原发性膝骨关节病中血清相关生物标志物的表达

背景:近年来随着分子生物学的不断发展,反映关节软骨早期退变等有关病理变化的实验室指标已是研究的热点问题。目的:探讨C-末段交叉连接的Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白在原发性膝骨关节病患者中的临床意义,寻求原发性膝骨关节病特征规律与C-末段交叉连接的Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白的相关性。方法:纳入膝骨关节病组患者70例,健康志愿者18例设为对照组,采用酶联免疫夹心法检测两组血清中C-末段交叉连接的Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白的水平。结果与结论:原发性膝骨关节病患者血清中C-末段交叉连接的Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白均明显高于对照组,进一步深入研究发现在不同的性别、年龄及X射线的变化中均存在显著性差异,不同中医证型中风寒湿痹型患者C-末段交叉连接的Ⅱ型胶原明显低于肝肾亏虚型和气滞血瘀型患者,而软骨寡聚基质蛋白间比较差异无显著性意义。说明C-末段交叉连接的Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白与膝骨关节炎的发生发展有着密切关系,两者联合应用能显著提高诊断的准确性,在膝骨关节炎的发病机制中具有重要的作用,与软骨的退变密切相关,并且可以反映病情、证型等变化。     

原发性膝骨关节病中血清相关生物标志物的表达

背景：近年来随着分子生物学的不断发展,反映关节软骨早期退变等有关病理变化的实验室指标已是研究的热点问题。目的：探讨C-末段交叉连接的Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白在原发性膝骨关节病患者中的临床意义,寻求原发性膝骨关节病特征规律与C-末段交叉连接的Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白的相关性。方法：纳入膝骨关节病组患者70例,健康志愿者18例设为对照组,采用酶联免疫夹心法检测两组血清中C-末段交叉连接的Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白的水平。结果与结论：原发性膝骨关节病患者血清中C-末段交叉连接的Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白均明显高于对照组,进一步深入研究发现在不同的性别、年龄及X射线的变化中均存在显著性差异,不同中医证型中风寒湿痹型患者C-末段交叉连接的Ⅱ型胶原明显低于肝肾亏虚型和气滞血瘀型患者,而软骨寡聚基质蛋白间比较差异无显著性意义。说明C-末段交叉连接的Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白与膝骨关节炎的发生发展有着密切关系,两者联合应用能显著提高诊断的准确性,在膝骨关节炎的发病机制中具有重要的作用,与软骨的退变密切相关,并且可以反映病情、证型等变化。     

电针对实验性膝骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡及软骨基质的影响

目的:观察电针对膝骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡及软骨基质的影响,探讨电针治疗膝骨关节炎的作用机制。方法:将2月龄清洁级雄性SD大鼠40只,适应性喂养1周后,采用随机数字表法分为空白组10只和造模组30只。造模组在第1、4、7天双膝关节腔注射0.2 m L 4%木瓜蛋白酶。造模成功后,采用随机数字表法分为模型组、电针15 min组(EA15组)和电针30 min组(EA30组)3组,每组10只。EA 15组给予电针治疗15 min/(次·d),5次/周;EA 30组给予电针治疗30 min/(次·d),5次/周;空白组和模型组不给予任何治疗。8周后,处死动物,腹主动脉采血,ELISA法测定Ⅱ型胶原(collagenⅡ)C端肽(CTXⅡ)和Ⅱ型胶原C前肽(CPⅡ);取大鼠右侧胫骨平台内侧软骨组织于4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋,TUNEL法检测软骨细胞凋亡情况;甲苯胺蓝染色观察软骨基质糖胺聚糖的变化;免疫组化染色观察collagenⅡ变化;左侧胫骨平台软骨组织迅速置入液氮中保存,分别用RT-PCR和Western blot检测Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组软骨细胞凋亡率明显升高(P0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白表达降低(P0.05),Bax mRNA和蛋白表达升高(P0.05);糖胺聚糖含量减少,collagenⅡ蛋白表达降低(P0.05),血清CTXⅡ显著升高(P0.05),CPⅡ显著降低(P0.05)。与模型组比较,电针组均能显著降低软骨细胞凋亡率(P0.05),增加Bcl-2 mRNA和蛋白表达(P0.05),降低Bax mRNA和蛋白表达(P0.05);增加糖胺聚糖含量和collagenⅡ蛋白表达(P0.05),下调CTXⅡ(P0.05),上调CPⅡ水平(P0.05)。结论:电针治疗膝骨关节炎的作用机制是通过降低软骨细胞凋亡和减轻关节软骨基质破坏,进而减缓关节软骨退变。     

