成人骨髓基质细胞体外诱导成神经细胞实验研究

目的探讨骨髓基质细胞的体外培养、扩增及诱导其向神经元样细胞定向分化的方法。方法采用改进的全骨髓培养法,培养来源于正常成人献髓者的骨髓基质细胞。传至第5代,用全反式维甲酸(RA)等细胞因子诱导分化,于诱导后第7d和第14d行神经元细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(β-tublin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)鉴定,计数诱导前后的细胞。结果成人骨髓基质细胞经RA 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 脑源性神经营养因子(BDNF)诱导后可见神经元样细胞出现,经NSE、MAP-2及β-tublin免疫组化和荧光鉴定阳性,NSE表达率达到48.5%±0.2%。结论骨髓基质细胞在体外扩增迅速,纯化需时短,并可在全反式维甲酸等细胞因子诱导下向神经元样细胞分化。     

趋化因子Fractalkine体外趋化骨髓基质细胞迁移的实验研究

目的探讨趋化因子Fractalkine对骨髓基质细胞(BMSCs)的体外迁移作用。方法采用全骨髓法培养成年Wistar大鼠BMSCs,取第五代BMSCs行免疫荧光鉴定;后通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测BMSCs表达趋化因子受体CX3CR1的情况,利用Boyden小室法探讨趋化因子Fractalkine对BMSCs的体外趋化作用及其特异性。结果第五代BMSCs都表达间充质干细胞标记物Vimentin、Laminin及Fibronectin;CX3CR1细胞免疫荧光及RT-PCR结果证实BMSCs表达趋化因子受体CX3CR1,趋化因子Fractalkine(5、50、500ng/mL)体外可趋化BMSCs迁移,抗Fractalkine多克隆抗体可对抗其趋化迁移作用。结论Fractalkine/CX3CR1通路参与BMSCs体外迁移,为进一步研究BMSCs的迁移机制提供了理论依据。     

骨髓间质干细胞的分离培养及向神经细胞分化的研究

目的 研究骨髓间质干细胞的分离培养方法及其向神经元细胞分化的条件及可行性。方法 取大鼠骨髓，采用贴壁培养筛选法，分离培养骨髓问质干细胞，经β-巯基乙醇诱导，骨髓问质干细胞可向神经元样细胞分化，免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果 分离的骨髓间质干细胞可体外增殖，经β-巯基乙醇诱导，骨髓间质干细胞可向神经元细胞分化，细胞突起增多，具有神经元的形态学特征；分化后的细胞表达神经元标志物-神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经微丝(NF)。结论 骨髓组织中存在着骨髓间质干细胞，易分离和培养，体外可增殖，可横向分化为神经元，从而为中枢神经系统疾病的移植治疗提供了细胞来源。     

骨髓基质细胞诱导后与神经细胞的比较研究

目的 通过体外诱导骨髓基质细胞（BMSCs)与神经细胞作比较。探索BMSCs体外诱导分化为神经细胞的可行性。方法 应用bFGF,BHA,EGF,Forskolin等配成诱导前剂，诱导剂和长期诱导剂，对大鼠BMSCs进行诱导，全程观察其变化，并聚诱导后4d细胞行神经元特异烯醇化酶（NSE），胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的免疫组化染色和Western Blot检测，与大鼠脊髓来源的神经细胞对比。结果 BMSCs诱导前后细胞形态。免疫组化，West-ern Blot检测有明显区别；诱导后细胞与神经细胞极为相似；诱导后细胞13-17d凋亡。结论 BMSCs诱导前后细胞形态，生长，凋亡和NSE，GFAP表达变化支持BMSCs可以体外诱导成神经细胞。     

