p16INK4a免疫细胞化学染色在宫颈癌筛查中的作用

目的:探讨p16INK4a免疫细胞化学染色在宫颈癌筛查中的作用。方法:选择佛山市南海区第五人民医院2017年8月至2018年4月收治的宫颈癌患者160例。运用Pathsolver盈山全自动细胞/组织标记染色系统,以盈山保存液为基础的细胞涂片直接进行p16INK4a免疫细胞化学染色,同时进行传统的液基细胞巴氏染色,对p16INK4a免疫细胞化学染色和传统的液基细胞巴氏染色任一检测阳性或二者均阳性者进行阴道镜取活检检查。结果:传统的液基细胞巴氏染色检测阳性率为25.0%,p16INK4a免疫细胞化学染色检测阳性率为30.0%,差异具有统计学意义(P0.05)。p16INK4a免疫细胞化学染色诊断宫颈癌的灵敏度、特异度高于传统的液基细胞巴氏染色检测,假阳性率、假阴性率低于传统的液基细胞巴氏染色检测,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:p16INK4a免疫细胞化学染色联合传统的液基细胞巴氏染色分型检测可以提高诊断宫颈癌的灵敏度和特异度,对宫颈癌的早发现、早治疗有重要临床意义。     

人参皂苷Rg1延缓造血干细胞衰老与 p16INK4a表达关系的研究

目的:探讨人参皂苷单体Rg1延缓造血干细胞(HSC)衰老与p16INK4a的表达调控关系,为寻找延缓HSC衰老途径提供理论和实验依据.方法:免疫磁性分选法分离纯化Sca-1+HSC后分组.对照组常规培养;衰老组运用三丁基过氧化氢(t-BHP)复制衰老模型;Rg1组在对照组基础上加入10μmol·L-1Rg1共培养;Rg1延缓衰老组给予10μmol·L-1Rg1预处理后,复制衰老模型;Rg1治疗衰老组,衰老模型复制后,给予10μmol·L-1Rg1抗衰老处理.衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)细胞化学染色、流式细胞术分析细胞周期和造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养确定Rg1延缓或治疗Sca-1+HSC衰老生物学作用.RT-PCR及Western blotting检测衰老相关基因pl6INK4amRNA及蛋白的表达.结果:Rg1延缓衰老组,Rg1治疗衰老组与衰老组相比,SA-β-gal染色阳性细胞百分比降低,G1期细胞比例下降,生成造血祖细胞混合集落数增加,p16INK4amRNA及蛋白的表达下降;Rg1延缓衰老组的SA-β-gal染色阳性细胞百分比、G1期比例、pl6INK4amRNA及蛋白的表达均低于Rg1治疗衰老组,形成造血祖细胞混合集落数高于Rg1治疗衰老组.结论:Rg1具有延缓和治疗Sca-1+HSC衰老的作用,Rg1延缓衰老比治疗衰老效果更好.Rg1可能通过调控p16INK4a的表达发挥其对抗t-BHP诱导的Sca-1+HSC衰老的作用.     

液基细胞检测技术在胸腹水癌细胞检测中的作用研究

目的：研究液基细胞检测技术在胸腹水癌细胞检测中的作用。方法：选择2010年5月至2011年10月我院收治的疑似恶性肿瘤患者200例,每例取腹水50～100 ml,分别采用传统细胞涂片法、液基细胞制片法,比较两种方法的制片质量及细胞学检测结果。结果：液基细胞制片法的细胞层薄而均匀,背景干净;诊断阳性率高于传统细胞涂片法（P〈0.05）。结论：液基细胞检测技术能明显提高胸腹水癌细胞检出率,能更好地为临床恶性肿瘤的诊断提供参考。     

液基细胞学与传统巴氏涂片在宫颈上皮内病变的临床研究

目的:比较液基细胞学与巴氏涂片检查在宫颈上皮内病变的诊断价值。方法:收集我站门诊8748例进行宫颈细胞学检查的病例,随机分为实验组与对照组,实验组(5748例)采用液基细胞学检查,对照组(3000例)采用传统巴氏涂片法检查。结果:液基细胞学检查的阳性率明显高于巴氏涂片技术组,液基细胞学与宫颈活检的符合率明显高于巴氏涂片技术组。结论:液基细胞学检查在宫颈上皮内病变的检出率优于巴氏涂片检查,适合在临床推广。     

