伴放线放线杆菌DNA作为口腔疫苗佐剂的可行性研究

[目的]测定牙周病相关细菌伴放线放线杆菌DNA对口腔内其他细菌性抗原的免疫应答的影响,并探讨牙周病相关细菌伴放线放线杆菌DNA作为口腔疫苗佐剂的可行性.[方法]培养牙周病相关细菌伴放线放线杆菌,并提取其DNA.将大鼠随机分为3个组,采取免疫接种法将等量的明矾缓冲液,明矾-葡萄糖基转移酶缓冲液及含有伴放线放线杆菌DNA的明矾-葡萄糖基转移酶缓冲液分别接种于相应组大鼠体内,分别于接种前及接种后第1,3,6周断尾采血,采用ELISA法测定血清IgG水平.[结果]第1,3,6周时,明矾-葡萄糖基转移酶缓冲液组大鼠血清IgG水平与明矾缓冲液组及含伴放线杆菌DNA明矾-葡萄糖基转移酶缓冲液组相比较均显著增高.[结论]牙周病相关细菌伴放线放线杆菌DNA作为佐剂减弱其他牙周病或龋病细菌抗原的宿主免疫应答,减弱疫苗的效果.     

放线共生放线杆菌菌毛重组蛋白的提取及纯化

目的:对大肠杆菌表达的放线共生放线杆菌菌毛重组蛋白LTB-FAP进行提取和纯化,为其用于牙周病的治疗提供理论依据.方法:将重组质粒pET28a/LTB和pET28a/LTB-FAP分别转化到大肠杆菌中进行表达,通过超声裂解法获得以包涵体形式表达的重组外源蛋白LTB-FAP;用2,4,6和8 mol·L-1尿素缓冲液对重...     

几种趋化因子在伴放线放线杆菌刺激的巨噬细胞中的表达

目的探讨趋化因子在伴放线放线杆菌刺激的巨噬细胞中的表达情况。 方法将伴放线放线杆菌和巨噬细胞共同培养,利用β-actin作为内参照,半定量逆转录PCR(RT—PCR)法,测定在不同时间点巨噬细胞表达趋化因子(IL-8、MIP-1α、RANTES、MGSA、MIG)mRNA的相对量。 结果共同培养6h后,巨噬细胞中IL-8和MIP-1α mRNA表达量明显增加(P<0.05,P<0.01),并且随着培养时间的延长,表达量也增加。趋化因子RANTESmRNA的表达量无明显变化。 结论趋化因子IL-8和MIP-1α mRNA表达量明显增加,提示其可能参与了以伴放线放线杆菌为优势致病菌的青少年牙周炎的免疫反应。     

抗哇巴因抗体IgY的制备及其应用

目的 制备高度特异性的抗哇巴因多克隆抗体,并将其应用于组织中内源性哇巴因的免疫学检测.方法 采用哇巴因.牛血清蛋白耦联物作为免疫原免疫母鸡.免疫后1周收集鸡蛋.鸡蛋黄采用PEG-6000方法进行纯化分离,并采用12%SDS-PAGE分析其纯度.酶联免疫吸附法检测IgY抗体效价.然后应用IgY的竞争性酶联免疫吸附法检测哇巴因水平,并将IgY应用于大鼠肾上腺组织中内源性哇巴因的检测.结果 IgY抗体效价在第二次免疫后迅速升高,最高效价达到1:10240,并持续至少4周左右.竞争性酶联免疫吸附法检测哇巴因的批内差异及批间差异分别为2.03%、2.34%.免疫组化结果显示内源性哇巴因主要分布于大鼠肾上腺皮质的网状带,髓质未见明显阳性颗粒.结论 免疫母鸡简单、快速,并且高效价抗体持续时间较长.同时本研究结果提示IgY抗体可用于常规免疫学检测.     

伴放线放线杆菌侵入人颊黏膜上皮细胞的研究

[目的]探讨伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,A.a)与人口腔颊黏膜上皮细胞之间的关系,加深对A.a侵入颊黏膜上皮细胞能力的了解.[方法]运用荧光原位杂交技术和激光共聚焦扫描显微镜对12例侵袭性牙周炎患者(AgP)、30例慢性牙周炎患者(CP)和12例牙周健康者频黏膜上皮细胞中的细菌进行定位及半定量.[结果]受检者口腔颊黏膜细胞内均检测出细菌.分别有11名AgP患者、27名CP患者和1名牙周健康者上皮细胞内检测出A.a;颊黏膜上皮细胞内A.a占全细菌相对比例为60%～100%处比较时,AgP组与CP组之间的差异具有显著性意义(P＜0.01).[结论]A.a能够黏附和侵袭口腔颊黏膜上皮细胞.     

