人脐带间充质干细胞、人脐带间充质干细胞源男性生殖细胞样细胞的免疫学特性

目的研究人脐带间充质干细胞(huMSCs)及其诱导分化为男性生殖细胞样细胞后的免疫学特性,为进一步研究huMSCs的移植特性提供实验依据。方法分离培养huMSCs,在男性生殖细胞培养条件下定向诱导其分化为huMSCs源男性生殖细胞样细胞。采用FACScan流式细胞仪检测诱导前后huMSCs表面抗原CD40、CD40L、CD80、CD86。半定量反转录(RT)-PCR检测诱导前后huMSCs的人类白细胞抗原(HLA)-Ⅰ、HLA-DR基因表达水平。采用CCK-8法检测诱导前后的不同数量级huMSCs对混合淋巴细胞反应体系中经植物血凝素(PHA)激活的同种异体外周血淋巴细胞(PBMC)增殖的影响。采用酶联免疫吸附试验检测诱导前后huMSCs对经PHA活化的T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)的影响。结果 HuMSCs在男性生殖细胞培养条件下能分化为男性生殖细胞样细胞,诱导前后的huMSCs均表达HLA-Ⅰ,不表达CD40、CD40L、CD80、CD86和HLA-DR。huMSCs能抑制经PHA激活的T淋巴细胞增殖,并抑制T淋巴细胞IFN-γ的分泌,但huMSCs源男性生殖细胞样细胞并不能抑制经PHA激活的T淋巴细胞增殖及IFN-γ的分泌。结论 HuMSCs在体外定向诱导为男性生殖细胞样细胞后,诱导后的细胞与huMSCs一样具有低免疫源性,同时huMSCs在体外具有免疫抑制性,但诱导获得的huMSCs源男性生殖细胞样细胞不能抑制T细胞的增殖。     

静脉免疫球蛋白对新生儿脐带血淋巴细胞免疫抑制机制的研究

目的从脐带血单个核细胞(CBMC)和CD3^ T淋巴细胞膜表面CD25、CD45RA、CD45RO分子表达的角度,探讨静脉免疫球蛋白(IVIG)对新生儿免疫功能的抑制机制。方法利用IVIG和植物血凝素(PHA)不同组合对CBMC或CD3^ T淋巴细胞进行刺激培养,再利用四色免疫荧光抗体标记-流式细胞技术检测细胞表面CD25、CD45RA、CD45RO分子的表达情况。结果IVIG可以抑制PHA诱导的CBMC的活化,表现为CD25分子表达的明显抑制;并且随着CD25分子表达的抑制,CD4^ 细胞表面的CD45RO分子的表达也被抑制,阻止了CBMC中的CD4^ CD45RA^ 细胞向CD4^ CD45RO^ 细胞转换。IVIG也可以抑制PHA诱导的脐带血CD3^ T淋巴细胞CD25分子和CD45RO分子的表达,但这种抑制程度远远不如对CBMC作用明显。结论IVIG可以抑制脐带血T淋巴细胞的活化过程,这种抑制作用除了与IVIG对T淋巴细胞的直接作用外,还可能通过了其他免疫细胞或免疫分子的间接介导。IVIG对CD4^ CD45RO^ T淋巴细胞的抑制作用可能是IVIG抑制B淋巴细胞免疫球蛋白释放的重要机制之一。新生儿期应用IVIG有可能使免疫功能低下加重。     

再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞免疫调节特性和造血支持作用的研究

目的研究再生障碍性贫血(AA)患儿骨髓间充质干细胞(MSCs)的免疫调节特性和支持造血的功能。方法从AA患儿和成人骨髓中分离、培养、扩增MSCs,用流式细胞仪测定免疫标记;用3H-TdR法检测PHA刺激后,正常淋巴细胞转化以及MSCs对转化的影响;用造血祖细胞集落培养法(CFU-c)检测MSCs对造血的支持作用。结果从AA患儿骨髓中分离得到了MSCs,与正常骨髓MSCs具有相似的细胞形态和表面标志,但其增殖能力低于正常骨髓MSCs。AA-MSCs体外可抑制脐血淋巴细胞的转化,其抑制能力随细胞数量增加而增强,但与正常骨髓MSCs相比,抑制作用较弱。AA-MSCs体外可以支持脐血造血细胞的生长,但其支持能力只有正常骨髓MSCs的一半。结论AA-MSCs与正常MSCs虽体外生长形态相似,但传代能力、免疫抑制力及对造血集落生长的支持作用均较正常骨髓MSCs减低,提示间充质干细胞参与再生障碍性贫血的发病机制。     

