上游刺激因子1在小鼠牙齿发育过程中表达的原位杂交研究

目的：检测小鼠牙齿发育中上游刺激因子1mRNA的表达及时空分布模式。方法：制备E13,16,19,P1,5,8,11,21d小鼠第一磨牙石蜡切片,用我们前期实验制备的USF1cDNA探针,原位杂交方法检测USF1mRNA的表达和分布。结果：原位杂交染色从钟状晚期小鼠牙胚中开始检测到阳性信号,持续至P11d,阳性信号主要定位于成牙本质细胞与成釉细胞;而蕾状期,帽状期,钟状期牙胚中未检测到阳性信号,并且在牙齿萌出后（P21d）,牙齿中USF1mRNA阳性信号再次消失。结论：牙胚中有USF1mRNA表达,主要位于分泌期的成牙本质细胞和成釉细胞,表达模式具有显著的时空特异性。     

人牙胚cDNA文库的构建

目的构建具足够库容量的人牙胚cDNA文库.方法提取人牙胚mRNA并反转录成cDNA,经LDPCR扩增后,将双链cDNA克隆到λTripleX2中,包装噬菌体,以XL-1-Blue为受体菌滴定、扩增文库,用两端引物做PCR鉴定.结果500μl文库的库容量为0.8×106pfu,重组率为83%,10个克隆有9个可扩增出cDNA片段,长度为500～2000bp.结论构建的文库具较好的库容量、重组率以及较大的插入片段.     

小鼠牙胚cDNA文库的构建

构建具足够库容量的小鼠牙胚ｃＤＮＡ文库。方法选提取小鼠牙胚ｍＲＮＡ并反转录成ｃＤＮＡ,经ＬＤＰＣＲ扩增后,将双链ｃＤＮＡ克隆到λＴｒｉｐｌｅＸ,包手装噬本,以ＸＬ－１ｂｌｕｅ为受菌体滴定,扩增文库,用已知的牙胚基质蛋白基因引物作ＰＣＲ鉴定文库。结果：５００μｌ文库的库容量为１．３＊１０＾６ｐｆｕ,重组率为７２％,从文库中克隆到已知的５种牙胚基蛋白基因。结论构建的文库具较好的库容量和重组率及较大的插     

小鼠核心结合因子1成熟肽编码区的cDNA克隆和序列测定

目的：研究核心结合因子1（cbfal)在小鼠牙胚组织中的表达，扩增cbfal成熟肽编码区的特异性片段，构建重组质粒，为进一步的蛋白表达、抗体制备、基因转染等研究奠定基础。方法：提取新生小鼠的颅骨、牙胚、肝脏组织总RNA，反转录为cDNA后进行PCR反应，构建pGEM-cbfal重组质粒并测序。结果：从小鼠颅骨和牙胚组织中均获得了约1791bp的目的片段，牙胚来源的PCR产物的测序结果证实成功地克隆到了cbfal成熟肽编码区，酶切结果显示重组质粒构建成功。结论：新生小鼠的牙胚组织中有cbfal基因的表达。     

成牙本质细胞中上游刺激因子1表达的原位杂交研究

目的 检测、证实成牙本质细胞中上游刺激因子1(USF1)mRNA的表达。方法 用前期制备的T——USF1质粒作模板,借助特异性引物PCR扩增USF1 cDNA片段,回收、随机引物法地高辛标记;培养成牙本质细胞MDPC—23,制备细胞爬片,原位杂交方法检测。结果 成牙本质细胞脑浆中有较强的蓝紫色颗粒。结论 首次证实体外培养的成牙本质细胞中有USF1 mRNA表达,为深入研究USF1分子对成牙本质细胞生长、分化和矿化影响提供了实验依据。     

小鼠成釉蛋白基因cDNA全序列的克隆

目的 筛选与小鼠牙胚发育相关的特异基因。方法 利用随机引物、反转录酶合成特异和非特异探针，采用差异显示方法筛选小鼠牙胚cDNA文库，挑选阳性克隆并测序。结果 得到6个阳性克隆，经测序证实其中1个克隆序列与大鼠成釉蛋白序列高度同源：其中用pTriplEX 3′引物测得的526个碱基序列与大鼠成釉蛋白基因5′端的32－580序列有497个碱基一致，5′引物测得的567个碱基序列与大鼠成釉蛋白基因3′端的1285－1854序列有533个碱基一致。结论 筛选到小鼠釉基质特异蛋白－成釉蛋白基因的cDNA全序列。     

小鼠牙胚发育过程中上游刺激因子1蛋白表达与分布模式的研究

目的:检测小鼠牙胚中上游刺激因子1(USF1)蛋白的表达及时空分布模式.方法:挖取P1和P11 d小鼠第一磨牙胚,抽提总蛋白,Western blot检测USF1蛋白表达;制备E13、16、19及P1、5、8、11、21 d和6月龄小鼠第一磨牙石蜡切片,免疫组化方法检测USF1蛋白的表达和分布.结果:Western blot从P11 d小鼠第一磨牙胚中检测到相对分子质量约43 000的特异性条带,但未从P1 d检测到;免疫组化染色从P5 d开始检测到较强的USF1阳性信号,持续至P11 d,阳性信号仅定位于成牙本质细胞与成釉细胞胞质;而蕾状期,帽状期,钟状期牙胚中未检测到阳性信号,并且在牙齿萌出后(P21 d与6月龄),牙齿中USF1阳性信号再次消失.结论:牙胚中有USF1蛋白表达,仅定位于分泌期的成牙本质细胞和成釉细胞,表达模式具有显著的时空特异性.     