宫颈液基细胞涂片与阴道镜下宫颈活检在诊断宫颈癌变中的应用

目的:探讨宫颈液基细胞涂片以及阴道镜下宫颈活检在诊断宫颈癌变中的应用效果。方法:选取2013年2月-2015年10月来本院妇科普查以及门诊检查接受宫颈癌变诊断的患者80例,将所有患者随机分成两组,每组患者40例,观察组采用阴道镜下宫颈活检诊断,对照组采用宫颈液基细胞涂片诊断,观察两组宫颈癌变诊断效果。结果:观察组在宫颈癌确诊率上高于对照组,而且其假阳性率与假阴性率也明显低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:给予接受宫颈癌变诊断检查的患者进行阴道镜下宫颈活检的效果优于宫颈液基细胞涂片异常检查,能够在一定程度上提高其宫颈癌的诊断率,有效减少误诊与漏诊率。     

中药胃康宁对胃癌细胞生长与胃癌细胞周期调控因子的影响

目的 观察中药胃康宁含药血清对胃癌细胞生长与胃癌细胞周期调控因子CyclinD2、CyclinE、Cdk2（Cyclin dependant kinase2,CDK2）Cdk4、Cdk6和p16^INK4a、p27^KIP1mRNA及其蛋白表达的作用。 方法 分别将高、中、低不同剂量的中药胃康宁制剂对SD大鼠进行灌胃,制备含药血清,然后分别用不同剂量含药血清培养胃癌细胞,用流式细胞仪检测细胞周期的变化;采用免疫组织化学SABC法及RT-PCR法检测各组胃癌细胞中CyclinD2、CyclinE、Cdk2、Cdk4、Cdk6和p16^INK4a、p27^KIP1蛋白和mRNA的表达。 结果 中药胃康宁能将增殖过程中的MGC-803胃癌细胞阻滞于G0-G1期,使之不进入或延迟进入S期（即DNA合成期）,抑制胃癌细胞的生长;免疫组化法结果显示,与空白对照组比较,中药胃康宁高、中剂量组CyclinE和Cdk2,CyclinD2和Cdk4、Cdk6蛋白均有明显升高,而p27KIP1、p16INK4a蛋白则显著降低（P＜0.01）;RT-PCR结果显示,中药胃康宁高、中剂量组均能明显降低CyclinD2、CyclinE、Cdk2和Cdk4、Cdk6 OPTD值,同时升高p27KIP1、p16INK4a OPTDI值（P＜0.01）。 结论 中药胃康宁可抑制胃癌细胞促细胞周期相关因子CyclinD2、CyclinE、Cdk2、Cdk4和Cdk6的表达,同时增强胃癌细胞周期抑制因子p27^KIP1、p16^INK4a的表达,这可能是中药胃康宁抑制胃癌细胞生长的作用机制。     

黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及对相关蛋白表达的影响

目的 研究黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及对相关蛋白表达的影响.方法 采用体外细胞培养方法,应用MTT法检测黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡作用;通过免疫细胞化学(S-P法)检测凋亡相关基因bcl-2、bax、P53蛋白表达的改变.结果 MTT结果表明,黄芩苷在体外对人肝癌HepG-2细胞有明显的诱导细胞凋亡作用,且这种抑制作用呈现浓度和时间依赖性.免疫细胞化学(S-P法)检测凋亡相关基因Bcl-2、P53蛋白表达明显减少、Bax表达明显增加;Bcl-2/Bax比例明显降低.结论 黄芩苷对人肝癌HepG-2细胞具有较强的诱导凋亡的作用,其作用机制可能与下调P53基因表达和降低Bcl-2/Bax比例有关.     

鸦胆子油乳对HPV16亚型感染细胞的作用及机制研究

目的研究鸦胆子油乳（bruceajavanicaoilemulsion,BJOE）在体外对人乳头瘤病毒（hu-manpapillomavirus,HPV）16亚型感染细胞的抑制作用及其可能作用机制。方法选择人宫颈鳞状上皮永生化细胞系（Ectl／E6E7）与人宫颈癌CaSki细胞系作为HPV16亚型感染的宫颈癌前病变与宫颈癌体外实验模型。采用MTT法检测5、10、20及40#g／mLBJOE体外分别作用24、48及72h对HPV16感染细胞增殖活性的影响;Hoechst33258细胞核染色荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学变化;AnnexinV-FITC／Pl双染色法检测细胞凋亡率;半定量RT．PCR法检测HPV16E6、E7基因mRNA的表达;免疫细胞化学染色（Elivison二步法）检测HPV16E6、E7、p53及Rb基因蛋白的表达。结果（1）5、10、20及40μg,mLBJOE体外分别作用24、48及72h对HPV16感染细胞的增殖具有明显抑制作用,且表现为浓度与时间的依赖性（P〈0．05）。（2）HPV16阳性细胞在BJOE作用后发生了细胞凋亡形态学变化,5、10及20μg／mLBJOE体外作用48h后细胞凋亡率逐渐升高（P〈0．05）。（3）5、10及20μg／mLBJOE体外作用HPV16阳性细胞48h后E6与E7基因mRNA的相对表达量逐渐降低（P〈0．05）。（4）5、10及20μg,mLBJOE作用后,HPV16E6、E7及突变型P53蛋白的表达逐渐减弱（P〈0．05）,而Rb蛋白的表达逐渐增强（P〈0．05）。结论BJOE在体外对HPV16亚型感染细胞具有明显的抑制作用,其作用机制可能与药物下调病毒癌基因E6、E7表达相关。     