骨关节炎患者线粒体转录因子A表达与线粒体DNA拷贝数关系的研究

目的研究膝关节骨关节炎患者与正常人外周血及关节软骨细胞中的线粒体转录因子A(TFAM)表达和线粒体DNA拷贝数的关系,探讨其相关性。方法选择20例的膝关节骨关节炎患者为骨关节炎组,以正常关节软骨患者20例为对照组。各收集其外周血及关节软骨细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及实时荧光PCR(SYBR GREEN I染料法)检测外周血及软骨组织中TFAM mRNA的表达水平和软骨细胞线粒体DNA拷贝数。结果骨关节炎组外周血和软骨细胞TFAM mRNA的表达量均低于正常组患者(P0.05),且二者表达量呈正相关(P0.01);骨关节炎组线粒体DNA的平均拷贝数均于正常组患者软骨细胞(P0.01),且与软骨细胞TFAM mRNA的表达量呈正相关(P0.01)。结论 TFAM通过增加其线粒体DNA拷贝数,这将可以对骨关节炎的病因提出新的解释和补充,可能为骨关节炎的检测和治疗提供新的途径。     

体外阻断基质细胞衍生因子1/CXC趋化因子受体4信号通路后人关节软骨组织Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达

背景：基质细胞衍生因子1/CXC趋化因子受体4信号通路在骨关节炎的发病中起关键作用。目的：探讨AMD3100体外阻断基质细胞衍生因子1/CXC趋化因子受体4信号通路后对培养的关节软骨组织Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达及Ⅱ型胶原蛋白表达的影响。方法：将骨关节炎软骨和创伤性截肢患者正常软骨分别分为3个小组即实验组,实验对照组,空白对照组。将其置于含基质细胞衍生因子1和AMD3100,含基质细胞衍生因子1和MAB310,只含基质细胞衍生因子1的培养液培养。结果与结论：实验组软骨组织内的Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达量、Ⅱ型胶原蛋白含量高于实验对照组和空白对照组（P〈0.05）。可见基质细胞衍生因子1通过基质细胞衍生因子1/CXC趋化因子受体4信号通路诱导人关节软骨中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的降解;AMD3100可阻断该信号通路及减少软骨中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的降解,延缓关节软骨组织的退变;AMD3100不能使已退变的骨关节炎软骨内的Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖含量恢复到正常水平。     

低频脉冲超声干预膝骨关节炎模型兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达

背景:研究表明,低频脉冲超声能促进全层关节软骨缺损修复,延缓实验性早期骨关节炎的病变进展。水通道蛋白3存在于关节软骨及滑膜上,并在骨关节炎的发病机制中发挥重要作用。目的:探讨低频脉冲超声对实验性膝骨关节炎兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3表达的影响。方法:成年新西兰兔左后膝关节用管型石膏固定于伸直位制动6周制备实验性兔膝关节骨关节炎模型,造模成功后随机分为两组:实验组予以低频脉冲超声治疗(频率为1MHz,功率为2.0W),1次/d,15min/次;对照组不接受超声治疗。分别于治疗后2,4,8周,采用免疫组织化学方法观察兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达。结果与结论:随着造模后时间的延长,各组兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达均有所增加;与对照组比较,实验组兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3表达明显降低(P<0.01)。说明低频脉冲超声能降低实验性兔膝骨关节炎关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达,从而缓解关节肿胀,延缓软骨及滑膜的退变,具有软骨及滑膜保护作用。     

骨关节炎关节软骨细胞中低氧诱导因子2α及血管内皮生长因子的表达

背景:已有研究发现血管内皮生长因子及低氧诱导因子参与了骨关节炎的发生发展过程,但两者的相关性研究鲜有报道。目的:分析低氧诱导因子2α和血管内皮生长因子在膝骨关节炎患者关节软骨细胞中的表达及相关性。方法:临床收集50例严重膝关节炎接受全膝关节置换患者的膝关节软骨组织标本,根据关节KellgrenLawrance(K-L)X射线分级标准进行分组,其中K-LⅢ级组18例,K-LⅣ级组32例;另取10例因下肢肿瘤或车祸而截肢患者的正常膝关节(K-L分级均为0级)软骨组织标本作为对照组。在苏木精-伊红和Safranin OFast Green染色下进行Mankin整体评分比较各组关节软骨退变程度,免疫组织化学染色检测关节软骨组织细胞中低氧诱导因子2α和血管内皮生长因子的表达,并比较它们的相关性。结果与结论:K-LⅣ级组Mankin整体评分高于K-LⅢ级组和K-L 0级组。免疫组织化学染色显示K-LⅣ级组关节软骨细胞中低氧诱导因子2α和血管内皮生长因子的阳性细胞计数均高于K-LⅢ组和K-L 0级(P<0.05)。低氧诱导因子2α和血管内皮生长因子蛋白在骨关节炎患者关节软骨细胞中表达明显增加,提示低氧诱导因子2α可能上调了靶基因血管内皮生长因子的表达,从而加速了骨关节炎的发生发展。     