慢性牙周炎患者抗伴放线放线杆菌IgG滴度改变的临床意义

目的：明确慢性牙周炎(chronic periodontitis, CP)患者血清抗伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aa)血清c型的抗体反应并探讨其与牙周临床指标的关系。方法: 采集30例CP患者和45例牙周健康者的空腹静脉血, 同时收集CP患者的龈下菌斑和非刺激性全唾液用于Aa的检测(PCR方法), 应用酶联免疫吸附方法（ELISA）测定血清中抗Aa血清c型IgG抗体滴度。结果: CP组和健康对照组血清抗Aa血清c型抗体检出率均为100%。CP组IgG抗体滴度高于健康对照组,差异有统计学意义［(10.9 ± 1.9） vs （9.1 ± 1.8）, P=0.000］; 同时CP组抗体滴度升高率也高于健康对照组, 差异有统计学意义(23.3% vs 0%, P=0.003)。龈下菌斑或唾液Aa检出阳性的7例慢性牙周炎患者血清IgG抗体滴度(12.6 ± 1.6)高于Aa阴性患者(10.4 ± 1.7), 差异有统计学意义(P=0.005)。 CP患者血清抗Aa IgG抗体滴度与全口平均探诊深度呈正相关(r=0.344, P=0.068)。结论: 血清c型为CP患者定植的Aa的重要血清型;CP患者血清抗Aa抗体并非简单的保护作用。     

几种趋化因子在伴放线放线杆菌刺激的巨噬细胞中的表达

目的探讨趋化因子在伴放线放线杆菌刺激的巨噬细胞中的表达情况.方法将伴放线放线杆菌和巨噬细胞共同培养,利用β-actin作为内参照,半定量逆转录PCR(RT-PCR)法,测定在不同时间点巨噬细胞表达趋化因子(IL-8、MIP-1α、RANTES、MGSA、MIG)mRNA的相对量.结果共同培养6h后,巨噬细胞中IL-8和MIP-1α mRNA表达量明显增加(P＜0.05,P＜0.01),并且随着培养时间的延长,表达量也增加.趋化因子RANTES mRNA的表达量无明显变化.结论趋化因子IL-8和MIP-1α mRNA表达量明显增加,提示其可能参与了以伴放线放线杆菌为优势致病菌的青少年牙周炎的免疫反应.     

抗加特纳杆菌卵黄免疫球蛋白(IgY)的研究

目的 观察鸡卵黄中抗加特纳杆菌抗体的产量、纯度、来源及稳定性。方法 用阴道加特纳杆菌作为抗原免疫Leghorn鸡。通过改良水稀释法提取卵黄中的IgY。双紫外光波长测定抗体含量,SDS-PAGE电泳检测抗体纯度。Westernblot免疫印迹法测定该抗体来源。ELISA检测IgY对温度、酸碱度的稳定性。结果 抗体含量12．8mg／mL蛋黄液,抗体纯度达95％。免疫印迹证明IgY与鸡血清中的IgC具有相同的分子量和抗原性。IgY具有良好的热稳定性,对酸碱具有一定的耐受力。结论 WD水稀释法能得到高产量、高纯度的特异性IgY,而且有良好的生物学活性。     

DNA限制性内切酶分析应用于伴放线放线杆菌的鉴定和分型

本文用限制性内切酶分析(REA)作伴放线放线杆菌(Aa)的鉴定和分型研究,提取Aa染色体DNA,井分别用BamHI、HindⅢ,Sal Ⅰ和Xho Ⅰ消化,作琼脂糖凝胶电泳。结果显示,Aa和嗜沫嗜血杆菌的DNA片段图谱明显不同;分属于两种不同血清型的两株Aa菌株,其DNA片段图谱也明显不同。这表明,REA可用于Aa菌的鉴定和分型,在所用的4种酶中,以Sal Ⅰ和Xho Ⅰ消化的DNA片段图谱差异最明显。     