Guttiferone K抑制静止期前列腺癌细胞重新激活的作用研究

目的:观察从云南藤黄(Garcinia yunnanensis)中提取分离得到的PPAPs(Polycyclic Polyprenylated Acylphloroglucinol)类化合物Guttiferone K(GUTK)对人静止期前列腺癌LNCa P细胞重新激活的影响。方法:处于对数生长期的人前列腺癌LNCa P细胞去除血清培养7d诱导其进入静止期,通过再次加入血清培养使其重新激活进入细胞周期,同时给予GUTK进行干预。用免疫细胞化学的方法检测Ki-67蛋白表达的变化;利用PI染色的流式分析法和Ed U Incorporation法检测GUTK对细胞周期分布的影响;利用Western Blotting法检测Cyclin D1/3、CDK4/6和E2F1蛋白表达水平的变化。结果:GUTK呈剂量依赖性地抑制静止期LNCa P细胞的再次增殖并阻止静止期LNCa P细胞重新进入S期;GUTK在静止期LNCa P细胞激活的早期明显下调了Cyclin D1/3、CDK4/6和E2F1蛋白的表达水平。结论:从云南藤黄中提取分离得到的化合物GUTK能够抑制人静止期前列腺癌LNCa P细胞的重新激活,具有潜在的延缓前列腺癌病情发展和预防复发的作用。     

补肾化瘀生新方改善缺血缺氧性微环境延缓骨髓间充质干细胞衰老的作用

目的:观察补肾化瘀生新方改善细胞生存的不同微环境对p16/pRb和p53/p21信号通路调控作用,探讨其对骨髓间充质干细胞(BMSCs)衰老的影响。方法:采用无血清的1640培养基和低氧细胞工作站培养24 h建立缺血缺氧微环境细胞体外模型。随机分为空白组,模型组,补肾化瘀生新方组(24. 58 g·kg-1),复合培养基组;复合培养基组加入复合培养基,模型组完全培养基培养;补肾化瘀生新方组加入含有补肾化瘀生新方的血清培养基,均在低氧细胞工作站培养24 h;空白组加入完全培养基正常培养;采用流式细胞仪检测BMSCs细胞周期、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测p16INK4a,p53,p21 mRNA表达、及存活素(Survivn),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测β-catenin和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)蛋白的表达。结果:与空白组比较,模型组S期细胞数增多,G0/G1期明显降低,p16INK4a,p53,p21,Survivn,Caspase-3,PARP mRNA表达明显升高,β-catenin和GSK-3β蛋白表达明显升高(P0. 05);与模型组比较,补肾化瘀生新方组S期细胞数减少,G0/G1期比值明显升高(P0. 05),p16INK4a,p53,p21,Survivn,Caspase-3,PARP mRNA表达明显降低,β-catenin和GSK-3β蛋白表达明显降低(P0. 05)。结论:补肾化瘀生新方通过改善缺血缺氧性微环境调控p16/pRb和p53/p21信号通路延缓BMSCs衰老。     

液基薄层细胞学在宫颈病变诊断中的应用

目的分析比较液基薄层细胞学(thin prep cytologist test,TCT)与传统的巴氏涂片细胞学在宫颈病变检测中的阳性率和准确率。方法对1 050例妇科门诊患者同时进行TCT和巴氏涂片检测,细胞学诊断采用TBS分级系统,宫颈病变包括ASCUS以上的病变及HPV感染。诊断结果均与宫颈活检组织学对比。结果TCT标本满意率明显高于巴氏涂片(P<0.05),以阴道镜下活检组织学诊断为标准诊断,TCT与巴氏涂片诊断符合率分别为88.7%和59.2%。结论TCT检测宫颈病变优于巴氏涂片法。     