体外活化脐血免疫活性细胞输注治疗小儿急性淋巴细胞白血病微量残留病疗效观察

目的　观察体外激活培养的脐血免疫活性细胞对急性淋巴细胞白血病患儿微量残留病 (MRD)的免疫治疗作用。方法　收集无菌ACD抗凝脐血 ,进行单个核细胞分离与植物血凝素 (PHA)培养 ,采用APAAP免疫组化方法进行PHA激活培养前后CD3、CD4、CD8测定。应用ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF α) ,利用PCR法对克隆性重排的T细胞受体 (TCR)基因进行MRD测定。结果　①脐血经Ficoll分离、PHA激活培养后 ,其中淋巴细胞占优势 ;②激活后脐血中表达CD3、CD4、CD8抗原淋巴细胞比例增高 ;③PHA激活前脐血TNF α <10ng/L ,激活后TNF α维持在较高水平 ,超过 6 0 0ng/L ;④ 6例ALL患儿输注前MRD均阳性 ,有 3例经多次输注 ,1年后外周血、骨髓中MRD全部阴性 ,余 3例外周血MRD消失 ,骨髓中MRD减少。在输注过程中有 2例出现寒战、体温上升 ,1例出现皮疹。结论　体外活化脐血免疫活性细胞多次输注后MRD可减少、消失 ;这可能与活化免疫细胞能够分泌抗肿瘤细胞因子有关     

抗CD44抗体对激活的T淋巴细胞介导的白血病细胞的细胞毒作用的影响

目的　研究抗CD4 4抗体对正常人T淋巴细胞增殖及对T淋巴细胞介导的急性髓性白血病细胞的细胞毒作用的影响。方法　利用 [3H]TdR掺入法检测T淋巴细胞的DNA合成 ;利用双染色 流式细胞仪法检测T淋巴细胞介导的白血病细胞的细胞毒作用。结果　单独抗CD4 4抗体对IL 2激活的T淋巴细胞的DNA合成无明显影响 ,但协同抗CD2 抗体后明显增强了抗CD2 抗体对IL 2激活的T淋巴细胞DNA合成的抑制。单独抗CD4 4抗体即可抑制IL 2激活的T淋巴细胞介导的白血病细胞的细胞毒作用 ,协同抗CD2 抗体后对IL 2激活的T淋巴细胞介导的白血病细胞的细胞毒作用的抑制更加明显。结论　CD4 4的交联所导致的阴性信号传入而引起的T淋巴细胞增殖的抑制可能是通过CD2 交联而诱导的。抗CD4 4抗体和抗CD2 抗体对T淋巴细胞所介导的白血病细胞的细胞毒作用的抑制可能与其部分地封闭了CD4 4分子和CD2 分子的表达以及与干扰了Fas FasL的结合有关     

溴隐亭对植物血凝素诱导活化T淋巴细胞的影响

目的 研究溴隐亭(BRC)对植物血凝素(PHA)诱导活化T淋巴细胞的影响.方法 用泌乳素(PRL)与BBC单独和联合刺激培养PHA诱导活化的CD4 T淋巴细胞系Jurkat E6-1细胞,利用实时聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测活化T淋巴细胞重要信号分子转接蛋白(LAT)、T细胞受体相关的相对分子质量为70000的蛋白激酶ζ链(ZAP-70)mRNA表达变化情况;利用Real time-PCR方法检测活化T淋巴细胞自身PRL mRNA表达变化情况;利用流式细胞术检测T淋巴细胞活化早期表面标志细胞分化抗原CD25分子表达变化情况;利用脂质体转染荧光素酶报告系统检测T淋巴细胞活化的核转录因子-kB(NF-kB)活性变化情况.结果 1.BRC可抑制PHA诱导的T淋巴细胞活化和PRL-泌乳素受体(PRLR)信号转导途径的共同信号分子ZAP-70 mRNA及活化T淋巴细胞自身PRL mRNA的表达;2.BRC促进了活化T淋巴细胞信号分子LAT mRNA和活化T淋巴细胞表面CD25分子的表达;3.BRC抑制了PHA诱导的活化T淋巴细胞核NF-kB活性.结论 BRC可通过抑制T淋巴细胞活化和PRL-PRLR途径中的共同信号分子ZAP-70及活化T淋巴细胞自身PRL mRNA分泌,对T淋巴细胞活化发挥抑制作用.     