转腺病毒-人骨形态发生蛋白7软骨细胞分泌的透明质酸和Ⅱ型胶原

背景：软骨细胞自身分裂能力不强和去分化现象限制了其在组织工程中的应用。目的：观察腺病毒-骨形态发生蛋白7转染兔软骨细胞后骨形态发生蛋白7的表达及其对软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸功能的影响。方法：包装骨形态发生蛋白7腺病毒载体,将其转染至兔第2代软骨细胞。检测骨形态发生蛋白7mRNA及蛋白的表达;检测软骨细胞中Ⅱ型胶原和透明质酸的变化。结果与结论：转染腺病毒-骨形态发生蛋白7后48,72h,RT-PCR和Western blot方法显示软骨细胞表达的骨形态发生蛋白7mRNA和蛋白均明显增加,RT-PCR和ELISA显示软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原和透明质酸也显著增加。说明应用腺病毒可成功将骨形态发生蛋白7转染至兔软骨细胞,并能促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸。     

碱性成纤维细胞生长因子对人椎间盘细胞外基质合成及软骨调节素表达的影响

目的研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人椎间盘细胞基质合成能力以及血管生长抑制因子软骨调节素-1(ChM-1)表达的影响,为椎间盘退变的生物学治疗提供可供参考的生长因子。方法取4 例因腰椎间盘退变性疾病而于本院行腰椎间盘切除手术患者的椎间盘组织,分别进行髓核和纤维环细胞培养及表型鉴定。取传代细胞继续培养1 周后,向培养基中加入不同浓度的bFGF(0, 0.1 ng/ml, 1 ng/ml 和10 ng/ml),72 h 后收集细胞。采用Real-time RT-PCR 检测各组细胞中Aggrecan 和Ⅱ型胶原mRNA表达情况;同时利用Real-time RT-PCR和Western blot 方法检测bFGF 对ChM-1 mRNA和蛋白表达的影响。结果bFGF 可明显抑制人椎间盘细胞外基质成分Aggrecan 和Ⅱ型胶原mRNA的表达(P<0.05)。Real-time RT-PCR和Western blot 方法均提示bFGF 可抑制ChM-1 的表达水平(P<0.05),并具有剂量依赖性。结论bFGF 在发挥分解代谢功能的同时还具有潜在的促进血管生长作用。     

转腺病毒-人骨形态发生蛋白7软骨细胞分泌的透明质酸和Ⅱ型胶原

背景:软骨细胞自身分裂能力不强和去分化现象限制了其在组织工程中的应用。目的:观察腺病毒-骨形态发生蛋白7转染兔软骨细胞后骨形态发生蛋白7的表达及其对软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸功能的影响。方法:包装骨形态发生蛋白7腺病毒载体,将其转染至兔第2代软骨细胞。检测骨形态发生蛋白7mRNA及蛋白的表达;检测软骨细胞中Ⅱ型胶原和透明质酸的变化。结果与结论:转染腺病毒-骨形态发生蛋白7后48,72h,RT-PCR和Western blot方法显示软骨细胞表达的骨形态发生蛋白7mRNA和蛋白均明显增加,RT-PCR和ELISA显示软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原和透明质酸也显著增加。说明应用腺病毒可成功将骨形态发生蛋白7转染至兔软骨细胞,并能促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸。     

Evidence for altered synthesis of type II collagen in patients with osteoarthritis.