小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探讨体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞(mouse marrow mesenchymal stem cells,mMSCs)分化为神经元样细胞的条件.方法:密度梯度离心结合差异贴壁法分离、纯化mMSCs,胰蛋白酶消化传代扩增mMSCs.用最适浓度的β-疏基乙醇(BME) 神经生长因子(NGF)、NGF 全反式维甲酸(ATRA)、NGF BME ATRA作为诱导剂,观察诱导期间细胞的形态变化,并用免疫细胞化学法鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)的表达,行甲苯胺蓝染色显示尼氏小体.结果:(1)免疫细胞化学显示NGF BME ATRA诱导组诱导效率最高,78%细胞表达NSE,80%细胞表达NF;(2)各诱导组尼氏染色均出现尼氏小体.结论:NGF、BME、ATRA能诱导mMSCs分化为神经元样细胞,其中以NGF(10μg/L) BME(2.5mM/L) ATRA(2.5M/L)组效率最高.     

掌叶半夏有效提取物对HeLa细胞的作用及机制

目的观察中药掌叶半夏有效提取物(Pinellia extract,PE)对HeLa细胞的作用,并对可能的机制进行初步研究,为其临床用于防治女性宫颈病变提供科学依据。方法用倒置相差显微镜观察细胞生长并摄影,MTT法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原(proliferatingcell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达,免疫荧光实验检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白表达。结果PE对HeLa细胞的生长表现出明显的抑制作用,流式细胞术检测结果显示PE作用后HeLa细胞出现凋亡,且随着作用时间延长,凋亡细胞的比例明显增加;免疫细胞化学实验和免疫荧光实验结果表明:PE作用24 h后HeLa细胞PCNA和Bcl-2蛋白表达均明显减少。结论PE对HeLa细胞有明显的抑制生长和促进凋亡的作用,其促凋亡机制是通过降低PCNA和Bcl-2蛋白表达来实现的,这为进一步研究PE的作用机制以及抗癌新药的研制开发奠定了初步的实验基础。     

巴氏涂片检查及液基细胞学筛查宫颈癌的结果分析

目的:探讨液基薄层细胞(TCT)在宫颈癌病变筛查中的价值。方法:回顾分析2008年1～12月期间在我院体检的已婚女性铁路职工及因妇科疾病就诊的妇女进行巴氏涂片检查2036例和液基细胞学检查360例,细胞学诊断采用TBS(2001)分级报告系统,对细胞学检查结果异常者,进行阴道镜检查,并行宫颈活检,送病理学诊断。结果:2036例巴氏涂片检查中异常者140例,其中意义不明的不典型鳞状细胞(ASCUS)103例,鳞状上皮内低度病变(LSIL)29例,鳞状上皮内高度病变(HSIL)5例,鳞癌(SCC)3例。经组织活检病理学检查,阴性者18例,360例液基细胞学检查中异常者51例,其中ASCUS 30例,LSIL 17例,HSIL2例,SCC2例。经组织活检病理学检查,阴性者4例,诊断阳性符合率为92.16%。结论:宫颈液基细胞学检测方法比常规脱落细胞学检测敏感性高,采用细胞学与阴道镜下活检联合应用,提高了早期检出率。     

补肾化瘀生新法协同静脉注射骨髓间充质干细胞对延缓大鼠衰老作用

目的:观察补肾化瘀生新法协同静脉注射骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)延缓大鼠衰老的有效性,明确中医药协同静脉注射BMSCs治疗延缓机体衰老的可行性。方法:75只SD大鼠随机分为补肾化瘀生新方高、中、低剂量组、模型组和正常组。每组12只,按照125 mg·kg~(-1)·d~(-1)的剂量颈背部皮下每日1次注射D-半乳糖溶液,连续45 d,建立大鼠衰老模型。补肾化瘀生新方高、中、低剂量组(27.28,13.64,6.82 g·kg~(-1))灌胃给药,模型组生理盐水灌胃,正常组不给药,早晚各1次,连续45 d。同时尾静脉注射BMSCs注射3.0×10~6个/m L的BMSCs,每周1次,连续4次。免疫荧光法测定脑、肝、肺、心中CD105,p53,p21,p16~(INK4a)阳性细胞数,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠的脑、肝、肺、心中p16~(INK4a),p53,p21 mRNA表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠脑、心脏、肺脏、肝脏中CD105阳性细胞数明显降低,p16~(INK4a),p21,p53阳性细胞数明显升高(P0.05),大鼠的脑、心脏、肺脏、肝脏中p16~(INK4a),p53,p21 mRNA表达明显上调(P0.05);与模型组比较,补肾化瘀生新各剂量组大鼠脑、心脏、肺脏、肝脏中CD105阳性细胞数明显升高,p16~(INK4a),p53,p21阳性细胞数明显降低(P0.05),补肾化瘀生新各剂量组均能明显降低脑、肝、肺、心组织中p16~(INK4a),p53,p21阳性细胞数mRNA表达明显下降(P0.05)。结论:补肾化瘀生新法协同静脉注射BMSCs可能影响p16~(INK4a)/Rb和p53/p21途径上的关键基因p16~(INK4a),p53,p21的表达而延缓BMSCs衰老,显示了中医药协同静脉注射BMSCs抗衰防衰的可行性。     

