血管紧张素Ⅱ和醛固酮对肝星状细胞细胞外通路调控的体外研究

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(Aldo)对肝星状细胞(HSC)细胞外调节蛋白激酶(ERK)和激活蛋白1(AP1)信号转导通路的影响。方法采用HSCT6细胞株,分别予AngⅡ1μmol/L和Aldo1μmol/L处理,免疫Western印迹检测磷酸化P42/44蛋白水平。另外,观察AngⅡ1型受体(AT1受体)阻断剂伊贝沙坦(irbesartan),细胞外调节蛋白激酶(ERK)特异性抑制剂U0126,抗氧化剂乙酰半胱氨酸(NAC)、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和肿瘤坏死因子α(TNFα)对磷酸化P42/44蛋白水平的影响。电泳迁移率变更分析(EMSA)检测AP1DNA结合活性的变化;反转录聚合酶链反应检测α1Ⅰ型前胶原基因的表达。结果AngⅡ和Aldo可诱导磷酸化P42/44蛋白水平的变化,与阴性对照组的比值达4.3±0.1、4.0±0.1,并呈时间依赖性,10min达到峰值后逐渐减低。U0126可抑制磷酸化P42/44蛋白水平。irbesartan可抑制AngⅡ诱导的磷酸化P42/44蛋白水平。AngⅡ和Aldo可增强HSC的AP1的DNA结合活性。irbesartan和ACEI可显著抑制AP1的活性;U0126和NAC可以显著抑制AngⅡ诱导的AP1的活化,部分抑制Aldo诱导的AP1的活化。AngⅡ和Aldo可诱导α1Ⅰ型前胶原mRNA的表达。irbesartan、U0126和NAC可显著抑制AngⅡ诱导的α1Ⅰ型前胶原mRNA表达增强;U0126和NAC可显著抑制Aldo诱导的α1Ⅰ型前胶原mRNA表达增强。结论AngⅡ和Aldo可经ERK通路诱导HSCAP1结合活性增强。AngⅡ和Aldo可经AP1通路调控α1Ⅰ型前胶原基因的表达。     

软骨形态发生蛋白1诱导真皮成纤维细胞表达软骨细胞表型的实验研究

目的应用软骨形态发生蛋白(CDMP)生长因子,体外诱导真皮成纤维细胞向成软骨细胞表型分化,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性.方法取包皮环切术后丢弃真皮组织共3例,成纤维细胞体外培养扩增至第二代,以1×104/cm2密度接种,12 h后加入细胞诱导液(10%胎牛血清F-12培养液,CDMP1终浓度为100 ng/ml)单层培养,未加的成纤维细胞培养用CDMP1为对照.诱导7 d后观察细胞形态变化,Image Plus图像分析软件计算细胞长宽比例.激光共聚焦显微镜分别观察诱导前后细胞内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达及分布,Western印迹检测诱导前后细胞Ⅱ型胶原蛋白表达.反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测诱导后成软骨相关的Sox9、聚集蛋白聚糖与Ⅱ、Ⅸ型胶原mRNA表达;同时检测与成骨相关的X型胶原、碱性磷酸酶(AKP)mRNA表达.培养第二代细胞以2×107个细胞/ml细胞密度进行离心管法培养,诱导14 d后行阿辛蓝与Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果诱导后可见单层培养的成纤维细胞形态由长梭形向软骨细胞样多角形转变,Image Plus图像分析软件计算细胞诱导后的长宽比例为(1.40±0.15),较诱导前(7.40±1.30)差异有显著意义(P＜0.05);与正常软骨细胞(1.29±0.24)差异无显著意义.免疫荧光激光共聚焦观察发现诱导后细胞内出现Ⅱ型胶原表达,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达呈阳性.RT-PCR检测成软骨相关的Sox9,聚集蛋白聚糖,Ⅱ、Ⅸ型胶原mRNA表达阳性;X型胶原、AKP未检测到mRNA阳性表达.Western印迹检测细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性.离心管培养诱导7 d后阿辛蓝染色示糖胺聚糖(GAG)均匀分布于基质中,免疫组化染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性.结论第二代成人真皮成纤维细胞在CDMP1生长因子诱导下可向成软骨细胞表型分化,并能分泌软骨细胞特异性基质,有望成为软骨组织工程新的种子细胞来源.     