There is evidence to suggest that the synthesis of type II collagen is increased in osteoarthritis (OA). Using an immunoassay, we show that the content of the C-propeptide of type II procollagen (CPII), released extracellularly from the newly synthesized molecule, is directly related to the synthesis of this molecule in healthy and osteoarthritic articular cartilages. In OA cartilage, CPII content is often markedly elevated (mean 7.6-fold), particularly in the mid and deep zones, reaching 29.6% of the content in newborn. Synthesis is also directly related to total collagen II content in OA, suggesting its importance in maintaining collagen content and cartilage structure. The release of CPII from cartilage is correlated directly with cartilage content. However, the increase in CPII in OA cartilage is not reflected in serum, where a significant reduction is observed. Together these studies provide evidence for alterations in procollagen II synthesis in vivo in patients with OA.     

p16INK4a蛋白在正常及骨关节炎关节软骨细胞中的表达及差异分析

背景在诸多老化和衰老的研究中,p16INK4a是研究较多的一种产物,然而其在与衰老密切相关的骨性关节炎中的研究较少.目的观察p16INK4a在正常和骨性关节炎软骨细胞中的表达,讨论其在骨性关节炎病理过程中的作用.设计以诊断为依据设立对照的实验研究.地点和对象实验在北京大学第三医院骨科完成,对象为骨性关节炎软骨标本,取材于在北京大学第三医院骨科手术的膝骨关节炎患者.正常老年、中年及青年组软骨标本分别取自无骨性关节炎患者.干预直接从软骨组织中提取蛋白和细胞的总RNA,分别进行Westernblot和RT-PCR分析,检测p16INK4a在年轻、中年、正常老年人及骨性关节炎患者软骨中的表达情况.对p16INK4a下游底物pRb的磷酸化状态也进行了蛋白表达的分析.主要观察指标p16INK4a在蛋白水平及mRNA水平上的表达.结果在关节软骨细胞中,p16INK4a的表达随着年龄的增长,其表达量也逐渐增多;相应地,p16INK4a的主要靶物质pRb的磷酸化明显减少,相反非磷酸化的pRb的含量则相对增高.与正常人相比,这些变化在骨性关节炎的软骨细胞中尤为显著.结论p16INK4a/pRb途径可能在关节软骨细胞的老化及骨性关节炎的发病过程中具有一定的调节作用.p16INK4a表达的升高以及随后的pRb磷酸化状态的丢失可能参与了关节软骨细胞的老化及骨性关节炎的发生.     

关节腔注射羧甲基壳聚糖对兔骨关节炎关节软骨MMP-1，-3 mRNA表达的影响

目的观察关节腔注射羧甲基壳聚糖(CMCTS)对骨关节炎(OA)模型中关节软骨退变及软骨中基质金属蛋白酶1,3(MMP1,3)mRNA表达的影响。方法16只大耳白兔行单侧前交叉韧带切断术,术后5周将动物随机分为2组,每组8只,实验组关节腔注射2%CMCTS0.3ml,每2周1次,共注射3次,对照组不注射任何药物。术后11周处死动物,比较各组股骨内髁关节软骨的大体变化,采用RTPCR方法检测软骨中MMP1和MMP3的mRNA表达。结果实验组软骨退变程度较对照组明显减轻,实验组软骨MMP1和MMP3的mRNA表达明显低于对照组(P<0.01)。结论关节腔注射CMCTS能够明显抑制OA软骨中MMP1和MMP3mRNA的表达,明显减轻软骨退变的程度,对软骨有一定保护作用。     

