果随左旋多巴治疗时间的延长,动物旋转圈数逐渐缩短(P<0.01),异动症(AIM)评分逐渐升高(P<0.01),部分毁损PD大鼠的AIM评分低于完全毁损者(P<0.01),毁损侧纹状体区FosB/△FosB阳性细胞数、平均光密度值逐渐增高(分别P<0.01),完全毁损组高于部分毁损者(P<0.01)。生理盐水治疗的PD大鼠纹状体区FosB/△FosB阳性细胞数、平均光密度值无明显变化(P>0.05)。结论纹状体区FosB/△FosB表达水平的改变可能参与了左旋多巴诱发异动症的产生。     

细胞外信号调节激酶的磷酸化水平对星形胶质细胞增殖及其细胞周期的影响

目的 探讨细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的磷酸化水平对体外星形胶质细胞(Ast)增殖及其细胞周期的影响.方法 将培养成熟的大鼠原代Ast分为两组,其中一组用ERK1/2磷酸化的特异性抑制剂U0126进行处理(U0126组),另一组不做处理,作为对照组.通过Western Blot技术、Click-iT Edu技术和流式细胞术分别检测两组Ast中ERK1/2磷酸化水平、Ast增殖细胞百分比及各期细胞百分比.结果 U0126组ERK1/2的磷酸化水平(39.13％±6.71％)明显低于对照组(100％).U0126处理24 h后,U0126组Ast增殖细胞百分比[(2.63±1.14)％]低于对照组[(21.43±3.81)％](t=21.13,P＜0.01).G1期U0126组Ast[(93.67±0.68)％]高于对照组[(84.63±1.00)％](t=12.91,P＜0.01);S期U0126组Ast[(2.90±0.23)％]低于对照组[(14.21±1.14)％] (t=16.87,P＜0.01);G2期U0126组Ast[(3.43±0.88)％]高于对照组[(2.08±0.21％)％](t=4.35,P＜0.05).结论 降低ERK1/2的磷酸化水平可抑制Ast的增殖,并将其阻断在G1期,抑制Ast从G1期向S期的转化,同时抑制其分裂将其阻断在G2期.     

5-羟色胺1A受体激动剂8-OH-DPAT改善帕金森病运动并发症的实验研究

目的 探讨5-羟色胺1A(5-HT1A)受体激动剂8-OH-DPAT对左旋多巴诱发的运动并发症的细胞学与行为学效应.方法 通过6-羟基多巴胺立体定向注射至大鼠前脑内侧前脑束建立帕金森病(Parkinson disease,PD)动物模型.对模型成功的PD大鼠进行两套实验:第1套实验中3组PD大鼠接受每日2次左旋多巴甲酯(50 mg/kg加12.5 mg/kg苄丝肼)腹腔注射,持续22 d.在第23天左旋多巴注射前,3组PD大鼠先分别接受8-OH-DPAT、8-OH-DPAT+5-羟色胺1A(5-HT1A)受体阻断剂WAY-100635(0.1 mg/kg)及溶剂对照注射;第2套实验中2组PD大鼠每日2次分别接受左旋多巴/苄丝肼+8-OH-DPAT与左旋多巴/苄丝肼+溶剂,持续22 d.评估旋转时间、关期发生频率情况;采用蛋白印迹法检测纹状体区谷氨酸受体1(GluR1)亚细胞分布及GluR1的845位丝氨酸(GluR1Ser845)磷酸化的表达情况.结果 8-OH-DPAT逆转了左旋多巴所诱导的PD大鼠旋转时间的缩短,延长约27.8%±6.1%;并使关期发生频率减少约7.2%±1.7%.5-HT1A受体阻断剂WAY-100635与8-OH-DPAT联合应用则消除了8-OH-DPAT的效应,提示所观察到的8-OH-DPAT的效应是通过5-HT1A受体起作用的.此外,8-OH-DPAT能调节与运动并发症密切相关的GluR1的亚细胞分布,且使GluR1Ser845的磷酸化水平降低约22.1%±3.5%.结论 激动5-HT1A受体的药物可能是治疗及预防PD运动并发症有益的疗法.     