L-精氨酸调节左向右分流所致肺动脉高压大鼠胶原代谢的研究

目的　探讨L 精氨酸 (L Arg)对高肺血流量所致肺动脉高压大鼠肺动脉胶原代谢的干预作用及其机制。方法　在大鼠行腹主动脉 下腔静脉分流造成的肺动脉高压模型基础上 ,给予L Arg灌胃 (1g·kg-1·d-1,11周 )。 11周后 ,观察肺血流动力学 ,采用免疫组织化学法检测大鼠肺动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达 ,以原位杂交法检测Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白α1(Ⅰ )mRNA、α1(Ⅲ )mRNA、基质金属蛋白酶 1(MMP 1)mRNA、抑制胶原降解作用的中性蛋白酶组织抑制剂 1(TIMP 1)mRNA的表达。结果　分流 11周后 ,肺动脉高压形成。分流组大鼠肺中、小型肺动脉中Ⅰ、Ⅲ型胶原、α1(Ⅰ )、α1(Ⅲ )前胶原mRNA表达与对照组比较明显增加 ,同时TIMP 1mRNA、MMP 1mRNA表达、TIMP 1/MMP 1比值明显高于对照组 (P <0 .0 1)。然而 ,L Arg明显缓解了分流组大鼠肺动脉高压。分流 +L Arg组大鼠肺中、小型肺动脉中Ⅰ、Ⅲ型胶原、α1(Ⅰ )、α1(Ⅲ )前胶原mRNA表达较分流组明显降低 ,且TIMP 1mRNA、MMP 1mRNA表达、TIMP 1/MMP 1比值较分流组显著降低 (P值均 <0 .0 5 )。结论　L Arg通过减少细胞外基质 胶原的堆积 ,增加其降解 ,从而对高肺血流量所致肺动脉高压及肺动脉血管结构重建的形成有重要的调节作用。     

尾加压素Ⅱ对大鼠肺动脉平滑肌细胞胶原合成的影响

目的 研究尾加压素Ⅱ(UⅡ)及其受体拮抗剂Urantide (UR)对培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响.方法 以组织贴块法培养的大鼠PASMCs为研究对象,采用BrdU掺入实验观察不同浓度UⅡ(1×10-10～1×10-7 mol/L)及Urantide对PASMCs增殖的影响;采用Western blotting及Real-timePCR法,分别在蛋白和基因水平检测不同浓度UⅡ及Urantide对Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响.结果 UⅡ(1×10-9～1×10-7mol/L)浓度依赖性地促进PASMCs增殖(P＜0.05,P＜0.001,P＜0.001),增加PASMCs中Ⅰ、Ⅲ型胶原基因及蛋白表达(P＜0.01,P＜0.001),而1×10-10 mol/L UⅡ对PASMCs增殖及Ⅰ、Ⅲ胶原基因和蛋白表达无明显作用(P＞0.05);UⅡ受体拮抗剂Urantide可拮抗UⅡ的上述作用(P＜0.01).结论 UⅡ通过与大鼠PASMCs的UⅡ受体UT结合而发生一系列诱导作用,最终引起PASMCs增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加,Urantide通过竞争性结合UT而阻断UⅡ与UT的结合,使UⅡ无法发挥诱导作用.     

淫羊藿苷对白介素-1β诱导软骨细胞退变的保护作用

目的观察不同浓度淫羊藿苷（icariin, ICA）对IL-1β诱导软骨细胞退变的保护作用。方法原代分离培养新生24h大鼠四肢长骨干骺端透明软骨的软骨细胞,取P1代细胞,以4×103/孔接种96孔培养板,加入终浓度分别为1×10-7、1×10-6和1×10-5mol/L的ICA,MTT法分别测定12、24、36、48、60、72h后软骨细胞增殖情况。以1.2×105/孔接种6孔培养板,分别设置空白对照组（N组）、炎症刺激组（M组,加入10ng/mL IL-1β诱导软骨细胞退变）和淫羊藿苷低、高剂量组（ICA-L组和ICA-H组,炎症刺激组基础上加入ICA,终浓度分别为1×10-7、1×10-6mol/L）,连续干预72h。ELISA法测定培养上清液中Ⅱ型胶原（collagen-Ⅱ, Col-Ⅱ）和糖胺多糖（glycosaminoglycan, GAG）含量,RT-PCR法检测细胞Col-Ⅱ、基质金属蛋白酶13（matrix metaloproteinase13, MMP13）、蛋白聚糖（aggrecan, Acan）和Sox9 mRNA表达情况。结果1×10-5mol/L ICA早期（24h）表现为抑制软骨细胞增殖（P<0.01）,72h后促进软骨细胞增殖（P<0.01）;1×10-7mol/L和1×10-6mol/L ICA干预36~72h后促进软骨细胞增殖（P<0.05）,但其中1×10-7mol/L在60h与空白对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。ICA干预72h后,与M组比较,ICA-L和ICA-H组,GAG浓度均显著升高（P<0.05）,而Col-Ⅱ含量于ICA-L组降低、ICA-H组升高,但差异均无统计学意义（P>0.05）。ICA-L组Acan/Sox9 mRNA表达升高（P<0.01）,ICA-H组Col-ⅡmRNA水平升高而MMP13 mRNA表达降低（P<0.01）。结论淫羊藿苷能影响软骨细胞基质微环境,促进软骨细胞表型基因表达,抑制MMP13 mRNA表达,进而拮抗IL-1β诱导的软骨细胞退变。     