高氧致新生大鼠肺损伤过程中T淋巴细胞动态变化的研究

目的探讨高氧致新生大鼠肺损伤过程中T淋巴细胞的动态变化。方法新生12 h内的SD大鼠随机分为对照组、高氧组,对照组置于正常空气中喂养,高氧组持续暴露于80%～85%氧浓度下。两组分别于第1、4、7、14、21天时提取肺脏、脾脏和胸腺,以常规组织学方法观察肺脏形态结构变化;运用常规计数法检测脾脏中淋巴细胞数量变化;采用流式细胞术检测脾脏中CD4+、CD8+T细胞的百分比变化;以混合淋巴细胞反应检测脾淋巴细胞对植物血凝素(PHA)和自身肺组织的增殖反应;用常规组织学和免疫组织化学法观察胸腺形态结构变化及增殖细胞核抗原表达和CD4+、CD8+细胞分布。结果实验4 d时,高氧组CD4+、CD8+淋巴细胞百分比较对照组明显增多(P<0.01),7 d时CD4+淋巴细胞百分比明显高于对照组(P<0.01),此后CD4+、CD8+淋巴细胞百分比逐渐下降,到实验21 d时接近对照组。淋巴细胞活检发现,实验4～7 d时,脾淋巴细胞对自身肺组织和对PHA刺激的增殖反应活性较对照组均明显增高(P均<0.01);14～21 d时,脾淋巴细胞对自身肺组织刺激的增殖反应活性逐渐下降,但均明显高于对照组(P均<0.01),而对PHA刺激后...     

Isolation,culture and detection of molecular marker of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood and umbilical cord

目的 探讨从人脐带血及脐带分离和培养间充质干细胞(MSCs)的方法,并分析MSCs的表面标记.方法 人脐带血按常规方法制备单个核细胞,利用MSCs贴壁生长的特性,经培养、换液、传代纯化MSCs;分离脐带华尔通胶(Wharton＇s jelly),采用组织块贴壁法获得脐带MSCs并传代.将传代的MSCs冻存,1个月后再复苏,观察复苏后MSCs的生长情况.利用FACScan流式细胞仪检测脐带血及脐带细胞表面抗原.结果 经过传代后,贴壁细胞形态趋于同一.人脐血及脐带MSCs体外生长形态相似,类似成纤维细胞,可以稳定增殖和传代.经冷冻保存,复苏后仍能较好生长.人脐血及脐带来源的MSCs表面标记CD29、CD44、CD59高表达,而表面标记CD14、CD33、CD34和CD45低表达.结论 人脐带血及脐带均可分离出MSCs,在体外能扩增纯化及冻存复苏,为组织工程提供丰富的细胞来源.     

人脐血及脐带间充质干细胞的分离培养及表面标记分析

目的探讨从人脐带血及脐带分离和培养间充质干细胞(MSCs)的方法,并分析MSCs的表面标记。方法人脐带血按常规方法制备单个核细胞,利用MSCs贴壁生长的特性,经培养、换液、传代纯化MSCs;分离脐带华尔通胶(Wharton’s jelly),采用组织块贴壁法获得脐带MSCs并传代。将传代的MSCs冻存,1个月后再复苏,观察复苏后MSCs的生长情况。利用FACScan流式细胞仪检测脐带血及脐带细胞表面抗原。结果经过传代后,贴壁细胞形态趋于同一。人脐血及脐带MSCs体外生长形态相似,类似成纤维细胞,可以稳定增殖和传代。经冷冻保存,复苏后仍能较好生长。人脐血及脐带来源的MSCs表面标记CD29、CD44、CD59高表达,而表面标记CD14、CD33、CD34和CD45低表达。结论人脐带血及脐带均可分离出MSCs,在体外能扩增纯化及冻存复苏,为组织工程提供丰富的细胞来源。     

抗CD44抗体对激活的T淋巴细胞介导的白血病细胞毒作用的影响

目的：研究抗CD44抗体对正常人T淋巴细胞增殖及对T淋巴细胞介导的生髓性白血病细胞的细胞毒作用的影响。方法：利用[^3h]TdR掺入法检测T淋巴细胞的DNA合成，利用双染色－流式细胞仪法检测T淋巴细胞介导的白血病细胞的细胞毒作用。结果：单独抗CD44抗体对IL－2激活的T淋巴细胞的DNA合成无明显影响，但协同抗CD2抗体后明显增强了抗CD2抗体对IL－2激活的T淋巴细胞DNA合成的抑制，单独抗CD44抗体即可抑制L－2知的T淋巴细胞介导的白血病细胞的细胞毒作用，协同抗CD2抗体后对IL－2激活的T淋巴细胞介导的白血病细胞的细胞毒作用的抑制更加明显。结论：CD44的交联所导致的阴性信号传入而引起的T淋巴细胞增残的抑制可能是通过CD2交联而导的。抗CD44抗体和抗CD2抗体对T淋巴细胞所介导的白血病细胞匠细胞毒作用的抑制可能与其部分地封闭了CD44分子和CD2分子的表达以及与干扰了Fas-FasL的结合有关。     

