细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导人脐静脉内皮细胞

目的研究PEP-1-EGFP融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的能力。方法用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育,分别观察其进入细胞的能力及PEP-1-EGFP进入细胞的时间依赖性、剂量依赖性和稳定性,并用MTT法检测PEP-1-EGFP融合蛋白对细胞的毒性。结果EGFP蛋白不能进入细胞内。PEP-1-EGFP融合蛋白可在5min内穿透人脐静脉内皮细胞,其穿透人脐静脉内皮细胞的能力呈时间和剂量依赖性,进入细胞后27h仍可观察到微量绿色荧光。PEP-1-EGFP蛋白浓度达200μmol/L时对细胞仍无毒性。结论PEP-1能有效携带目的蛋白进入人脐静脉内皮细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的抗氧化物质穿透内皮细胞治疗缺血再灌注损伤奠定了基础。     

PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞

目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP，在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2＋-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达，纯化后的蛋白浓度为6．18mg／ml，蛋白产量为14．15mg／100ml菌液，SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP，细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。     

PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导入人主动脉平滑肌细胞

目的:研究细胞穿透肽PEP-1携带大分子蛋白穿透人平滑肌细胞的能力。方法:用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和培养的人平滑肌细胞共同孵育,在荧光显微镜下直接观察PEP-1介导目的蛋白EGFP转导入人平滑肌细胞的能力。结果:EGFP蛋白不能进入细胞内,PEP-1-EGFP融合蛋白和人平滑肌细胞共同孵育1h后可见有明亮绿色荧光分布于胞浆和胞核。结论:PEP-1能有效携带目的蛋白进入人平滑肌细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的大分子抗平滑肌细胞增殖进行血管成形术后再狭窄的蛋白治疗奠定了基础。     

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白穿透在体小鼠皮肤

目的:研究细胞穿透肽PEP-1介导的增强型绿色荧光蛋白穿透小鼠皮肤的能力。方法:用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,分别将1mg的蛋白涂抹在昆明小鼠背部皮肤上,4 h后处死小鼠取背部皮肤冰冻切片后立即在倒置荧光显微镜下观察。结果:EGFP处理的小鼠皮肤仅在角质层表面有少量荧光,PEP-1-EGFP融合蛋白处理的小鼠皮肤可见绿色荧光穿透角质层并分布于表皮和真皮内。结论:PEP-1-EGFP融合蛋白能穿透小鼠皮肤角质层并分布于表皮和真皮内,这为将来用细胞穿透肽PEP-1经皮转导大分子药物治疗各种皮肤病以及全身系统性疾病奠定了基础。     

PEP-1肽介导入过氧化氢酶转导入人脐静脉内皮细胞

目的：采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株（CRL-1730），研究PEP-1肽介导入过氧化氢酶穿透细胞的能力。方法：构建原核表达质粒pET15b—PEP-1-CAT，将其在基因工程菌中表达出N端带有6个组氨酸“标签”（His—tag）的重组蛋白，并通过金属螯合亲和层析对其进行纯化，然后将纯化得到的PEP-1-CAT融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞，通过Western　blot来分析其转导能力。结果：测序分析证实，原核表达质粒pET15b—PEP-1-CAT重组成功。SDS—PAGE和Western blot结果表明，PEP-1-CAT在E．coli中获得了高效表达，经Ni^2＋ -NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-CAT，并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性，活性值为77．1U／g。将其加入到体外培养的内皮细胞培养基中，发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内，并能保持酶活性达48h。结论：PEP-1-CAT融合蛋白能高效地转导入人脐静脉内皮细胞，为防治各种与氧化应激损伤有关的疾病开辟了新的途径。     

PEP-1肽介导人过氧化氢酶转导入人脐静脉内皮细胞

目的:采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株(CRL-1730),研究PEP-1肽介导人过氧化氢酶穿透细胞的能力。方法:构建原核表达质粒pET15b-PEP-1-CAT,将其在基因工程菌中表达出N端带有6个组氨酸“标签”(His-tag)的重组蛋白,并通过金属螯合亲和层析对其进行纯化,然后将纯化得到的PEP-1-CAT融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞,通过Western blot来分析其转导能力。结果:测序分析证实,原核表达质粒pET15b-PEP-1-CAT重组成功。SDS-PAGE和Western blot结果表明,PEP-1-CAT在E.coli中获得了高效表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.1 U/g。将其加入到体外培养的内皮细胞培养基中,发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内,并能保持酶活性达48 h。结论:PEP-1-CAT融合蛋白能高效地转导入人脐静脉内皮细胞,为防治各种与氧化应激损伤有关的疾病开辟了新的途径。     