抗致龋病IgY的制备及防龋功能的观察

目的：制备具有高效免疫活性的抗致龋菌鸡卵黄免疫球蛋白（ＩｇＹ），评估其临床防龋功能。方法：以变形链球菌皮下注射免疫产蛋母鸡，采用聚乙二醇（ＰＥＧ）两步沉淀法提取ＩｇＹ，微量凝集试验检测ＩｇＹ免疫效价及交叉免疫特性，并观察其抑菌效果，与含氟漱口水比较其临床防龋功能。结果：作者制备的ＩｇＹ免疫效价为１：５１２，具有抑制变形链球菌生长，并与其他较常见的变形链球菌ｃ、ｅ、ｆ血清型结合发生交叉凝集反应，经临床验证结果表明ＩｇＹ漱口水与含氟漱口水龋患发生率相近。结论：抗变形链球菌鸡卵黄免疫球蛋白制剂具有防龋功能。     

肾上腺素能β1受体亚型特异性抗体的制备及鉴定

【目的】制备和鉴定 β1受体亚型特异性抗体。【方法】人工合成 β1受体细胞膜外第二环 197 2 2 2位氨基酸序列作为抗原。连接钥孔冒贝血蓝蛋白 (KLH)增加抗原性后免疫兔获得抗血清。通过凝胶双扩散实验和ELISA法鉴定其效价 ;通过免疫荧光法及ELISA法鉴定其特异性 ;通过离体蛙心灌流实验鉴定其药理活性。【结果】该抗血清效价高 (分别为 1∶6 4和 1∶10 6)、特异性强 ,能和心肌 β1受体发生特异性结合 (1∶10 4 ～ 1∶10 5) ,为异丙肾上腺素的非竞争性拮抗剂。 (pD2 ′ =1 6 2 )。【结论】成功制备的 β1受体亚型特异性抗体可能成为进一步研究 β1受体分布、功能和定量的有力工具。     

抗PSMA膜外段单克隆抗体的制备及其初步应用

目的 制备抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)膜外段的单克隆抗体。方法 原核表达含有PSMA膜外段多肽的融合蛋白，免疫雌性Balb／c小鼠后取效价较高的小鼠行小鼠脾细胞与SP2／0细胞融合，以酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫细胞化学、免疫组织化学法筛选、鉴定分泌特异性抗：PSMA膜外段的单克隆杂交瘤细胞株。结果 经过ELISA初筛得到55个阳性杂交瘤细胞株，其中8株经免疫组化证实为可用于前列腺癌石蜡包埋组织切片的免疫组化染色。结论 获得了8株可持续分泌抗PSMA膜外段单克隆抗体的杂交瘤细胞株，产生的单抗以后可用于前列腺癌的诊断，并为前列腺癌的免疫治疗奠定了基础。     

基于基因免疫的抗HBV M蛋白单克隆抗体的制

目的 以基因免疫制备抗乙型肝炎病毒M蛋白的单克隆抗体。方法 构建表达M蛋白的重组质粒pcDNA3-PreS2／S，免疫雌性BALB／c小鼠，以杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果 目的基因片段PreS2／S(875bp)正确插入质粒pcDNA3，重组质粒转染细胞上清、基因注射肌肉、脾脏局部均可检测到M蛋白表达。免疫小鼠后以杂交瘤技术获得了一株分泌抗HBVM蛋白的杂交瘤细胞株2D3。结论 证实了基因免疫可用于制备抗乙型肝炎病毒M蛋白单克隆抗体。     

抗HER2/neu单克隆抗体的制备及其对乳腺癌细胞生长的抑制性

目的 制备抗HER2／neu的特异性单克隆抗体，筛选出能够分泌抑制p185 HER2／neu蛋白过表达的肿瘤细胞生长的单抗杂交瘤细胞株。方法 原核表达含全长neu蛋白的融合蛋白，免疫Balb／c雌性小鼠后取效价高的小鼠尾静脉加强后行脾细胞与SP2／0细胞进行细胞融合。以ELISA、免疫细胞化学、免疫组织化学、细胞免疫荧光和MTT法进行筛选。结果 共获得8株稳定分泌HER2／neu单抗的杂交瘤细胞株，其中5株细胞产生的抗体体外实验能够抑制乳腺癌细胞HBT133的生长。结论 能够抑制HBT133细胞生长的5株杂交瘤细胞株可以用作人源化，具有较高的临床应用价值。     

