BCSC-1基因异位表达致鼻咽癌细胞CNE-2L2黏附性增强及细胞周期阻滞

目的探讨BCSC-1基因异位表达导致人鼻咽癌细胞CNE-2L2恶性行为减弱的机制。方法采用碘化丙啶染色DNA,流式细胞法检测细胞周期;Hoechest33258染色分析细胞分裂情况;细胞聚集实验检测细胞的黏附性;Western印迹分别检测E-钙黏蛋白、α-catenin和p53的表达。结果细胞周期分析显示异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞、野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞分别有55.1%、43.4%和39.4%处于G0/G1期,分别有25.2%、28.7%和30.9%处于S期,分别有19.7%、27.9%和29.7%处于G2/M期。野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞有较多细胞处于有丝分裂相,异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞几乎见不到有丝分裂相。异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞的黏附性和E-钙黏蛋白、α-catenin及p53的表达水平均高于野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞。结论异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞的黏附性增强可能与E-钙黏蛋白和α-catenin表达增强相关;异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞阻滞于G1期可能与p53表达增加相关。这些变化可能在细胞恶性行为减弱中发挥作用。     

腺病毒介导BCSC-1基因实验性治疗鼻咽癌

目的探讨抑癌基因BCSC-1对肿瘤的治疗作用。方法制备重组腺病毒Ad5-BCSC-1。用CellTiter 96 A-queous细胞增殖单一溶液检测试剂盒检测细胞增殖。肿瘤体内注射Ad5-BCSC-1,以注射Ad5-egfp或PBS作为对照,1周后重复注射,再2周后处死小鼠,称瘤重。结果Ad5-BCSC-1感染的CNE-2L2细胞的生长明显减慢,细胞在培养中聚集成大细胞团块。注射PBS、Ad5-egfp和Ad5-BCSC-1的小鼠CNE-2L2肿瘤的平均瘤重分别为(2·28±0·73)、(2·07±0·40)和(0·58±0·32)g。Ad5-BCSC-1组显著低于PBS和Ad5-egfp组(P<0·05)。结论瘤体内注射Ad5-BCSC-1能抑制CNE-2L2肿瘤的生长,提示BCSC-1基因治疗对BCSC-1基因缺失或表达低下的肿瘤可能有治疗作用。     

3p21.3区域肺癌相关基因RASSF1A的抑癌功能研究

目的观察将野生型RASSF1A通过质粒载体pcDNA3.1导入不表达该基因的非小细胞肺癌(NSCL)细胞系A549后,肺癌细胞生物学特性的变化.方法通过脂质体Lipofectamine2000将质粒载体pcDNA3.1,pcDNA3.1-RASSF1A分别转染入A549细胞系中,通过流式细胞仪检测瞬时转染该基因对细胞周期的影响以及是否诱发凋亡;通过绘制细胞生长曲线,MTT检测,以及集落形成实验来分析稳定转染细胞的生物学特性;同时分析稳定转染RASSF1A对A549细胞裸鼠转移能力的影响.结果瞬时转染RASSF1A使细胞周期阻断在G1/S期(P<0.001);稳定转染该基因的细胞其增殖能力和集落形成能力均显着下降(P<0.01),同时裸鼠转移能力也明显被抑制(P<0.01).结论野生型RASSF1A基因的外源性表达能显著抑制肿瘤细胞的生长和转移,提示该基因在肺癌的发生发展中发挥重要作用.     

VP3对鼻咽癌细胞CNE-2细胞株的体外杀伤效应

目的：体外实验观察VP3对鼻咽癌CNE-2细胞株的杀伤效应。方法：构建质粒表达载体pcDNA3．1（-）CMV．V3-His,KpnI／EcoR I酶切鉴定,测序分析VP3基因序列。脂质体法将pcDNA3．1（-）CMV．VP3-His和pcDNA3．1（-）-His分别瞬时转染鼻咽癌细胞CNE-2细胞株,Western印迹鉴定VP3基因的表达。四甲基偶氮唑盐（methylthiazoletetrazolium,MTT）法检测VP3对鼻咽癌细胞株CNE-2的杀伤效应。结果：酶切和测序分析证实重组质粒中包含完整的忡,基因的编码序列,Western印迹在转染细胞总蛋白中检测到该基因表达的16．03kD的蛋白。表达VP3基因的CNE-2细胞生长受到抑制,而不表达忡;基因的CNE-2细胞生长未受到抑制。结论：VP3可杀伤鼻咽癌细胞CNE-2细胞株。     

野生型p53基因重组质粒的构建及对人卵巢癌细胞的抑制作用

目的:研究p53基因转染对卵巢癌细胞系SKOV-3生物学行为的影响.方法:用分子克隆技术构建人野生型p53基因与真核细胞表达载体PCNDA3的重组体(PCNDA-p53),并用脂质体介导的转染技术,将其导入不表达p53的人卵巢癌SKOV-3细胞中,经筛选、鉴定后,观察细胞生长速度、集落形成能力和增殖周期的变化.结果:成功地构建了人野生型p53基因与真核细胞表达载体的重组体,转染后获得稳定表达p53的转染克隆.外源性p53基因的表达明显抑制了卵巢癌细胞的生长速度及集落形成能力,使细胞阻滞于G1期.结论:外源性野生型p53基因能抑制卵巢癌细胞的增殖.     