不同检测方法检测不同性状痰液中分枝杆菌结果比较

目的：探讨两种不同检测方法检测不同性状痰液中分枝杆菌并比较其结果。方法：用夹层杯离心涂片集菌法和直接涂片法同时检测568例痰液标本中的分枝杆菌。结果：在粘液痰和血痰中用夹层杯离心涂片集菌法分枝杆菌的阳性率明显高于直接涂片法，在干酪痰中，两种方法分枝杆菌的阳性率差异无统计学意义。结论：两种方法各有优缺点，对于门诊量较多的痰液，应根据痰液的不同性状采用不同的检测方法，既可提高阳性率，又能缩短检测时间。     

从自噬角度研究雷公藤甲素引起HepG2细胞肝毒性的机制

目的:探讨雷公藤甲素(TP)对HepG2细胞的过氧化损伤及对自噬的调控作用。方法:将质量浓度为0.003 2,0.016,0.08,0.4,2 g·L~(-1)的TP作用于体外培养的HepG2细胞48 h,另设空白组做对比,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长活性,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性,采用蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3Ⅱ)与Beclin1蛋白的表达情况,用免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3的表达情况。结果:与空白组比较,随着TP质量浓度的增加,HepG2活性下降(P0.05,P0.01);检测细胞上清中SOD,GSH-Px的活性,均较空白组降低(P0.05,P0.01);Western blot表明TP可上调LC3Ⅱ与Beclin1蛋白水平的表达(P0.05,P0.01),免疫荧光法同样表明TP能够引起自噬相关蛋白LC3表达的增多(P0.05,P0.01),均具有一定的浓度依赖性。结论:一定质量浓度的TP可造成肝细胞损伤,其损伤机制可能与过氧化损伤以及过氧化损伤导致的自噬过度激活有关。     

大鼠拟“衰老”胸腺细胞功能退化的机制探讨及左归丸的作用

目的:探讨皮质酮致大鼠胸腺细胞功能退化可能的机制及左归丸的药理作用。方法:大鼠胸腺细胞体外培养,分正常对照组、模型组、左归组。MTT法检测细胞增殖情况,PI染色结合FCM分析周期分布,Real time PCR和Western blotting法检测相关因子表达变化。结果:皮质酮显著抑制细胞增殖,细胞阻滞于G1期,p16表达显著升高(P0.01),cdk4、IL-2、IL-2Rα蛋白表达降低(P0.05)。与模型组比较,左归组G1期细胞数减少,p16表达降低,IL-2、IL-2Rα蛋白表达升高(P0.05)。结论:左归丸通过抑制p16表达,促进细胞增殖,延缓皮质酮致胸腺依赖性免疫功能退化的进程。     

当归多糖对小鼠骨骼肌卫星细胞增殖及干细胞因子受体蛋白表达的影响

目的观察在体外造血微环境中,当归多糖(angelica polysaccharides,APS)对不同培养条件下乳鼠骨骼肌卫星细胞(muscle satellite cells,MSCs)增殖及干细胞因子受体蛋白(c-kit)表达的影响。方法原代培养MSC,5天后采用结蛋白(desmin)免疫细胞化学鉴定;细胞随机分为8组,即空白对照组,骨髓基质细胞培养上清组,加入含100、200、300μg/mLAPS的DMEM/F12培养基实验组及经100、200、300μg/mLAPS干预后骨髓基质细胞条件培养基组,采用MTT法检测各组细胞的增殖活性及对细胞进行c-kit免疫细胞化学染色。结果分离培养的MSCs呈desmin染色阳性;MTT法检测发现各条件培养基实验组MSCs增殖显著;c-kit免疫强阳性反应存在于条件培养基培养的各组MSCs中,c-kit主要表达于细胞质。结论经APS干预的骨髓基质细胞条件培养基可以有效改变MSCs的生长特性,明显促进MSCs增殖及c-kit的表达,c-kit在MSCs增殖过程中可能起某种调节作用。