人原始生殖细胞体外培养的初步研究

目的：探讨人原始生殖细胞体外培养条件，初步建立人原始生殖细胞体外培养体系及鉴定其部分生物学特性。方法：从受精后4～12周的人胚中分离原始生殖嵴／腺获得原始生殖细胞，以昆明种小白鼠胚胎成纤维细胞为饲养层，在多种细胞因子的共同作用下培养。结果：获得大量的原始生殖细胞集落。传至6代后．细胞集落呈典型的鸟巢状，碱性磷酸酶检测呈阳性，表达SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60和TRA-1-81抗原，同时在体外能自发分化为多种细胞。结论：初步建立人原始生殖细胞体外培养体系，成功的将人原始生殖细胞在体外传6代，仍保持未分化集落的生物学特性。     

小鼠胚胎原始生殖细胞的体外培养

采用细胞生物学方法和组织培养技术研究小鼠胚胎原始生殖细胞(PGCs)的一般形态学特征及生物学特点.在体外培养条件下,PGCs 按体积大小可分大、中、小3类。本研究发现,中、小型原始生殖细胞在培养的第2、3 d 增多,形态似大型原始生殖细胞。培养中的 PGCs 不贴壁而悬浮生长于培养液中,培养到第6～7 d时开始死亡。体细胞(间充质细胞或间皮细胞)贴壁生长,生长旺盛,与PGCs 同时死亡。     

人原始生殖细胞体外培养的初步研究

目的 :探讨人原始生殖细胞体外培养条件 ,初步建立人原始生殖细胞体外培养体系及鉴定其部分生物学特性。方法 :从受精后 4～ 12周的人胚中分离原始生殖嵴 /腺获得原始生殖细胞 ,以昆明种小白鼠胚胎成纤维细胞为饲养层 ,在多种细胞因子的共同作用下培养。结果 :获得大量的原始生殖细胞集落。传至 6代后 ,细胞集落呈典型的鸟巢状 ,碱性磷酸酶检测呈阳性 ,表达SSEA 1,SSEA 3,SSEA 4 ,TRA 1 6 0和TRA 1 81抗原 ,同时在体外能自发分化为多种细胞。结论 :初步建立人原始生殖细胞体外培养体系 ,成功的将人原始生殖细胞在体外传 6代 ,仍保持未分化集落的生物学特性     

人胚胎生殖系细胞分离与体外培养的初步研究

目的:初步探讨人胚胎生殖系细胞的分离与体外培养.方法:体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织,按单纯机械分离、酶消化分离、二者结合法及是否有饲养层将组织分为5种不同的方式培养后,用碱性磷酸酶标记,计数阳性克隆并进行比较.结果:酶消化法培养所获得的克隆较单纯机械分离方法多,原代培养时种植到饲养层上效果较好.将分离到的组织用0.25％胰酶消化3 min,种植到丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞上培养3 d,挑取克隆传代,在第10天形成30.7 个阳性克隆,显著高于其他方法获得的阳性克隆数.用碱性磷酸酶标记的细胞(克隆)具有多样性,细胞胞体为圆形,分为有突起和无突起两种;阳性细胞克隆呈圆球形、条带形和块形,与周围细胞分界清楚.结论:人胚胎体内的微环境限制生殖系细胞的体外扩增培养,原代培养需要在饲养层上进行且宜用酶消化法尽早传代.     

人原始生殖细胞的分离和培养

目的 探讨体外分离培养人原始生殖细胞的条件和方法.方法 分离、培养2～3个月人胚胎的成纤维细胞,经60Co照射后作为饲养层;从5～9周人胚胎的生殖嵴和肠背系膜组织中分离原始生殖细胞,培养在含有bFGF、LIF和Forskolin的人胚胎成纤维细胞饲养层上;同时采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测人原始牛殖细胞阶段特异性胚胎抗原SSEA-1、SSEA-4以及特异性基因Oct-4、Ifitm-3、stella、Mvh、DAZL的表达,并进行类胚体培养.结果 分离的人原始生殖细胞在饲养层上可以增殖形成典型的鸟巢状集落;细胞染色体均为正常的二倍体核型;阶段特异性胚胎抗原SSEA-1、SSEA-4表达阳性,同时检测到生殖干细胞特异性基因Oct-4、Ifitm-3、stella、Mvh、DAZI.表达.人原始生殖细胞在悬滴培养时能够形成类胚体,表明其具有多项分化潜能.结论 用人胚胎成纤维细胞作为饲养层进行体外培养人胚胎生殖嵴和肠背系膜组织,分离的原始牛殖细胞形成EG细胞集落,初步鉴定为人胚胎生殖细胞.     