三羟基异黄酮对关节软骨细胞合成胶原和蛋白多糖的影响

目的 通过对体外培养软骨细胞的实验研究,探寻受体酪氨酸激酶抑制剂对软骨细胞在细胞分子水平的影响及其可能机制。方法 对软骨细胞进行原代及传代培养,通过对培养细胞形态学及甲苯胺蓝染色观察,选择适合传代软骨细胞,应用三羟基异黄酮干预后1、2、3、4天RT-PCR、ICC及甲苯胺蓝染色观察法比较药物干预对体外培养软骨细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原的转录和翻译水平及蛋白多糖的表达变化。结果 20 μg/mL及25 μg/mL三羟基异黄酮干预可以抑制Ⅰ型胶原表达,同时增加Ⅱ型胶原及蛋白多糖的表达。结论 三羟基异黄酮可以抑制脂多糖刺激诱导的软骨细胞反分化,对体外培养关节软骨细胞的正常表型具有一定的保护作用,其保护作用与三羟基异黄酮浓度呈现一定的相关性。     

诱导型环氧合酶抑制剂对重组人CD40配体抑制人Ⅰ型胶原α2(Ⅰ)链启动子活性的影响

目的:观察诱导型环氧合酶(COX-2)抑制剂NS-398对重组人CD40配体(rhCD40L)抑制人Ⅰ型胶原α2(Ⅰ)链启动子活性的影响,探讨NS-398治疗AS的可能机制.方法:体外培养人血管平滑肌细胞(VSMCs),人Ⅰ型胶原α2(Ⅰ)链基因启动子重组质粒pCOLH22.4和pCOLH21.6扩增和酶切鉴定后转染VSMCs,用不同浓度rhCD40L (0.1、0.2、0.4 μg/ml)、100 μmol/L NS-398以及rhCD40L(0.4 μg/ml) NS-398(100 μmol/L)作用于转染后细胞, ELISA检测各组细胞CAT目的基因的表达,以未加任何细胞因子或药物处理的成功转染后细胞为对照组.结果:与对照组相比,NS-398增加pCOLH22.4、pCOLH21.6 CAT基因的表达(P《0.05);rhCD40L抑制Ⅰ型胶原基因启动子活性,且呈剂量依赖性,0.4 μg/ml的rhCD40L对启动子活性抑制作用最强(P《0.05);而NS-398可以逆转0.4 μg/ml rhCD40L的抑制作用(P《0.05).结论:NS-398增加Ⅰ型胶原基因启动子活性,在转录水平上促进Ⅰ型胶原的表达;rhCD40L抑制人Ⅰ型胶原α2(Ⅰ)链启动子活性可能与COX-2通路有关.     

NAD对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

目的 探讨烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的作用.方法 提取新生Wistar大乳鼠原代心肌成纤维细胞,传代培养,采用2～4代细胞.实验分为空白对照组,AngⅡ(0.01、0.1、1μmol/L)组,NAD(250 μmol/L)组,AngⅡ(1 μmol/L)+NAD (250 μmol/L)组,FAM组,Sirt1-siRNA+AngⅡ(1μmol/L)组,Sirt1-siRNA组,Sirt1-siRNA+NAD(250 μmol/L)组,Sirt1-siRNA十Ang Ⅱ(1 mol/L)+ NAD(250 μmol/L)组.刺激24h后,提取总RNA,Real time RT-PCR法分别检测SIRT1和Ⅰ型胶原mRNA的表达.结果 心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达随着AngⅡ浓度升高明显增加(P＜0.05),呈浓度依赖性.与空白对照组比较,NAD(250 μmol/L)组SIRT1 mRNA表达增高(P＜0.05).与AngⅡ(1μmol/L)组比较,AngⅡ(1μmol/L)+NAD(250μmol/L)组Ⅰ型胶原mRNA的表达明显减少(P＜0.01).相对于FAM组,Sirt1-siRNA转染后各组SIRT1 mRNA的表达减少(P＜0.05),而心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达增多(P＜0.05).结论 NAD可以抑制心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达,SIRT1影响Ⅰ型胶原mRNA的表达,它们对Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化有保护作用.     