细胞穿透肽PEP-1介导过氧化氢酶转导大鼠心肌H9C2细胞

目的:探索细胞穿透肽PEP-1介导的人过氧化氢酶转导入H9C2细胞的能力。方法:利用基因工程方法表达和纯化His-tag-PEP-1-CAT及His-tag-CAT融合蛋白后,与体外培养的H9C2细胞株共孵育,利用免疫细胞荧光技术和Westernblot检测PEP-1-CAT融合蛋白是否转导入H9C2细胞内;并检测H9C2细胞内的过氧化氢酶活性。结果:制备的PEP-1-CAT融合蛋白纯度为90%以上,其浓度达0.501mg/mL;PEP-1介导的CAT融合蛋白能高效转导入H9C2细胞内,呈时间及剂量依赖性,6h时达峰值;转导入H9C2细胞内的融合蛋白的过氧化氢酶活性亦呈现出时间及剂量依赖的特点。结论:PEP-1-CAT能高效稳定转导入H9C2细胞内,为PEP-1介导的过氧化氢酶防治心肌缺血/再灌注损伤研究奠定基础。     

细胞穿透肽核靶向运输蛋白表达载体的构建及其蛋白转导功能的研究

目的 构建基于细胞穿透肽靶向细胞核运输的蛋白表达载体，并研究其蛋白转导功能。方法 在带His标记的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达载体pET14b—HE（pET14b-His-EGFP）基础上，利用点突变的方法构建依次含细胞穿透肽（CPP）、连接子、核定位信号（NLS）序列和EGFP的融合蛋白表达载体pET14b—HC（L）NE（pET14b—His—CPP—Linker-NLS—EGFP）；经酶切、测序鉴定载体构建正确后，将重组质粒转化BL21（DE3）宿主菌，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达后、用Ni^2＋亲和层析纯化得到融合蛋白：将融合蛋白透析、过滤除菌后加入培养的真核细胞中，荧光显微镜下观察并进行Western blot检测分析其在活细胞的蛋白转导功能。结果 酶切、测序证实载体构建成功，融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达：蛋白转导实验可见融合蛋白可快速穿透细胞膜并进入细胞核，并且这种内化转导功能存在时间和剂量依赖效应。结论 成功构建了基于细胞穿透肽的蛋白表达运输载体，建立了可携带外源蛋白进入细胞浆及细胞核的运输系统，为研究蛋白或多肽的细胞内功能以及运输药物提供了一种经济有效的工具。     

反式激活蛋白转导结构域介导绿色荧光蛋白在小鼠体内的跨膜转运

目的探讨HIV-1反式激活蛋白（TAT）的蛋白转导结构域（PAD）介导绿色荧光蛋白（EGFP）在小鼠体内的跨膜转运作用。方法采用PCR及克隆技术构成表这载体pET28a—TAT—EGFP，在大肠杆菌中表达TAT—EGFP融合蛋白。将纯化后的融合蛋白注入小鼠尾静脉，取脑、心肌、肝、脾和肾等器官冰冻切片，荧光显微镜下观察融合蛋白在组织中的分布。结果表达和纯化了分子量为28KD的TAT—EGFP融合蛋白。在小鼠的肝、心肌、脑、肾和脾等组织切片荧光检测呈阳性。结论TAT可介导EGFP在广泛组织内的跨膜转导，这一研究为外源活性大分子物质进入组织细胞提供了一个新的途径。     

HEREDITARY PROTEIN S DEFICIENCY——SURVEY OF A CHINESE FAMILY

A 76-year-old woman was diagnosed as having left lilac deep vein thrombosis due to a hereditary deficiency of protein S, seventeen members of her family were studied with the measurements of total protein S (TPS), free protein S (FPS), protein C (PC) and anti-thrombin-Ⅲ(AT-Ⅲ). The results showed that the level of FPS of thepatient was only 7%, while that of TPS 137.1%. Her secondson had a low FPS level (13.4%) too, and his TPS level was 48.1%. PC and AT-Ⅲwere all normal It was thus the first case of hereditary PS dificiency reported in China.     