人牙胚Shh的基因克隆和序列分析

目的：从人牙胚组织克隆Shh的全部编码区，测定并分析其基因序列。方法：利用RT—PCR方法，扩增人Shh基因片段，将基因片段插入pMD18—T载体，限制性内切酶酶切鉴定，测定序列。结果：从人牙胚中成功扩增Shh，Blast分析与GeneBank公布的Shh基因编码区一致。结论：Shh可能参与人牙胚的发育。     

犬IGF-I编码区cDNA克隆及其序列分析

目的：克隆犬胰岛素样生长因子(IGF—Ⅰ)编码区基因，构建重组真核表达载体。方法：从犬左心室组织中提取总RNA，通过RT—PCR获取IGF—1 cDNA编码区全序列，将其与pcDNA3．1( )质粒载体连接，构建重组真核表达载体pcDNA3．1( )／IGF—1，转化大肠杆菌DH5α后，随机挑选数个克隆，提取质粒DNA，通过限制性酶切和核苷酸序列鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pcDNA3．1( )／IGF—1的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到IGF—1编码区基因，成功构建重组真核表达载体pcDNA3．1( )／IGF—1。     

小鼠cbfal多克隆抗体制备及在骨和牙胚中的表达

目的 制备cbfal多克隆抗体并进行鉴定和效价分析，观察其在骨和牙胚中的表达情况。方法 用自制的融合蛋白免疫新西兰大白兔，制备多抗血清，提取小鼠牙胚、颅骨和肝脏组织的总蛋白进行western blot，同时采用免疫组化染色观察其组织表达特性。结果 cbfal蛋白在小鼠颅骨和牙胚组织中均有表达，在人骨肉瘤细胞系中呈强阳性表达。在免疫组化和western b1ot的有效作用滴度分别为1：400和1：1000。结论 成功地制备了兔抗小鼠cbfal多克隆抗体。     

成釉蛋白在小鼠牙胚发育不同时期的免疫组化定位

目的：观察成釉蛋白（ameloblastin,AMBN)在小鼠牙胚发育不同时期的表达和分布情况。方法：采用免疫组化的方法观察AMBN在小鼠牙胚不同时期的表达和定位。结果：蕾状期、帽状期和钟状早期牙胚中未见AMBN的表达；出生后1d钟状期，在成釉细胞和釉基质中呈强阳性表达，成牙本质细胞和牙本质基质中呈弱阳性表达；出生后3d，在成釉细胞胞浆中呈弱阳性表达，在成牙本质细胞中表达阳性，着色较成釉细胞深；出生后7d，AMBN在成釉细胞托姆氏突呈弱阳性表达，其余部位呈阴性表达。在牙胚发育的各个时期，AMBN在外釉细胞、星网层细胞、牙乳头细胞均呈阴性表达。结论：AMBN参与釉基质的形成，可能与牙胚发育中基质形成的信息传递有关。     

人牙胚cDNA文库的筛选和Hevin cDNA的克隆

目的：筛选人牙胚cDNA文库,考察Hevin在牙齿发育过程中是否表达,方法：以Ｈevin的一段编码序列作为探讨筛选人牙胚cDNA文库,挑取阳性噬菌斑,将其转化为质粒ＤＮＡ,再通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析的方法鉴定阳性克隆。结果：从人牙胚cDNA文库中筛选到一个阳性克隆,序列分析结果证实为Hevin的cDNA。结论：克隆到Hevin基因的部分cDNA序列,说明Hevin在牙胚发育过程中确有表达。     

Smad1在人牙胚发育过程中的表达变化

观察骨形成蛋白特异的细胞内信号转导分子Ｓｍａｄ１在人牙胚发育过程中的表达变化,探讨Ｓｍａｄ１在牙齿发育过程中的作用,方法制备人牙发育各期标本,免疫组化方法观察Ｓｍａｄ１在人牙胚发育过程中的表达情况。结果：Ｓｍａｄ１在牙胚发育的不同时期均见不同的时表达模式。     