水飞蓟宾对人肝星状细胞LX-2凋亡及α1(Ⅰ)胶原mRNA表达的影响

目的:观察水飞蓟宾对人肝星状细胞LX-2凋亡与a1(Ⅰ)胶原mRNA表达的影响.方法:人肝星状细胞株LX-2分为对照组与实验组,对照组以体积分数10%胎牛血清处理,实验组分别以体积分数10%胎牛血清和终浓度分别为6.25 mg/L、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的水飞蓟宾处理48 h后,应用流式细胞仪Annexin/PI双染方法检测细胞凋亡.应用RT-PCR检测各组细胞α1(Ⅰ)胶原mRNA的表达.结果:12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L水飞蓟宾可促进Lx-2细胞凋亡,细胞凋亡率随水飞蓟宾浓度增加而升高(P<0.05);不同浓度的水飞蓟宾明显降低LX-2细胞α1(Ⅰ)胶原mRNA的表达(P<0.05).结论:水飞蓟宾可促进肝星状细胞凋亡,抑制α1(Ⅰ)胶原mRNA的表达.     

氟对体外培养人牙乳头间充质细胞合成Ⅰ型胶原的影响

目的明确氟对人牙乳头细胞合成Ⅰ型胶原的影响.方法对人牙乳头细胞进行体外培养,分别给予0.0、0.2×10-6、1.0×10-6、5.0×10-6、25.0×10-6g/L氟处理,采用免疫细胞化学方法染色,图象分析氟对细胞合成Ⅰ型胶原的影响.结果Ⅰ型胶原在对照组和4种氟浓度处理组细胞表达均为阳性.图象分析结果表明,4种氟浓度对体外培养的人牙乳头细胞合成Ⅰ型胶原量与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论过量氟对牙本质基质Ⅰ型胶原的影响可能不是通过影响成牙本质细胞内合成实现的.     

AngⅡ对大鼠HSC表达ATR及Ⅰ型前胶原mRNA的影响

目的观察血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)对大鼠肝脏星状细胞(HSC)表达AngⅡ受体(ATR)及Ⅰ型前胶原mRNA的影响,探讨AngⅡ调控HSC分泌胶原的作用途径.方法 HSC分离培养后,采用细胞免疫技术、原位杂交技术及RT-PCR方法分别测定ATR和Ⅰ型前胶原mRNA表达水平.结果培养激活的HSC表达少量的AT1R蛋白和mRNA,10-6 mol/L AngⅡ刺激后AT1R 蛋白表达水平及mRNA转录水平显著升高,同时亦能促进Ⅰ型前胶原mRNA表达;而体外培养激活的HSC不表达AT2R,AngⅡ作用后亦不能刺激其表达.结论 AngⅡ能够促进激活的大鼠HSC表达AT1R,同时增强Ⅰ型前胶原mRNA表达,由此推测HSC表面AT1R的表达水平可能与胶原分泌有关.     

二期骨折愈合中Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达

目的 揭示二期骨折愈合中Ⅰ、Ⅱ型胶原表达的变化规律，加深对骨愈合机制的认识。方法 利用大鼠肌骨二期骨折愈合模型，分别于骨折后3天和1、2、3、4周取材，制片，HE、阿尔新蓝染色及Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果 1周时，免疫组化染色显示Ⅰ、Ⅱ型胶原均有表达。Ⅱ型胶原表达第3周时达峰值，Ⅰ型胶原表达3周后急剧上升，第4周达较高水平。结论 在骨折愈合的不同时期，软骨痂内软骨细胞的组织形态变化以及不同类型胶原的表达均与其修复功能密切相关。     