Akt的PH结构域与其调节区的结合

目的 从人T细胞中克隆Akt的PH结构域及其调节区基因并进行6-his和GST融合表达，研究二者的体外结合情况，为进一步研究Akt的调节区在其分子激活中的作用打下基础。方法 以RT-PCR的方法从人T细胞中扩增目的基因片段，测序证明序列正确，再将正确的目的基因片段定向克隆到表达载体pRSET-A和pGEX-4T-1中，以IPTG诱导，获得Akt的PH结构域及其调节区与6-his和GST的融合表达。表达的PH结构域融合蛋白经谷胱甘肽耦联的琼脂糖珠纯化，以pull-down法检测该PH结构域与6-his调节区的结合。结果 Akt的PH结构域和调节区基因序列完全正确。得到与GST和6-his的融合表达，表达产物有较高可溶性。结论 SDS-PAGE检测到PH结构域可在体外与调节区特异地结合。     

绿色荧光蛋白-小鼠纤维介素蛋白融合基因表达载体的构建和表达

目的：构建绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠纤维介素蛋白(mfgl2)的融合蛋白表达载体，在仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，为mfgl2的RNA干扰体外研究提供简便的判断手段。方法：用PCR从mfgl2cDNA文库中扩增出mfgl2cDNA片段，插入到GFP表达载体pEGFP—N2中GFP基因序列的上游，构建成GFP—mfgl2融合基因表达载体pEGFP—mfgl2，将该载体转染到CHO细胞后24—48h，通过荧光显微镜观察并摄片。结果：扩增出长约1．3kb的基因片段，经双酶切鉴定和测序鉴定无误；重组载体转染CHO细胞后，在荧光显微镜下可观察到GFP的表达。结论：成功构建了pEGFP．mfgl2融合基因表达载体；重组载体可在CHO细胞中表达出GFP—mfgl2融合蛋白，为下一步进行mfgl2RNA干扰研究提供了简便的判断手段。     

鼠尾胶原蛋白提取、分离、纯化方法的建立及鉴定

目的建立一种高效提取、分离、纯化鼠尾胶原蛋白的方法。方法通过对鼠尾进行剥离获得鼠尾腱,用Tris-HCl缓冲液、胃蛋白酶处理获得鼠尾胶原蛋白原液、反复使用氯化钠溶液进行分级盐析、醋酸溶液复溶进行鼠尾胶原蛋白的纯化。超纯水透析除去无机盐类获得纯化的鼠尾胶原蛋白。通过SDS-PAGE蛋白质电泳、氨基酸含量分析等技术手段鉴定。结果本研究建立的方法可以获得高纯度的鼠尾胶原蛋白,纯度达到电泳纯。与国外进口的商业化鼠尾胶原蛋白产品相比无差异。研究了提取、分离、纯化参数对得率、纯度的影响,建立了最优的鼠尾胶原蛋白提取条件,胃蛋白酶用量:1∶500,酶解时间:72 h,盐析浓度:2 mol/L,提取所用酸溶液:0.05mol/L醋酸溶液。结论为鼠尾胶原蛋白的扩大化生产提供了合适的工艺参数,为大量获得鼠尾胶原蛋白并进行更深层次的功效方面研究提供了理论支持和实践基础。     

Survivin、Her-2、P16和PTEN在膀胱癌中的表达及意义

目的研究Survivin、Her2、P16和PTEN蛋白在膀胱癌中的表达及其生物学意义。方法采用免疫组织化学SP法检测43例膀胱移行细胞癌和10例正常膀胱组织中以上4种蛋白的表达。结果4种蛋白在膀胱癌中的表达与在正常膀胱黏膜比较差异均有显著性意义(均为P<0.01)。不同临床分期间Her2和PTEN表达的差异具有显著性意义(P<0.05);不同病理分级间Survivin、Her2和PTEN表达的差异具有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。Her2和Survivin蛋白表达间存在正相关(r=0.821,P<0.05)。结论Her2和Survivin的高表达是膀胱癌预后不良的指征;P16可作为早期诊断的标记物;PTEN则可作为膀胱癌预后不良的独立性指标。     