诱导成人骨髓基质细胞成为神经干细胞及其分化的实验研究

目的　体外诱导成人骨髓基质细胞 (BMSCs)转化为神经干细胞 (NSCs)进而分化为神经元和胶质细胞。方法　以含有碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)或表皮生长因子 (EGF)加 b FGF或 b FGF、EGF加全反式维甲酸 (ATRA)的培养液培养 BMSCs,进行显微镜观察 ,纤维连接蛋白 (fibronectin)、I型胶原 (collagen )和神经上皮干细胞蛋白 (nestin)免疫组织化学染色和神经元特异烯醇化酶 (NSE) ,胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫荧光染色。结果　经诱导物诱导 72 h后 ,fibronectin和 collagen I免疫阳性细胞减少。nestin免疫阳性细胞增多。 7d后 ,其又减少。同时 NSE和 GFAP免疫阳性细胞增多。细胞分化后 ,NSE阳性细胞最多占细胞总数的 2 4 .76 %±2 .72 % ,同时 GFAP阳性细胞占细胞总数的 36 .5 8%± 3.2 6 %。结论　 EGF、b FGF、ATRA及适宜的培养液可使BMSCs定向 ,转化为 NSCs,进而分化为神经元和胶质细胞。     

Expression of brain natriuretic peptide by human bone marrow stromal cells

Bone marrow stromal cells (BMSC) have been shown to generate neural cells under experimental conditions in vitro and following transplantation into animal models of stroke and traumatic CNS injury. Hastened recovery from the neurological deficit has not correlated with structural repair of the lesion in the stroke model. Secretory functions of BMSC, such as the elaboration of growth factors and cytokines, have been hypothesized to play a role in the enhanced recovery of neurological function. Using gene expression arrays, real time RT-PCR and radioimmunoassay, we have found that brain natriuretic peptide (BNP) is synthesized and released by BMSC at physiologically relevant levels in vitro. BNP, like its close homolog atrial natriuretic peptide (ANP), exerts powerful natriuretic, diuretic and vasodilatory effects. We speculate that transplanted BMSCs facilitate recovery from brain and spinal cord lesions by releasing BNP and other vasoactive factors that reduce edema, decrease intracranial pressure and improve cerebral perfusion.     

体外诱导获得雪旺细胞的可靠性研究

目的 研究骨髓基质细胞(BMSCs)在体外条件下向周围神经雪旰细胞(SCs)分化的可靠性. 方法 分离提取SD大鼠股骨和胫骨部位BMSCs.利用其贴壁生长的特性.培养纯化,传代扩增.用复合诱导因子(β.巯基乙醇+全反式维甲酸+血小板凝集抑制剂+m小板源性生长因子+碱性成纤维细胞生长因子)在体外诱导BMSCs分化.免疫细胞化学方法 检测P75、S-100及胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,荧光实时定量PCR检测P75、S100及CD104的表达. 结果诱导后的BMSCs形态类似SCs,免疫荧光染色鉴定其具有SCs性质,表达SCs的表面标志物(GFAP、S100和P75).荧光实时定量PCR结果显示诱导后BMSCs S-100、CD104的表达量达到了SCs的表达量水平,但P75的表达量与SCs的表达量水平还有较大差距. 结论 体外诱导BMSCs可部分获得SCs的特征,传代后恢复至未诱导状态,这种预诱导加复合因子诱导的方法 尚待完善.     

骨髓基质干细胞与骨缺损的修复

背景：骨髓基质干细胞来源广泛,分离方便,扩增迅速,具有多向分化潜能,适合自体移植的特点,同时是骨组织工程中合适的种子细胞。 目的：总结分析采用骨髓基质干细胞作为种子细胞,并利用转基因或其复合支架修复骨缺损所具有的优势。 方法：检索1990/2009 西文生物医学期刊文献数据及CNKI数据库有关骨髓基质干细胞分离、培养,在骨缺损方面的应用,骨组织工程方面的文献,英文检索词为“Bone marrow stem cells,Repairing,Bone defect”,中文检索词为“骨髓基质干细胞,修复,骨缺损”。排除重复性研究,保留28篇进一步归纳总结。 结果与结论：文章从骨髓基质干细胞作为种子细胞的优势,骨髓基质干细胞的分离和培养,骨髓基质干细胞的成骨诱导及骨髓基质干细胞修复骨缺损等方面进行了总结。利用骨髓基质干细胞作为种子细胞,与适当的支架材料结合,或用骨髓基质干细胞作为靶细胞,导入外源目的基因诱导成骨的基因治疗来修复骨缺损的方法,给骨缺损的治疗带来光明的前景。但同时也存在骨髓基质干细胞存化,骨髓基质干细胞的增殖、分化合适的条件,哪些因子能有效促进新骨形成,载体材料及体内植入方式,以及如何将骨组织工程与基因治疗的方法结合起来等问题需要进一步的研究。     