人原始生殖细胞的体外分离及培养

目的 :探讨人原始生殖细胞 (PGCs)的体外分离培养条件及相关影响因素 .方法 :以胎鼠成纤维细胞为滋养层 ,用1.2 5 g·L-1胰蛋白酶室温下消化胚胎组织 3～ 5min ,分离培养PGCs细胞并观察其克隆形成率 ;进而观察不同浓度白血病抑制因子 (leukemiainhibitoryfactor,LIF)对PGCs克隆在传代及未分化状态的维持等方面的影响 ;最后对PGCs克隆进行碱性磷酸酶活性鉴定及染色体组型分析 .结果 :采用胰蛋白酶消化法可对PGCs进行分离培养 ;PGCs在传代过程中其克隆形成率亦逐渐降低 ;培养基中无LIF时 ,PGCs克隆可分化为心肌样收缩细胞团 ;LIF在阳～ATP掺入法测得不同处理组的MAPK活性分别如下 :Con组 6 9.7± 2 .5 ,Non组 72 .8± 4 .6 ,Lip性 ,在传代过程中其染色体组型未见变异 .结论 :可从人类早期胚胎中分离培养PGCs细胞 ,培养基中LIF的浓度在 5～ 10 g·L-1时以利于提高PGCs培养的成功率并抑制其过早分化 .     

小鼠原始生殖细胞源胚胎干细胞的分离培养和建系

目的 :对小鼠胚胎干细胞分离材料的获取及处理、胚胎干细胞分化抑制培养、细胞系的建立及保存所用技术进行探讨。方法 :取胎鼠生殖嵴及其周围组织 ,采用胎鼠的胚胎干细胞与其成纤维细胞共培养的方式进行。结果 :分离得到大量原始生殖细胞(PGCs)集落。多次克隆传代具有胚胎干 (ES)细胞的诸多特征 ,如有连续传代的能力 (有两组分别传至 3代和 4代 ) ,有典型鸟巢状结构 ,AKP染色阳性 ,体外分化实验具有形成类胚体的能力。结论 :从胎鼠生殖嵴中能够获得大量的ES细胞。采用的胚胎干细胞与其成纤维细胞共培养的方式进行胚胎干细胞的分离培养和建系是可行的     

小鼠雌性和雄性胚胎原始生殖细胞发育的比较研究

目的 观察研究小鼠雄性和雌性胚胎中原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCs)发育的差异,为进一步深入研究PGCs以及生殖细胞发育的基因调控提供实验依据.方法 在本研究采用C57BL/6J小鼠胚胎为实验材料,通过石蜡切片、免疫荧光组织化学染色方法,检测C57BL/6J小鼠胚胎在11至13.5d之间生殖嵴发育的形态学改变,比较雌性和雄性胚胎中原始生殖细胞数量与增殖的变化.结果 发现雄性和雌性胚胎中PGCs的数量在13.5d最多,而处于增殖期的PGCs在13d时最多;在13d的雄性胚胎中,PGCs数量上显著高于雌性,并且其中增殖期的PGCs也较雌性的多.结论 在胚胎发育早期(11至13.5d),小鼠PGCs的发育存在性别差异.     

体外诱导胚胎干细胞分化为生殖细胞的研究进展

胚胎干细胞是一种具有发育全能性的细胞系，理论上能分化为包括生殖细胞在内的各种组织细胞。由于生殖细胞是遗传物质的传递者，所以胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究具有更深刻的科学及伦理挑战性。本文简要介绍各国科学家在胚胎干细胞向生殖细胞分化方面的研究进展。     

人胚胎生殖细胞体外培养条件优化及细胞移植实验研究

目的:优化人胚胎生殖细胞(EG细胞)的体外培养体系,并将生长状态良好的传代的人EG细胞移植用于大鼠心肌梗死模型的治疗。探讨人胚胎生殖细胞进行异种移植对大鼠心肌梗死的治疗机制。方法:取5～10周人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜,用添加和不添加细胞因子的两种培养体系对比进行组织块原代及传代培养,选取生长情况良好的传至第4代的人EG细胞,移植到急性心肌梗死大鼠的梗死心肌周围,分别于移植后1天、1、2、4周处死大鼠,以鼠抗人细胞核抗体MAB1281作为示踪剂,通过免疫组化方法检测移植细胞的分布。结果:在培养液中添加LIF和b-FGF后原代及传代培养的人EG细胞生长旺盛,形成集落更早,传到第4代形成的集落体积变化不大:移植组人EG细胞在移植后1天、1周、2周、4周均可以在心梗区域观察到MAB1281阳性细胞。结论:添加LIF和b-FGF的培养体系是更高效的人EG细胞培养体系。人EG细胞可异种移植,人EG细胞在大鼠心肌梗死处由心外膜层逐渐向心肌层迁移。     