透明质酸钠对兔创伤性骨关节炎软骨诱导一氧化氮合酶mRNA表达的干预

背景各种关节损伤、关节手术后导致的创伤性骨关节炎较为常见,关节腔注射透明质酸钠已被视为一种治疗骨关节炎的有效手段.目的以前交叉韧带切断的方法建立兔创伤性骨关节炎模型,观察关节腔注射透明质酸钠对其关节软骨中诱导型一氧化氮合酶mRNA表达水平的影响.设计随机对照动物实验.单位武汉大学人民医院骨科.材料实验于2003-04/12在武汉大学人民医院骨科实验室完成.选取清洁级5～6月龄大耳白兔16只,随机数字表法分为透明质酸钠注射组、生理盐水对照组,8只/组.透明质酸钠(上海建华精细生物制品有限公司提供,国药准字2000第366095号).方法①两组均建立创伤性骨关节炎模型.每只兔以氯胺酮1.0 mg/kg体质量麻醉,单侧膝关节行前交叉韧带切断造模.②术后第5周,透明质酸钠注射组患膝关节腔注射质量浓度为10 g/L的透明质酸钠0.3 mL,1次/周,连续5周.生理盐水对照组注射等量生理盐水.③术后10周处死,观察两组股骨内髁关节软骨的大体形态学(0分关节面光滑,色泽正常;1分关节面粗糙,有小的裂隙,色泽灰暗;2分关节面糜烂,软骨缺损达软骨表层或中层;3分关节面溃疡形成,缺损达软骨深层;4分软骨剥脱,软骨下骨质暴露)和组织学病理变化,采用反转录聚合酶链反应方法检测软骨诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达情况.主要观察指标①两组股骨髁关节面标本大体观察结果.②两组股骨内髁软骨光镜组织学观察结果.③两组软骨诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达.结果实验选取清洁级大耳白兔16只,全部进入结果分析.①两组股骨髁关节面标本大体观察结果解剖显微镜下观察股骨髁关节面病理变化,透明质酸钠注射组软骨退变程度较生理盐水对照组明显减轻.②两组股骨内髁软骨光镜组织学观察结果透明质酸钠注射组见软骨膜变性脱落,表层软骨细胞变性、坏死、排列紊乱,形成糜烂;生理盐水对照组见软骨细胞变性、坏死,排列紊乱,溃疡病变达软骨深层,并见新生的毛细血管和成纤维细胞增生,溃疡底部见纤维组织增生.③两组软骨诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达透明质酸钠注射组软骨诱导型一氧化氮合酶mRNA表达量均值为1.09±0.18,生理盐水对照组的表达量均值为1.26±0.23,两组基本相似(P＞0.05).结论关节腔注射透明质酸钠对早期骨关节炎软骨具有修复和保护作用,能有效减轻早期创伤性骨关节炎关节软骨的退变,对诱导型一氧化氮合酶的表达没有下调作用.     

关节软骨损伤后体外培养软骨细胞的功能变化

背景：关节软骨损伤可以影响软骨细胞功能,诱发创伤性骨关节炎。目的：观察关节软骨损伤后体外培养的软骨细胞功能的变化。方法：通过酶消化法分离培养高能量、低能量撞击后和正常兔膝关节透明软骨细胞,观察创伤能量对软骨细胞生存能力的影响;检测软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原能力,检测细胞中白细胞介素1β和核转录因子κB mRNA表达水平,检测细胞合成白细胞介素1β和基质金属蛋白酶1的表达。结果与结论：高能量和低能量关节软骨损伤后,软骨细胞的存活率下降,原代细胞的贴壁细胞数量减少,贴壁时间延长,生长曲线下移,细胞甲苯胺蓝染色异染反应减弱,Ⅱ型胶原免疫组化染色强度减弱,软骨细胞中白细胞介素1β和核转录因子κB mRNA表达水平上升,细胞培养液中白细胞介素1β和基质金属蛋白酶1的质量浓度升高,其中高能量组效果更为显著（P〈0.05）。说明关节软骨损伤后软骨细胞的功能受到影响,受损程度与创伤强度及炎性细胞因子的表达相关。     

Expression of 92-kD type IV collagenase/gelatinase (gelatinase B) in osteoarthritic cartilage and its induction in normal human articular cartilage by interleukin 1.

We report here that a 92-kD gelatinolytic metalloproteinase is expressed as protein and mRNA in human osteoarthritic cartilage, but not in normal adult articular cartilage. Western immunoblotting demonstrated that the 92-kD gelatinolytic activity corresponded to 92-kD type IV collagenase/gelatinase (gelatinase B); mRNA for gelatinase B was identified by Northern blotting. Chondrocytes from normal cartilage also exhibited mRNA for 72-kD type IV collagenase/gelatinase (gelatinase A), tissue collagenase, and stromelysin-1, and these mRNAs were increased in osteoarthritic cartilage. Regional analysis of osteoarthritic cartilage samples from four individuals revealed that gelatinase B mRNA was expressed in grossly fibrillated areas; two of four nonfibrillated cartilage samples failed to exhibit the mRNA, but did have increased levels of mRNA for other neutral metalloproteinases. IL-1 alpha treatment of normal human cartilage explants or isolated chondrocytes induced increased levels of gelatinase B and increased mRNA for tissue collagenase and stromelysin-1. Under identical conditions, mRNA levels for gelatinase A were not increased indicating that regulation of this enzyme in human articular chondrocytes is distinct from that of other metalloproteinases. Our data showing expression of gelatinase B in fibrillated cartilage suggest that it is a marker of progressive articular cartilage degradation in osteoarthritis.