川芎嗪对IL-1β诱导的兔原代软骨细胞iNOS表达和NO合成的影响

目的观察川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对IL-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的兔原代软骨细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达及一氧化氮(NO)合成的影响。方法体外培养兔软骨细胞,用甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖,免疫荧光检测兔原代软骨细胞Ⅱ型胶原;用IL-1β10 ng/ml和(或)不同浓度(5、10、15、20μg/ml)川芎嗪共培养兔原代软骨细胞48 h后,RT-PCR和免疫组化检测iNOS基因及蛋白表达;用硝酸还原法检测细胞培养上清液NO的表达。结果软骨细胞呈三角形或多角形,蛋白多糖表达于细胞质中,Ⅱ型胶原主要表达于细胞质,少见于细胞核。与对照组比较,IL-1β单独作用软骨细胞iNOS和NO的表达显著增加(P<0.01);IL-1β和川芎嗪联合作用后,软骨细胞iNOS和NO的表达较IL-1β单独作用显著降低(P<0.05,P<0.01),但仍显著高于对照组(P<0.01)。结论川芎嗪能有效抑制IL-1β诱导兔软骨细胞iNOS的表达和NO的合成。     

TGF-β1对新生大鼠心肌成纤维细胞Ⅰ型和Ⅳ型胶原合成的影响

目的:探讨TGF-β1对原代培养的新生大鼠心肌成纤维细胞Ⅰ型与Ⅳ型胶原表达的影响。方法:取出生1-3天的SD大鼠心脏,利用酶消化法结合差速贴壁体外培养心肌成纤维细胞;分别用不同浓度的TGF-β1(10 ng/mL、1ng/mL、0 ng/mL)干预心肌成纤维细胞,于干预后24h采用免疫细胞化学染色法检测Ⅰ型胶原和Ⅳ型胶原的表达。结果:1.以胰酶与Ⅱ型胶原酶合用消化分离新生大鼠心肌成纤维细胞,可将心肌细胞和心肌成纤维细胞分离,心肌成纤维细胞抗波形蛋白(vimen-tin)染色阳性,抗α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)染色阴性。2.用0(对照组)、1、10 ng/mL的TGF-β1干预心肌成纤维细胞24h后,免疫细胞化学染色法发现心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原和Ⅳ型胶原的表达随着TGF-β1浓度的增加而增加。结论:TGF-β1能促进细胞外基质的合成,增强Ⅰ型和Ⅳ型胶原的表达。     

人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型的建立及其意义

目的 建立人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型,观察人正常颈椎椎体和退变颈椎椎体终板软骨细胞的形态及表征.方法 选择2010年7月至2011年7月49例颈椎骨折、脱位(19例)及颈椎病(30例)患者术中取出的颈椎终板软骨,用酶消化法分别分离培养人正常颈椎椎体终板软骨细胞(对照组)和退变颈椎椎体终板软骨细胞(颈椎病组);用倒置显微镜和HE染色法观察细胞形态学变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线;甲苯蓝染色及反转录-PCR(RT-PCR)法对终板软骨细胞进行鉴定;RT-PCR法检测终板软骨细胞特征性基因蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Ⅰ型胶原的表达.结果 人颈椎椎体终板软骨细胞表达特征性蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Ⅰ型胶原,其生长情况及细胞表型类似于关节软骨细胞.对照组原代终板软骨细胞以多角形为主,增殖速度较快;而颈椎病组原代终板软骨细胞以梭形为主,细胞增殖速度较慢.颈椎病组原代终板软骨细胞表达的蛋白多糖基因(0.695 ±0.052)和Ⅱ型胶原基因(0.726 ±0.035)均低于对照组(0.950±0.032、0.907±0.078,t=7.263、3.681,P=0.002、0.021),Ⅰ型胶原基因则高于对照组(0.795±0.028比0.552±0.070,t=-5.560,P=0.005).结论 成功建立了人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型,为椎间盘退变机制研究提供了较好的细胞学基础,解决了以前一直以动物细胞模型为研究对象的局限性.     

吡格列酮调节AngⅡ诱导的血管外膜成纤维细胞增殖及胶原表达

目的 探讨吡格列酮对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管外膜成纤维细胞(AF)增殖以及Ⅰ型胶原表达的调节作用.方法 采用细胞贴壁法培养SD大鼠胸主动脉AF;噻唑蓝(MTT)比色法、流式细胞仪检测吡格列酮对AF增殖及细胞周期的影响.蛋白免疫印迹检测吡格列酮对Ⅰ型胶原表达的调节作用.结果 ①吡格列酮可抑制AngⅡ诱导的AF增殖,呈剂量依赖性,浓度为10×10-6 mol/L时作用最明显 (P＜0.01);②与AngⅡ组比较,吡格列酮可增加AF G0/G1期细胞,减少S期细胞,并同时降低细胞增殖指数 (P＜0.01);③吡格列酮可明显抑制AngⅡ诱导的Ⅰ型胶原表达(P＜0.05).结论 吡格列酮可能通过抑制AF的增殖和Ⅰ型胶原表达发挥其抗血管重构作用.     