帕金森病运动并发症与ERK磷酸化关系的实验研究

目的观察帕金森病运动并发症模型大鼠纹状体细胞外信号调节激酶(ERK)Thr202/Tyr204位点(ERK1/2)磷酸化水平及表达位点的改变。方法通过脑立体定向仪于大鼠内侧前脑束注射6-羟多巴胺建立帕金森病动物模型,连续腹腔注射左旋多巴(50mg/kg)和苄丝肼(12.50mg/kg)共21 d(2次/d)以诱发运动并发症。通过Western blotting法检测不同处理组大鼠纹状体磷酸化ERK1/2表达水平,免疫荧光双标法观察磷酸化ERK1/2与强啡肽共表达变化,以了解直接通路投射神经元ERK磷酸化修饰情况。结果 Wester·n blotting检测显示,帕金森病组大鼠损伤侧纹状体磷酸化ERK1/2表达水平为(68.28±7.42)%,低于假手术组的(107.05±3.81)%,组间差异具有统计学意义(t=0.109,P=0.018);左旋多巴连续治疗21 d后,表达水平升至(160.37±10.54)%(t=0.109,P=0.000)。免疫荧光双标法检测,帕金森病组大鼠损伤侧纹状体区仅有(35.32±5.03)%的磷酸化ERK1/2与强啡肽共表达;经左旋多巴治疗后,共表达水平显著升至(83.62±1.46)%,高于帕金森病组(t=11.263,P=0.003)。结论长期应用左旋多巴可使帕金森病模型大鼠纹状体磷酸化ERK1/2表达水平明显上调,且ERK磷酸化多发生于直接通路投射神经元,提示黑质-纹状体投射神经元ERK通路的活化可能参与了运动并发症的发生。     

多巴胺D1和谷氨酸NMDA受体参与调控异动症大鼠纹状体△FosB蛋白的表达

目的研究多巴胺D1和D2受体以及谷氨酸NMDA受体对△FosB蛋白表达水平的影响,由此探讨它们在左旋多巴诱导的异动症(Levodopa-induced Dyskinesia,LID)发病机制中的作用。方法对单侧黑质纹状体6-羟多巴胺(6-OHDA)损毁致帕金森病(PD)大鼠给予左旋多巴治疗28d制作LID模型,将大鼠分为7组:正常对照组、PD组、LID组、SCH23390治疗组、MK-801治疗组、raclopride治疗组和非LID组,分别观察各组行为学改变并进行异常不自主运动(abnormal involuntary movement,AI M)评分,用免疫组化和免疫印迹方法测定各组△FosB蛋白表达水平。结果多巴胺D1受体阻断剂SCH23390和谷氨酸NMDA受体阻断剂MK-801明显减轻LID大鼠行为学异常,而多巴胺D2受体阻断剂raclopride对异常不自主运动无明显影响;LID大鼠损毁侧纹状体△FosB蛋白表达较PD大鼠和非LID大鼠明显增加;与LID大鼠相比,MK-801和SCH23390均使△FosB蛋白表达显著下降,而raclopride没有这种效应;各组大鼠健侧纹状体△FosB蛋白表达水平没有显著差异。结论多巴胺D1受体和谷氨酸NMDA受体均通过参与调控纹状体△FosB蛋白的表达而影响大鼠LID的发生。     

Levodopa intake increases plasma levels of S-adenosylmethionine in treated patients with Parkinson disease

Metabolism of levodopa via the enzyme catechol-O-methyltransferase requires S-adenosylmethionine (SAM) as a methyl donor. SAM caused Parkinson disease (PD)-like symptoms in rodents. Therefore, SAM could contribute to a decreased efficacy of levodopa in the long term. SAM levels were significantly reduced in levodopa-treated PD patients, but they showed increased enzyme methionine adenosyl transferase (MAT) activity, which induces SAM synthesis from methionine (MET). This may result from a rebound increase of SAM production. The objective of the study was to demonstrate an effect of acute levodopa intake on SAM synthesis in the plasma of treated PD patients. The authors measured SAM, MET, and levodopa plasma concentrations in 13 levodopa-treated PD patients before and after application of 125 mg levodopa/benserazide. Plasma levels of SAM and levodopa significantly increased, but MET concentrations did not significantly decrease. The SAM increase after levodopa intake may exert both a certain antidepressant and cognitive function improving effect. This is often observed in untreated PD patients who receive levodopa for the first time, or in more advanced, fluctuating PD patients, when they turn from the OFF to the ON phase. Because SAM in higher dosages may also counteract the antiparkinsonian efficacy of levodopa according to animal trials, this SAM increase may hypothetically contribute to the onset of wearing-off phenomena and other clinical signs of limited efficacy of levodopa during long-term treatment with levodopa in PD patients.     