亲和层析纯化重组中性粒细胞激活蛋白

目的:直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化重组麦芽糖结合蛋白-中性粒细胞激活蛋白(recombinantmaltose-binding protein-neutrophil-activating protein,rMBP-NAP)。用于支气管哮喘模型小鼠进行免疫调节实验。方法:IPTG诱导基因工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-nap)表达rMBP-NAP,离心收获细胞,过柱缓冲液重悬菌体并超声破碎,再次离心取上清和沉淀,SDS-PAGE分析rMBP-NAP可溶性;直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化rMBP-NAP;SDS-PAGE凝胶扫描分析纯化后rMBP-NAP纯度;蛋白定量试剂盒测定rMBP-NAP浓度。结果:IPTG诱导工程菌表达的rMBP-NAP主要以可溶性形式存在于超声上清中,相对分子质量约为57 kD,与预期结果一致;亲和层析法纯化rMBP-NAP纯度可达96.5%,浓度可达0.625 g/L。结论:用直链淀粉树脂亲和层析法,可纯化得到高纯度、高浓度的融合蛋白rMBP-NAP。     

骨肉瘤p16与Rb蛋白的表达及其相关性的研究

目的 检测ｐ１６和Ｒｂ蛋白在骨肉瘤中的存在情况，以探讨骨肉瘤中ｐ１６和Ｒｂ蛋白的表达及其相关性。方法 采用免疫组化ＡＢＣ法对３２例骨肉瘤手术标本使用抗ｐ１６和Ｒｂ蛋白抗体进行检测。结果 ｐ１６和Ｒｂ蛋白阳性表达分别为３７．５％（１２／３２）和５６．３％（１８／３２）；在１２例Ｒｂ蛋白阳性或强阳性表达的骨肉瘤中，ｐ１６蛋白表达缺失或弱阳性表达８例（６７％）；相反，在１０例Ｒｂ蛋白阴性或弱阳性表达中，     

肺癌组织中Fhit蛋白和PCNA蛋白表达及意义

目的　探讨肺癌组织中Fhit蛋白和PCNA蛋白表达及其与临床病理因素的关系。方法　应用免疫组织化学S P法检测 6 2例肺癌组织中Fhit蛋白和PCNA蛋白表达。结果　肺癌组织中Fhit蛋白和PCNA蛋白表达阳性率分别为 5 3.2 %和6 4 .5 % ,PCNA蛋白表达阳性肺癌Fhit蛋白阳性率明显低于PCNA蛋白表达阴性肺癌 (P <0 .0 1)。Fhit蛋白和PCNA蛋白在肺癌中表达与肺癌的分化程度、淋巴结转移、3年生存期均密切相关 ,PCNA蛋白与肺癌病理类型亦有关。结论　Fhit蛋白和PC NA蛋白异常表达与肺癌发生、发展密切相关 ,二者相互抑制 ,呈明显负相关     

树舌多糖对HepA小鼠瘤细胞蛋白质表达影响的研究

目的探讨树舌多糖抗肿瘤的作用机制,寻找特异蛋白。方法将各组小鼠的眼血清蛋白、匀浆蛋白、膜糖蛋白分别做PAGE电泳,分析其蛋白组分的变化。结果树舌多糖作用后血清蛋白、匀浆蛋白、膜糖蛋白的蛋白组分都有变化。     

非小细胞肺癌患者肺耐药蛋白和多药耐药相关蛋白的表达及其临床意义

目的 检测肺耐药蛋白和多药耐药相关蛋白在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达情况.并探讨其临床意义.方法 采用免疫组化方法对术前未经化疗、术后病理诊断明确的92例肺癌组织标本并以20常肺组织作为对照进行了多药耐药相关蛋白（MRP）、肺耐药蛋白（LRP）表达的检测.并对病理类型、分化程度、临床分期、预后等进行统计学分析.结果 （1）92例肺癌组织中MRP、LRP及其两者共表达的阳性率分别为53%、52%和45%,均显著高于正常肺组织中的表达水平（P〈0.05）.（2）MRP、LRP蛋白表达在不同病理类型、不同分化程度之间具有统计学差异（P〈0.05）,而在不同年龄、性别、临床分期、淋巴结转移情况等均无明显差异.另外,MRP、LRP蛋白的表达与患者预后密切相关,且随着耐药蛋白表达种类的增加,生存曲线水平下降.结论 NSCLC中MRP、LRP的表达可能在肺癌的原发性多药耐药中起不同程度的作用,检测NSCLC中MRP、LRP在判断患者预后.指导肿瘤化疗方面具有重要的临床意义.