骨髓基质干细胞对脑胶质瘤大鼠的免疫调节作用

目的研究骨髓基质干细胞(bone marrowstromal stem cells,BMSCs)在体外及脑荷瘤大鼠体内的免疫调节作用。方法培养BMSCs,以抗原致敏的树突状细胞(dendritic cell,DC)作为刺激细胞,将BMSCs与DC及T淋巴细胞混合培养,或应用Transwell将BMSCs与DC及T淋巴细胞以8μm的膜隔开培养,观察BMSCs对体外混合淋巴细胞反应的调节作用。建立大鼠脑胶质瘤模型,将BMSCs植入荷瘤大鼠脑内,观察对荷瘤大鼠的免疫调节作用。结果BMSCs不能刺激T淋巴细胞的增殖,但明显抑制DC对T淋巴细胞的激活作用;用Transwell将BMSCs与DC及T淋巴细胞以8μm的膜隔开,与BMSCs、DC、及T淋巴细胞混合培养相比,结果无统计学差异(P=0.934);在混合淋巴细胞反应早期加入BMSCs可产生明显的抑制效果,在晚期加入BMSCs则抑制效果明显降低(P<0.01)。流式细胞术检测显示混合淋巴细胞反应的T淋巴细胞凋亡不明显。体内检测显示,BMSCs对荷瘤鼠体内的IFN-γ、IL-2、IL-10水平无明显影响,肿瘤内浸润的淋巴细胞与对照组相比无明显减少(P>0.05)。结论BM-SCs可能通过分泌的细胞因子对T淋巴细胞产生一定的抑制作用。     

骨髓基质细胞源内皮样细胞对微血管新生的影响

目的研究骨髓基质细胞(BMSCs)源内皮样细胞移植对大鼠局灶性脑损伤血管生成的影响,探讨BMSCs源内皮样细胞移植修复大鼠脑损伤的机制。方法制备大鼠局灶性脑损伤动物模型,进行BMSCs源内皮样细胞移植,通过ELISA、免疫组织化学、电镜等观察局部血管内皮细胞生长因子(VEGF)、内皮细胞及微循环的变化。结果 BMSCs源内皮样细胞移植后,局部VEGF水平升高、凝血因子FⅧ染色阳性细胞数增加,染色加深;局部微血管内膜较光滑,细胞核形态较规则,基底膜较完整,微血管管腔受压缓解。结论 BMSCs源内皮样细胞移植促进损伤区周围内皮细胞增殖和新生血管形成,损伤区局部微循环得以改善。     