干扰素α-2b局部治疗对增生性瘢痕Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及前胶原蛋白基因原位表达作用的研究

目的探讨干扰素α-2b在活体上对增生性瘢痕Ⅰ、Ⅲ型胶原的作用及作用环节.方法对局部注射干扰素α-2b后3天及7天的6例增生性瘢痕应用免疫组织化学和原位杂交技术,进行了Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的原位表达的测定. 结果①干扰素α-2b在局部注射后7天,Ⅰ型胶原蛋白量减少(P＜0.05),但Ⅲ型胶原蛋白量无明显减少(P＞0.05);②干扰素α-2b在局部注射后3天,Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达明显抑制 ,至注射后7天,Ⅰ型前胶原mRNA被进一步抑制,而对Ⅲ型前胶原mRNA抑制缓解.③干扰素α-2b对Ⅰ型前胶原mRNA表达的抑制要比Ⅲ型前胶原mRNA强. 结论干扰素α-2b通过抑制前胶原基因的表达从而抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的合成.     

成骨生长肽羧基端片段及其衍生物G38I对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的探讨成骨生长肽(OGP)羧基端片段[OGP(10~14)]及其衍生物G38I对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响。方法大鼠颅盖骨成骨细胞体外培养至第3代,分别加入10-15~10-7mol/L的OGP(10~14)或G38I,48h后行细胞计数,并用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖情况。细胞分为实验组[OGP(10~14)组和G38I组]及对照组,实验组给予10-11mol/L的药物干预48h。电镜观察细胞超微结构的变化,测定培养上清液碱性磷酸酶(ALP)含量,用免疫组织化学方法比较细胞中Ⅰ型胶原蛋白含量的变化,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定细胞中核结合因子a1(Cbfa1)和Ⅰ型胶原mRNA表达水平的变化。结果在较低浓度时,随药物浓度升高,OGP(10~14)和G38I促进细胞数增加、提高细胞活性的作用增强,10-11mol/L药物作用时成骨细胞数分别为37×104/ml和30×104/ml,进一步升高药物浓度反而抑制细胞增殖。电镜下实验组细胞粗面内质网发达,胞质中有大量分泌囊泡。对照组细胞囊泡中可见钙盐结晶。OGP(10~14)组和G38I组与对照组比较,细胞培养上清液ALP含量高(4·47U/g、3·82U/g vs2·21U/g),细胞中Ⅰ型胶原蛋白含量多,Cbfa1和Ⅰ型胶原mRNA表达水平较高,差异均具有统计学意义(P<0·01,P<0·05)。结论OGP(10~14)及其衍生物G38I具有与OGP全长肽相同的促进成骨细胞增殖、提高细胞活性的作用,OGP(10~14)和G38I可上调成骨细胞Cbfa1和Ⅰ型胶原mRNA表达水平,增加细胞中Ⅰ型胶原的合成,促进细胞分化和成骨作用。     

人鼠同源Ⅰ型胶原siRNA及表达载体的构建

目的 针对Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)链设计、构建人鼠同源的Ⅰ型胶原siRNA(COL1A1-siRNA)及其表达载体,并证实其有效性.方法 利用软件设计人鼠完全同源的一对Ⅰ型胶原siRNA序列,并构建其表达载体.直接将Ⅰ型胶原siRNA和构建的质粒转染至大鼠系膜细胞,利用KT-PCK方法观察对系膜细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的抑制作用.结果 Ⅰ型胶原siRNA转染至大鼠系膜细胞后,与空白对照组及MOCK组比较,能够抑制Ⅰ型胶原的表达.其质粒对Ⅰ型胶原表达的抑制作用更加显著,呈剂量依赖性.结论 所设计的Ⅰ型胶原siRNA为人与大鼠完全同源的siRNA序列,所有碱基完全匹配.可以成功转染到大鼠系膜细胞,并有效抑制Ⅰ型胶原在细胞内的表达.质粒载体的方法同样能够抑制Ⅰ型胶原的形成,而且表达更稳定,作用更显著.