Mechanism of over-activation in direct pathway mediated by dopamine D1 receptor in rats with levodopa-induced dyskinesias

Objective To study the changes of prodynorphin （PDyn） gene expression and dopamine and cAMPregulated phosphoprotein of 32 kDa （DARPP-32） phosphorylation in rats with levodopa-induced dyskinesias （LID）, and to explore the mechanism of over-activation in direct pathway mediated by dopamine D1 receptor. Methods Parkinson＇s disease （PD） rats were received levodopa （10 mg/kg, i.p.） for 28 d to get the LID rats. According to the behavior scale, LID rats were divided into mild （n=8） and severe （n=16） groups. On day 29, 8 rats in severe LID group were given an acute intraperitoneal injection of MK-801 （0.1 mg/kg） 15 min before levodopa treatment （MK-801 group, n=8）. The normal rats received same course and dosage of levodopa as the control group （n=8）. Hybridization in situ was used to measure the expression of PDyn mRNA in striatum. Protein and mRNA levels of total DARPP-32 and phospho-Thr-34 DARPP-32 level were measured by immunoblotting and RT-PCR, respectively. Results The levels of PDyn mRNA and phospho-Thr-34 DARPP-32 increased significantly in LID rats compared with control rats （P〈0.01）, and they also increased markedly in severe LID group compared with mild group （P〈0.01）. Conclusion Phospho-Thr-34 DARPP-32 level was increased in LID rats, which contributed to the over-activation of direct pathway mediated by dopamine D1 receptor.     

左旋多巴对帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经元及纹状体多巴胺递质的影响

目的　研究长期应用左旋多巴对帕金森病 (PD)大鼠黑质多巴胺 (DA)能神经元和DA递质的影响。方法　采用 6 羟基多巴胺 (6 OHDA)制备部分损毁和严重损毁的PD大鼠模型 ,给两种模型口服不同剂量左旋多巴 /苄丝肼 3个月 ,通过观察大鼠旋转行为、酪氨酸羟化酶 (TH)免疫组化染色和高效液相色谱 电化学检测仪 (HPLC ECD)检测纹状体单胺类递质 ,研究左旋多巴对PD大鼠残存的黑质DA能神经元的影响。结果　 (1)左旋多巴对PD大鼠的旋转行为无明显影响 ;(2 )TH阳性细胞数损毁侧 /非损毁侧比值在左旋多巴喂药组和不喂药对照组的差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ;(3)在严重损毁组 ,大剂量左旋多巴使PD大鼠损毁侧DA和 3,4二羟基苯乙酸 (DOPAC)水平明显升高(P <0 0 1)。结论　长期使用左旋多巴对 6 OHDA单侧损毁的PD大鼠残存的黑质DA能神经元无毒性作用。     

β-arrestin1参与MK-801治疗帕金森病异动症的研究

目的 探讨MK-801缓解帕金森病(PD)异动症的治疗机制。方法 建立PD运动并发症大鼠模型,25只大鼠随机分为3组：异动症(LID)组10只、MK-801处理组10只、PD组5只,另设假手术组5只为对照组。观察MK-801治疗左旋多巴诱导的异动症大鼠模型的行为学变化,并采用免疫组织化学方法和Western blot印迹法检测大鼠纹状体区β-arrestin1的表达情况。结果 MK-801处理后,LID大鼠模型异常不自主运动评分降低和剂峰旋转行为减弱。免疫组织化学结果显示LID组损伤侧β-arrestin1阳性细胞指数[(2.95±0.44) ×104]明显较未损伤侧[(3.78 ±0.37)×104]降低,差异有统计学意义(t =5.415,P＜0.05)。Western blot结果显示,PD模型组损毁侧与未损毁侧纹状体区β-arrestin1含量比值为81.02％ ±2.23％;LID组(64.88％±3.10％)蛋白表达量进一步减少,与PD组比较,差异有统计学意义(t=9.47,P＜0.01);而MK-801组蛋白表达量增高至89.26％±1.90％,与LID组相比,差异有统计学意义(t=14.82,P＜0.01)。结论 MK-801能缓解LID大鼠的行为学变化,其机制可能与β-arrestin1表达增多抑制了谷氨酸受体的过度活化有关。