骨髓间充质干细胞静脉注射移植对脑缺血大鼠脑内神经细胞增殖和分化的影响

目的观察骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）经静脉注射移植对缺血/再灌注脑内神经细胞增殖和分化的影响。方法体外培养和扩增成年雄性大鼠BMSCs;以“四管阻断法”制作大鼠前脑缺血/再灌注模型;造模后3、5、7d通过尾静脉注射Hoechst33342标记的BMSCs（2×10^6/1ml/只）,另设对照组于相同时间点通过尾静脉注射载体溶液。于造模后4周处死大鼠,取脑切片,HE染色观察大鼠海马缺血性损伤情况;BrdU/GFAP、BrdU/MAP2和BrdU/Hoechst33342免疫荧光双标染色,观察大鼠脑内神经细胞的增殖及分化情况。结果BMSCs移植组海马CA1区存活锥体细胞数显著多于载体溶液对照组（P〈0.05）。BMSCs移植大鼠脑内海马结构BrdU阳性细胞数显著多于载体溶液对照组（P〈0.05）,BrdU/MAP-2双标阳性细胞占BrdU阳性细胞的比例显著高于载体溶液对照组（P〈0.05）。结论BMSCs经静脉注射移植能够减轻缺血性脑损伤,促进宿主脑内自体神经细胞增殖,并提高其分化为神经元样细胞的比例。     

丹参诱导鼠骨髓间充质细胞向神经元分化

目的：研究丹参对鼠骨髓间充质细胞的分化作用。方法：丹参注射液诱导鼠骨髓间充质细胞向神经元方向分化，采用免疫细胞化学方法对分化的和未分化的细胞进行鉴定。结果：丹参可诱导鼠骨髓间充质细胞向神经细胞分化，分化的细胞早期表达巢蛋白和Musashi1蛋白，后期则表达神经元的标志物神经元特异性醇化酶和神经微丝M，在最适合的诱导条件下约50％-60％的细胞表达这两种神经元的标志物。结论：骨髓组织中存在能分化为神经元的干细胞，丹参能够诱导这种干细胞向神经元分化，这种细胞可能成为中枢神经系统自体细胞移植的另一个干细胞的来源。     

Transplantation of bone marrow stromal cells for peripheral nerve repair

Cell transplantation using bone marrow stromal cells (BMSCs) to alleviate neurological deficits has recently become the focus of research in regenerative medicine. Evidence suggests that secretion of various growth-promoting substances likely plays an important role in functional recovery against neurological diseases. In an attempt to identify a possible mechanism underlying the regenerative potential of BMSCs, this study investigated the production and possible contribution of neurotrophic factors by transected sciatic nerve defect in a rat model with a 15 mm gap. Cultured BMSCs became morphologically homogeneous with fibroblast-like shape after ex vivo expansion. We provided several pieces of evidence for the beneficial effects of implanted fibroblast-like BMSCs on sciatic nerve regeneration. When compared to silicone tube control animals, this treatment led to (i) improved walking behavior as measured by footprint analysis, (ii) reduced loss of gastrocnemius muscle weight and EMG magnitude, and (iii) greater number of regenerating axons within the tube. Cultured fibroblast-like BMSCs constitutively expressed trophic factors and supporting substances, including nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), collagen, fibronectin, and laminin. The progression of the regenerative process after BMSC implantation was accompanied by elevated expression of neurotrophic factors at both early and later phases. These results taken together, in addition to documented Schwann cell-like differentiation, provide evidence indicating the strong association of neurotrophic factor production and the regenerative potential of implanted BMSCs.     

The effect of bone marrow stromal cells on neuronal differentiation of mesencephalic neural stem cells in Sprague-Dawley rats

There are numerous parallels between the heamatolymphopoietic and nervous systems in terms of the mechanisms regulating their development. We proposed that neural stem cells (NSCs) may respond to the microenvironmental signals provided by bone marrow stromal cells (BMSCs) which regulate the differentiation and maturation of hematolymphopoietic stem cells. First, we isolated and proliferated BMSCs from the femur and tibia, and NSCs from the midbrain of Sprague-Dawley (SD) rats, and then investigated the effects of BMSCs on the differentiation of NSCs into neurons, astrocytes and oligodendrocytes by directly plating neurospheres on BMSC monolayers in serum-free conditions. The results confirmed that BMSCs induced NSCs to differentiate selectively into neurons. The percentage of neurons significantly increased in 7 days in vitro co-cultures of NSCs and BMSCs as compared to NSCs cultures alone. When the duration of the cultures was extended to 12 days in vitro, BMSCs enhanced the survival of neurons derived from these NSCs; our investigation then focused on the underlying mechanism for this effect of BMSCs. NSCs were cultured with BMSC conditioned-medium and co-cultured with membrane fragments of live BMSCs or paraformaldehyde fixed BMSCs, the inducing activity of BMSCs was solely detectable in BMSC conditioned-medium, indicating that soluble factors secreted by BMSCs were responsible for its effect on the neuronal differentiation of NSCs. Therefore, BMSCs may provide a powerful tool for therapeutic neurological applications.     