不同气体条件对腹膜形态影响的实验研究

目的 在体实验研究提示,CO2气腹后,腹膜结构出现改变.本实验研究不同气体条件对腹膜形态的影响,探讨CO2气腹对腹腔肿瘤细胞影响的潜在机制.方法 在体实验:乳猪14头,年龄7～14 d,体重2～4 kg.随机分为两组:CO2气腹组(CO2组,n=7),N2O气腹组(N2O组,n=7).分别行100%CO2及100%N2O气腹,气腹时间为4 h,气腹压力为12 mm Hg.实验结束,采集腹膜标本.离体实验:C57BL/6小鼠10只,年龄4周左右,经0.125%胰酶预处理后,通过腹腔灌洗分离培养小鼠腹膜间皮细胞.离体细胞随机分为三组:对照组(5%CO2组).100%CO2组,8 cm H2O压力100%CO2组.细胞培养至连续单层后,将细胞分别暴露于5%CO2、100%CO2及8cmH2O压力100%CO2中4 h.不同气体条件下腹膜及分离培养的间皮细胞行电镜观察.结果 在体实验腹膜电镜结果提示压力12 mm Hg的100%CO2气腹维持4 h,导致腹膜间皮细胞层破坏,基底膜暴露,仅存细胞骨架;相同条件的100%N2O气腹使间皮细胞间隙增大,部分区域基底膜暴露.离体实验观察100%CO2破坏间皮细胞微绒毛,压力下的100%CO2对问皮细胞影响更加明显.结论 100%CO2使在体腹膜及离体间皮细胞超微结构发生明显改变,因此,小鼠模型中发现的CO2气腹后神经母细胞瘤转移增加可能与间皮细胞屏障削弱有关.

Abstract：

Objective Electron microscopic studies have shown significant morphologic changes of peritoneum after CO2 pneumoperitoneum in vivo. This experiment was to assess the effect of different gas on the morphology of peritoneum and the underlying mechanism of CO2 pneumoperitoneum on tumor cells. Methods In vivo, fourteen piglets (2-4 kilogram in weight, 7-14 days of age) were equally divided into the CO2 group(n = 7) and N2O group(n = 7). 100% CO2 or 100% N2O pneumoperitoneum was infused for 4 hours. Pneumoperitoneum pressure was 12 mmHg. At the end of the experiment, the samples of peritoneum were collected. In vitro, primary murine peritoneal mesothelial cells were36 collected by peritoneal lavage from ten C57BL/6 mice (4 weeks of age) after 0. 125% trypsin pretreatment. Isolated cells were divided into three groups: control group (5% CO2),100% CO2 group and 8 cm H2O pressure &. 100% CO2 group. After monolayers of mesothelial cells were established, cells were cultured with 5%CO2, 100% CO2 and 100% CO2 with 8 cm H2O pressure for 4 hours. Peritoneum and isolated mesothelial cells were examined by scanning electron microscopy. Results Scanning electron microscopy investigation suggested in vivo, 12 mmHg 100% CO2 pneumoperitoneum for 4 hours destroyed mesothelial cells layer of peritoneum, exposing the basal lamina. In contrast, 100% N2O pneumoperitoneum leaded to an increase of intercellular gaps and the basal lamina was exposed in part areas under same pressure and duration. In vitro, 100% CO2 exposition was associated with a significant destruction of the microvilli formation of isolated mesothelial cells. 100% CO2 with 8 cm H2O pressure had more significant impact on mesothelial cells. Conclusions The peritoneal mesothelial cells lose their typical cell morphology when exposed to 100% CO2. Thus, the increased neuroblastoma metastasis observed after CO2 pneumoperitoneum in mice might be related to an impaired mesothelial barrier function.     