正交试验法优选吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的闪式提取工艺

【目的】优选吴茱萸药材最佳闪式提取工艺。【方法】采用闪式提取技术,以吴茱萸碱和吴茱萸次碱的得率为指标,采用高效液相色谱法测定。选择乙醇浓度、提取时间和提取电压为考察因素,选用L9(34)正交试验法优选吴茱萸药材最佳闪式提取工艺。【结果】吴茱萸药材的最佳闪提工艺条件为提取电压40 V,提取时间3 min,乙醇浓度体积分数75%和料液比1∶20。【结论】闪式提取吴茱萸药材效率高、时间短,可成为提取吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法。     

不同提取工艺芹菜籽油得率及芹菜甲素和总酞内酯含量的研究

【目的】以不同提取工艺下芹菜籽油的得油率及芹菜甲素、总酞内酯的含量评价各提取工艺。【方法】采用有机溶剂提取法、索氏提取法、水蒸气蒸馏法3大常规方法及亚临界和超临界提取法提取芹菜籽油。并分别采用高效液相色谱法及紫外可见分光光度法考察芹菜籽油中芹菜甲素及总酞内酯的含量。【结果】不同提取工艺下芹菜籽油得油率、芹菜甲素与总酞内酯的含量差别较大,范围分别为0.30%~20.02%、1.40%~10.13%、4.74%~17.65%。【结论】提取芹菜甲素以R134a与丁烷为溶剂的亚临界提取工艺为佳,芹菜甲素转移率相当;提取总酞内酯则以二甲醚为溶剂的亚临界提取法为优。     

细薄星芒海绵总萜烯的制备及Stellettin B和Stellettin D的含量测定

目的:建立测定细薄星芒海绵Stelletta tenuis Lindgren总萜烯提取物中Stellettin B和D含量的方法.方法:采用HPLC-DAD方法.色谱条件为YMC Pack-SIL分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为正己烷:乙酸乙酯(75:25),分析时间30 min,流速1.0 ml·min-1;检测波长:360 nm;柱温:室温;进样量:20μl.结果:线性回归方程为Stellettin B:Y=52 181 633 X 957 495(r=0.996 9),线性范围为2.4～30μg;Stellettin D:Y=62 636 828 X-451 022(r=0.998 0),线性范围为2.0～32μg.精密度、稳定性和重现性试验的RSD在3.07%～4.76%之间.10批细薄里芒海绵总萜烯中Stellettin B和Stellettm D的平均含量分别为59.93%(RSD=4.48%)和30.98%(RSD=2.97%).结论:该法为测定细薄星芒海绵总萜烯中有效成分提供了快速、准确、有效的方法.     

基于BP神经网络和遗传算法优化茺蔚子水苏碱提取工艺的研究

【目的】优化茺蔚子中水苏碱的提取工艺。【方法】采用正交设计,应用误差反向后传（BP）人工神经网络建立茺蔚子水苏碱提取时间、乙醇浓度、料液比与盐酸水苏碱含量之间的关系模型,再结合遗传算法优化提取工艺参数。【结果】提取工艺优化参数为：提取时间62 min、乙醇浓度体积分数69%、料液比11倍,网络模型优化结果稍优于正交试验结果。【结论】 BP神经网络结合遗传算法寻优,能较好地实现茺蔚子水苏碱提取工艺参数的优化,可为解决多维非线性系统的工艺参数优化问题提供崭新而有效的途径。     

高效液相法同时测定血清中卡马西平、苯妥英钠、苯巴比妥的实验方法学研究

【摘要】目的建立高效液相色谱／二极管阵列同时测定血清中卡马西平、苯妥英钠、苯巴比妥含量的检测法。方法以600μl乙酸乙酯为萃取溶剂;样品用量0．2ml血清,萃取时间3min,以3500r／min速度离心4min,取400txl萃取剂于75℃水浴中挥发至干;用1．0ml流动相溶解残留物,10000r／min离心20min后进样分析。分析条件：柱温30℃,流动相（甲醇：水=60：40）,波长254nm,实现了3种药物的有效分离。结果在优化条件下,3种待测组分在1．52～120mg／L范围内呈线性,相关系数（r）≥0．999,检出限（S／N=3）为0．4—1．5mg／L,样品的平均加标回收率为91．3％～111％,相对标准偏差（RSD）〈5％。结论该方法确定了最佳样品预处理条件,优化了色谱分离及检测条件,灵敏、准确,能够满足血清中抗癫痫药物浓度的监测要求。