慢病毒介导bFGF基因修饰的骨髓基质细胞对脑梗死后血管新生的影响

目的探讨慢病毒介导碱性成纤维细胞生长因子（basic fibrobla stgrowth factor,bFGF）基因修饰的骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）对脑梗死后血管新生的影响。方法利用慢病毒载体介导bFGF基因修饰BMSCs,获得稳定转染bFGF的BMSCs。脑梗死后1d立体定向移植至梗死灶周围。在MCAO术前及术后1、3、7、14d进行神经功能评分。术后14d股静脉注射异硫氰酸荧光素右旋糖酐（FITC-dextran）标记微血管,结合共聚焦显微镜和3DDoctor3．5版软件分析梗死灶周围区微血管的直径、面积及血管分支数目。结果bFGF-BMSCs组术后3d神经功能恢复明显优于对照组与BMSCs组（P〈0．05）,BM—SCs组和bFGF-BMSCs组术后7d及14dmNSS评分显著低于对照组（P〈0．05）,而且bFGF-BMSCs组神经功能恢复好于BMSCs组（P〈O．05）。bFGF-BMSCs组微血管直径、分支数目及面积显著性高于对照组（P〈0．01）和BMSCs组（P〈0．05）。结论bFGF修饰的B^假瞄能更好地促进脑梗死后神经功能恢复及血管新生。     

损伤脑组织诱导骨髓基质细胞向神经元方向分化

目的　探讨损伤脑组织对骨髓基质细胞分化的诱导作用。方法　分离培养SD大鼠骨髓基质细胞 ,以损伤脑组织匀浆诱导骨髓基质细胞分化 ,相差显微镜及免疫细胞化学染色检测诱导结果。结果　诱导后 ,骨髓基质细胞出现分化 ,细胞形态改变 ,胞体呈锥形 ,突起交织成网 ,免疫细胞化学染色表达NSE和tubulin β,分化率达到 30 2 %± 4 0 9%。 结论　损伤脑组织匀浆可诱导骨髓基质细胞向神经细胞分化 ,骨髓基质细胞有可能用于神经系统损伤修复     

经静脉移植骨髓基质细胞治疗大鼠局灶性脑梗死Bcl-2蛋白表达的实验研究

目的　观察经静脉移植骨髓基质细胞(MSCs)治疗大鼠局灶性脑梗死时bcl- 2蛋白的表达。方法　体外培养及扩增骨髓基质细胞后,将实验大鼠2 4只分为3组:第1组(n=8)单纯大脑中动脉闭塞(MCAO)组;第2组(n=8) ,MCAO后4 8h经尾静脉注射生理盐水1ml;第3组(n=8) ,MCAO后4 8h经尾静脉注射1×10 7个MSCs。神经功能严重程度评分日一次进行。所有动物均在MCAO后第8天处死。用免疫细胞化学方法体外鉴定骨髓基质细胞;免疫组织化学染色显示鼠脑内bcl- 2蛋白表达情况。结果　原代培养2 0 d后可分离得到骨髓基质细胞,在5代以前生长形态相对稳定。与对照组相比,实验组大鼠的神经功能严重程度评分有明显改善(P<0 .0 0 1) ,且脑内bcl-2表达增加(P<0 .0 0 1)。结论　经静脉移植骨髓基质细胞可明显改善大鼠局灶性脑梗死后神经功能恢复,并可上调脑内bcl- 2蛋白表达水平。     