炎琥宁氧气驱动雾化治疗毛细支气管炎疗效观察

目的观察氧气驱动雾化吸入炎琥宁对毛细支气管炎的疗效。方法62例毛细支气管炎患儿随机分成两组，在综合治疗的基础上，治疗组30例用氧气驱动雾化吸入炎琥宁，对照组32例用氧气驱动雾化吸入地塞米松、α-糜蛋白酶。结果治疗组与对照组在发热缓解、气急缓解、喘鸣音消失、肺部哕音消失的时间上差异均有显著统计学意义（P〈0．01）。结论炎琥宁氧气驱动雾化吸入治疗毛细支气管炎疗效显著。     

双歧三联活菌片对淤胆幼鼠移行性肌电复合波影响及其干预胆汁淤积的机制

目的观察益生菌制剂对急性肝内胆汁淤积幼鼠胃肠消化间期移行性肌电复合波(MMC)影响,探讨其干预胆汁淤积的可能机制。方法SD幼鼠96只随机分为健康对照组16只,中毒组、干预组各40只。各组随机选出8只在胃窦、十二指肠、空肠埋置3对银丝电极,余大鼠行假手术。术后7~10 d中毒及干预组1次灌服异硫氰酸萘酯(ANIT)(200 mg/kg)诱导急性肝内胆汁淤积;干预组于ANIT灌胃前2 d,灌服双歧三联活菌片4.2×108活菌/(kg.d)。观察各组灌服ANIT后48、96、144、192 h胆汁流量、血总胆红素(TB)、ALT及MMC变化。结果1.灌服ANIT后,干预组胆汁流量减少程度及血清中TB和ALT上升较中毒组轻,且恢复快。2.灌服ANIT后中毒及干预组MMC节律完全消失,代之以Ⅱ期样节律紊乱波;随后2组MMC逐渐恢复,但干预组MMC恢复时间(132.0±42.55)h明显短于中毒组(174.0±24.84)h(P<0.05);MMC节律恢复后,192 h时中毒组MMC持续时间较干预及健康对照组明显延长,其中主要是Ⅱ期持续时间延长。结论幼鼠急性肝内胆汁淤积时MMC周期延长,甚至节律性运动消失。双歧三联活菌片能促进肠道MMC节律性运动恢复,减轻肝脏损害,有助于改善胆汁淤积。     

缬沙坦对肾小球硬化影响实验研究

目的探讨血管紧张素Ⅱ1 -型受体拮抗剂 (AT1RA)缬沙坦对肾小球硬化的影响及其作用机制。方法将36只SD大鼠随机均分为3组 ,即正常对照组、肾病未治疗组和缬沙坦治疗组 ,观察各组大鼠的尿蛋白、血生化值、肾脏病理改变及肾脏组织中转化生长因子 - β1(TGF_β1)和纤维连接蛋白 (FN)的表达。结果①缬沙坦治疗组尿蛋白自第7周起较未治疗组明显降低 (P<0.01) ;②实验结束时 ,治疗组血白蛋白较未治疗组明显增高 (P<0.05) ;③肾小球硬化指数 (GSI)治疗组较未治疗组明显降低 (P<0.01) ;④肾组织中TGF_β1 和FN在正常组表达最少(P<0.05) ,未治疗组表达最强(P<0.01)。结论缬沙坦对肾小球硬化模型大鼠的肾脏病变具有保护作用 ,其机制可能为通过下调TGF_β1 的表达 ,减少细胞外基质的沉积 ,延缓肾小球硬化的进展。     

大黄治疗婴儿肝炎综合征的作用机制

目的探讨大黄治疗婴儿肝炎综合征(IHS)的机制。方法采用全自动生化分析仪检测52例IHS患儿及18例非IHS择期手术前婴儿(对照组)血清总胆红素(TB)、结合胆红素(DB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、总胆汁酸(TBA)水平,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测其血清及胆汁IL-6、TNF-α水平,硫代巴比妥酸比色法(TBA法)和黄嘌呤氧化酶法分别检测其血清及胆汁丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。结果大黄治疗后IHS患儿血清TB、DB、ALT、γ-GT、TBA分别为(58.7±20.9)μmol/L、(36.7±13.1)μmol/L、(56.8±22.1)U/L、(83.2±22.7)IU/L、(88.6±31.5)μmol/L,均较治疗前显著降低(Pa<0.05),血清及胆汁IL-6、TNF-α、MDA分别为(20.71±7.93)ng/L、(246.74±83.15)ng/L、(2.60±0.85)μmol/L、(81.96±17.05)ng/L、(627.91±193.37)ng/L、(6.32±2.05)μmol/L,均较治疗前降低(Pa<0.05),SOD与治疗前比较均升高[分别为(107.2±22.7)μU/L、(169.8±57.1)μU/LPa<0.05]。结论IL-6、TNF-α、MDA、SOD参与了IHS的病理过程,大黄通过降低血清及胆汁中IL-6、TNF-α、MDA水平,提高SOD水平而起到退黄护肝的作用。