出生后小鼠第一磨牙牙胚不同发育阶段的Notch1的表达

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牙本质基质蛋白1在人牙胚发育过程中的表达和意义

目的：观察牙本质基质蛋白1(dental matrix protein，DMP1)在人牙胚发育过程中的表达和分布变化，探讨DMP1在人牙齿发育过程中的作用。方法：制备人牙胚发育各期组织标本，采用免疫组织化学方法观察DMP1在人牙胚不同阶段的表达情况。结果：DMP1主要表达于钟状晚期分泌型成牙本质细胞，在前成牙本质细胞、前成釉细胞和牙乳头细胞中表达弱阳性，在成釉细胞中有一过性表达，即在釉基质开始形成但没有形成硬组织时的分泌型成釉细胞中有表达，但在随后的分泌型成釉细胞中表达渐弱至阴性。结论：观察到DMP1在人牙胚发育不同时期的表达和表达变化，提示其可能参与成牙本质细胞和成釉细胞的分化及牙本质形成过程。     

BSP、OPN在小鼠牙胚发育中的表达

目的:探讨骨涎蛋白(Bone sialoprotein,BSP)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)在Balb/c小鼠牙胚发育各期的时空分布特点及两者在牙齿矿化过程中的作用。方法:采用免疫组化法观察Balb/c小鼠出生前后牙胚及颌骨中BSP、OPN的表达与分布。结果:BSP、OPN在牙胚发育中的时空分布模式存在差异。OPN在蕾状期的表达弱于BSP,两者在成釉器早期的发育中作用微弱;在帽状期、钟状期及牙体硬组织(牙冠、牙根)分泌形成期,OPN的表达范围及强度高于BSP,尤其在牙体硬组织形成期,OPN在牙胚各类细胞及骨组织中均呈强阳性表达。结论:BSP、OPN参与牙胚的发育及牙体硬组织的矿化成熟,在牙齿发育中发挥关键作用。     

牙胚细胞的分离培养

目的：分离培养牙胚细胞。方法：选择出生后（PN）8天的SD大鼠,从第一磨牙牙胚上撕脱牙囊和成釉器组织,切取牙胚颈部组织,剁离牙乳头组织,分别进行细胞培养,通过差速消化法分离符种牙胚细胞。结果：牙囊、牙乳头、成釉器和上皮根鞘细胞被分离纯化出来。结论：利用差速消化法可同时分离培养4种主要的牙胍细胞。     

小鼠牙本质磷蛋白cDNA的克隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠牙本质磷蛋白（ＤＰＰ）ｃＤＮＡ。方法：用异硫氰酸胍一步法从小鼠牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用ｏｌｉｇｏ（ｄｔ） 作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ 方法,从ｃＤＮＡ 中扩增出小鼠ＤＰＰｃＤＮＡ基因片段（ 约１ ．６ｋｂ）,将所得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ 质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１ － Ｂｌｕｅ 后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠ＤＰＰｃＤＮＡ 基因片段。     

氯离子通道CIC-5在大鼠牙胚发育过程中的表达

目的研究氯离子通道ClC-5在大鼠牙胚发育过程中的表达情况，探讨其在牙齿发育过程中的作用。方法从不同发育阶段的大鼠牙胚中提取总RNA和蛋白，应用RT—PCR和Westem blot检测ClC-5在大鼠牙胚发育过程中mRNA和蛋白的表达情况。结果ClC-5在牙胚发育的过程中存在时空特异性表达，其mRNA和蛋白都主要在牙胚发育的钟状晚期表达。结论ClC-5在大鼠牙胚发育过程中的这种时空特异性表达，提示其可能在牙齿发育的过程中发挥一定的作用。     

牙本质涎磷蛋白、Ⅰ型胶原蛋白在vps4b基因 敲除鼠磨牙牙胚发育中的时空表达

目的 研究vps4b基因突变对牙齿发育相关蛋白——牙本质涎磷蛋白（DSPP）和Ⅰ型胶原蛋白（COL-Ⅰ）表达的影响。方法 取胚胎E13.5 d、E14.5 d、E16.5 d的胎鼠头部及出生后P2.5 d、P7 d的幼鼠下颌骨组织,石蜡包埋后获取第一磨牙牙胚组织切片,采用免疫组织化学染色法检测野生型小鼠和vps4b基因敲除小鼠牙胚中DSPP、COL-Ⅰ的表达。结果 野生鼠蕾状期和帽状期DSPP、COL-Ⅰ均未表达;钟状期DSPP在内釉上皮和牙乳头中有表达,COL-Ⅰ表达于牙乳头和牙囊;分泌期和矿化期DSPP、COL-Ⅰ在成釉细胞、成牙本质细胞、牙囊内均有表达,COL-Ⅰ在牙乳头内亦可见表达。小鼠vps4b基因敲除后,DSPP在钟状期牙乳头和分泌期牙乳头及牙囊内未见表达,COL-Ⅰ在钟状期及矿化期表达部位与野生型小鼠一致,分泌期在牙乳头的表达发生改变。结论 vps4b基因在牙胚发育中发挥重要作用;DSPP、COL-Ⅰ的表达可能受vps4b基因的调控,并与vps4b共同调节牙齿牙本质的发育。