pEGFP-C2基因核转染兔原代骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨以最近发展起来的核转染技术直接将编码绿色荧光蛋白DNA质粒转染到兔原代骨髓基质细胞的细胞核内进行基因修饰的可行性。方法从兔股骨抽取骨髓,密度梯度离心法获取原代骨髓基质细胞。以NucleofectorTM技术转染pEGFP-C2(EGFP组),以同期培养未转染的细胞作为对照组。测定细胞的活力、贴壁率、生长曲线以及转染的效率。结果在转染后24h成功发现EGFP的表达。两组细胞具有相似的形态学变化、贴壁率以及生长曲线。EGFP的表达逐渐增强,至第6天达到最高峰(47.8%),观察一个月未发现表达减弱。结论pEGFP-C2基因核转染对兔原代骨髓基质细胞的体外增殖无明显影响;EGFP可以作为兔骨髓基质细胞有效的基因表达标记;NucleofectorTM技术是一种简易而高效的转染兔原代骨髓基质细胞的方法。     

骨髓间充质干细胞源性神经细胞对C6胶质瘤的趋向性

目的探索骨髓间充质干细胞(BMSCs)源性神经细胞对C6胶质瘤的趋向性。方法阿尔法最低必需培养基(α-MEM)、神经细胞生长添加剂B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)和全反式维甲酸(ATRA)诱导BMSCs向神经细胞分化。体外通过Transwell系统共培养BMSCs源性神经细胞与C6胶质瘤细胞培养基,HE染色分析穿过聚醋酸纸膜微孔的细胞数量;体内在C6胶质瘤模型中移植5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的BMSCs源性神经细胞,免疫组化分析移植细胞的迁移能力。结果条件培养基诱导BMSCs分化的细胞表达神经元核抗原(NeuN)为47%±0.08%,高分子量神经丝蛋白(NF-H)为45%±0.07%及部分巢蛋白(Nestin)为10%±0.04%,体外Transwell结果显示BMSCs源性神经细胞透过聚碳酸酯膜微孔的数量明显高于对照组(P<0.05),体内移植结果显示BMSCs源性神经细胞与BMSCs对胶质瘤的迁移无明显差异(P>0.05)并呈现时间特异性(P<0.01)。结论 BMSCs源性神经细胞对C6胶质瘤有明显的趋向性。     

体外培养人体脂肪基质细胞和骨髓基质细胞的成骨活性对比

背景：目前组织工程骨构建研究中的种子细胞主要来源于骨、骨膜、骨髓及骨外组织,近年来的研究多集中于骨髓基质细胞。而脂肪中基质细胞的发现,有望取代骨髓基质细胞。 目的：观察体外培养脂肪基质细胞与骨髓基质细胞的生物学特性,并比较二者成骨诱导后的碱性磷酸酶活性,从成骨活性方面来评价脂肪基质细胞能否取代骨髓基质细胞。 方法：手术中收集同一人体的脂肪组织与骨髓组织。脂肪组织经机械切割后以Ⅰ型胶原酶消化获得脂肪基质细胞,骨髓组织以淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离骨髓基质细胞;体外培养、传代后以诱导培养液行成骨诱导培养。诱导后第2,3周各检测1次细胞中的碱性磷酸酶活性,并行Von Kossa钙结节染色鉴定成骨细胞。 结果与结论：共获得15例患者的脂肪与骨髓组织,其中10例完成实验。与骨髓基质细胞相比,脂肪基质细胞更易培养成活,扩增速度快;二者细胞形态相似,诱导培养后细胞外基质中均有黑色的钙结节形成;碱性磷酸酶活性二者差异无显著性意义(P > 0.05)。结果提示脂肪组织来源丰富,脂肪基质细胞成活容易,具有与骨髓基质细胞相似的生物学性能,且易培养、增殖快,二者的成骨活性相似,脂肪基质细胞比骨髓基质细胞更具有优势。