小鼠胚芽干细胞的分离与培养

目的：探讨胚芽干细胞的提取、培养和体外扩增的最佳条件;筛选胚芽干细胞在体外培养中的活力最佳时期。方法：分离受精11d小鼠生殖腺嵴,经消化制备成胚芽干细胞悬液,将细胞分别接种于基础培养液、同种胎鼠成纤维细胞条件培养液、添加LIF的基础培养液、有饲养层的培养基和与胎鼠成纤维细胞共培养5种不同的培养体系中,比较观察在5种培养体系中胚芽干细胞的形态学、碱性磷酸酶染色和体外分化情况。结果：①在含15％胎牛血清的DMEM／F12基础培养液中培养时,胚芽干细胞贴壁明显减少,EGC克隆形成很少,传代率很低;②在基础培养液中添加白血病抑制因子（LIF）或同种胎鼠成纤维细胞条件培养液时,细胞生长情况与基础培养液培养相比无明显差异;③有饲养层存在时,4～6d后出现鸟巢状胚芽千细胞集落。传4代后集落逐渐减少、变小。6～7代后集落消失;④与胎鼠成纤维细胞共培养时,2～4d即可见EGC集落形成。传6代后细胞的集落逐渐减少、变小;⑤在与胎鼠成纤维细胞共培养时,第2、3代细胞的生长曲线基本相同,接种24h后细胞呈对数生长。培养液的更新可以显著影响小鼠胚芽干细胞的生长。第5代的细胞增殖速度减慢。结论：与饲养层细胞或腹壁组织成纤维细胞共培养可较好地培养和扩增胚芽干细胞;第3代细胞的活力最好。     

小鼠原始生殖细胞分离培养方式和生物特性研究

目的：探索一种简单高效的分离、培养小鼠原始生殖细胞（PGCs）的方法,为小鼠模型提供充足的PGCs来源。方法体外分离小鼠12.5 dpc胚胎生殖嵴,剪碎后用含血清、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、卵泡刺激素、重组表皮生长因子的α-M EM培养基进行组织块贴壁培养;于倒置显微镜下观察细胞形态,采用流式细胞术检测阶段性特异性胚胎抗原,采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）、细胞免疫荧光等方法检测干细胞的多能性基因Oct4及减数分裂Ⅰ期的几个特异性基因的表达。结果体外分离培养的小鼠 PGCs具有良好的细胞形态、极强的增殖能力,SSEA-1表达阳性,SSEA-4表达阴性,同时检测到Oct4、Stra8、Vasa、SCP3、ZP3表达均为阳性。结论利用该实验方法能培养出高纯度、具有良好干性及极强增殖能力的小鼠PGCs ,并使该细胞进入减数分裂。     

鼠原始生殖细胞报告基因系统的建立及验证

目的:构建小鼠原始生殖细胞（PGCs）报告基因系统。方法:根据CRISPR基因编辑技术结合同源重组原理,针对鼠Prdm1和Dppa3基因的翻译起始位点ATG附近位置分别设计一对sgRNA,并根据Cas9切割位点以及拟插入目的片段构建相应的用于同源重组的供体质粒,将sgRNA与Donor质粒同时转染入小鼠胚胎干细胞（ESCs）中,并利用质粒携带的抗性基因筛选出目标单克隆细胞,并进行基因型鉴定。结果:通过提取单克隆细胞的基因组DNA进行基因型鉴定,PCR和Sanger测序结果显示,单克隆细胞的基因组中,Prdm1和Dppa3基因翻译起始位点后分别成功插入eGFP和mCherry荧光蛋白编码序列。利用细胞因子诱导eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3mESCs（mouse ESCs）定向分化为mPGCs（mouse PGCs）,流式细胞仪检测显示诱导分化的mPGCs特异表达eGFP和mCherry荧光信号。结论:成功构建mPGCs报告基因系统,可用于后续研究mPGCs命运决定的分子机制,对于研究小鼠早期胚胎发育过程具有重要意义。     

人胚胎视网膜色素上皮细胞的体外培养和吞噬作用

目的探讨人胚胎视网膜色素上皮（RPE）细胞分离培养的特性及其吞噬作用。方法取发育至13-15周的新鲜人胚胎眼球,显微解剖后采用机械胰酶消化法分离培养RPE细胞,应用免疫荧光法观察人胚胎RPE细胞吞噬视网膜光感受细胞外节膜盘。结果人胚胎发育至13-15周后,RPE细胞可应用标准的培养方法进行体外培养和传代。根据测定的人胚胎RPE细胞生长曲线,取2—6代细胞用于实验培养的人胚胎RPE细胞具备吞噬功能。结论改进了人胚胎RPE细胞的培养方法,证明人胚胎RPE细胞在体外具有吞噬能力。     

人胚胎原生殖细胞中胚胎干细胞的分离培养

目的：探讨人胚胎原生殖细胞分离培养的条件及在体内、外的分化能力．方法：从5～9wk人胚胎生殖嵴中消化分离原生殖细胞(PGC），将其置于饲养层上培养，采用大鼠心肌细胞条件培养基(RH-CM)，改变了常规使用添加白血病抑制因子(LIF)的培养液．结果：成功地完成了对PGC的第4代培养；经过培养形成的克隆以及克隆的生长方式基本符合胚胎干细胞(ES)的特性：AP染色呈阳性；体外分化实验显示此细胞具有发育多能性；悬浮培养时能够自然分化成类胚体(EB)．结论：离散生殖嵴和增殖的。PGC克隆的时机和方法是影响建系的关键；PMEF和HEF对人PGC克隆的影响无显差异；添加RH-CM可有效抑制PGC的分化。