靶向hTERT基因的microRNA前体质粒抑制鼻咽癌细胞生长的体内实验研究

目的 构建并筛选靶向人端粒酶逆转录酶基因的microRNA前体(pre-microRNA)质粒,通过体内实验验证该质粒对鼻咽癌CNE-2细胞生长的抑制作用.方法 设计3对针对hTERT基因不同位点的pre-microRNA(茎环结构的前体)片段,构建携带比序列的真核表达质粒(pre-miR-Htert1-3)并测序鉴定.脂质体法瞬时转染重组质粒到鼻咽癌CNE-2细胞,采用pre-time RT-PCR筛选出对hTERT基因表达抑制作用最强的质粒;在稳定转染的CNE-2细胞中,用软琼脂集落形成实验和Western blot进一步确认该质粒作用;在裸鼠体内实验中,观察肿瘤生长情况,并以免疫组化检测肿瘤中hTERT的表达.结果 重组质粒经测序证实构建成功.与PBS组相比,3种质粒分别使hTERT基因mRNA水平下降77.3%、15.1%和9.5%;筛先的出pre-miR-Htert1在稳定转染的CNE-2细胞中,使细胞hTERT蛋白下调、细胞集落形成能力下降;建立了人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,发现pre-miR-Htert1对裸鼠移植瘤生长抑制率为64.8%,并且使肿瘤内hTERT表达下降.结论 成功构建并筛选出靶向hTERT基因的pre-microRNA真核表达质粒,通过体外和体内实验证实,该质粒对鼻咽癌CNE-2细胞内的hTERT 基因表达具有明显抑制作用,并且有效抑制了肿瘤的生长.     

基因转染3T3细胞的hTGFβ1表达

目的鉴定重组pcDNA3.1-TGFβ1载体在真核细胞中的表达,为其在软骨组织工程中的基因转染创造条件.方法利用脂质体Fugene 6将TGFβ1真核表达载体转染至NIH3T3细胞,RT-PCR、ELISA检测hTGFβ1基因的表达,并利用CCL/64细胞株鉴定重组hTGFβ1的生物学活性. 结果质粒转染3T3细胞后,hTGFβ1mRNA及其蛋白的表达均显著增强,且分泌表达的hTGFβ1能明显抑制CCL/64细胞的生长结论重组载体在3T3细胞中能表达具有一定生物学活性的hTGFβ1。     

高表达α1-AT基因抑制肺腺癌细胞VEGFm RNA表达

目的:观察高表达α1-AT基因对肺腺癌细胞生长曲线以及血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达水平的影响,探讨高表达α1-AT基因在肺腺癌血管生成中的作用。方法:以脂质体为载体将重组质粒pcDNA3.1(+)-α1-AT转染至人腺癌细胞株A549,利用G418筛选获得阳性克隆;采用细胞计数法绘制转染前后细胞生长曲线;RT-PCR法半定量分析转染前后细胞中VEGF的表达水平的变化。结果:转染α1-AT基因后,A549细胞生长受到抑制,VEGFmRNA表达水平下降,较未转染α1-AT的细胞有显著性下降。结论:高表达α1-AT基因能够抑制肺腺癌细胞VEGFmRNA表达,抑制肿瘤血管的形成。     

PCDH8基因表达对鼻咽癌细胞生物学效应的影响

目的 探讨PCDH8基因表达对鼻咽癌细胞株CNE-1生物学行为的影响.方法 采用脂质体介导质粒pcDNA3.1-PCDH8(实验组)与质粒pcDNA3.1(对照组)转染至鼻咽癌细胞株CNE-1,RT-PCR、Western blot检测转染后CNE-1细胞的PCDH8 mRNA及蛋白表达;通过CCK-8细胞生长曲线、流式细胞技术、Transwell侵袭实验及CCK-8细胞药物敏感实验,进一步对转染PCDH8基因质粒的细胞株CNE-1的增殖能力、生长周期、细胞侵袭能力及对化疗药物的敏感性进行了分析,并与转染对照质粒的细胞株进行比较.结果 RT-PCR、Western blot检测结果表明转染质粒pcDNA3.1-PCDH8的实验组细胞株中PCDH8 mRNA及蛋白成功表达并明显高于转染质粒pcDNA3.1的对照组细胞株.CCK-8细胞生长曲线结果表明实验组细胞株的生长速度明显低于对照组.流式细胞仪检测结果表明实验组细胞株G0/G1期较对照组增加,S期细胞较对照组减少;Transwell侵袭实验结果表明实验组细胞株侵袭能力明显低于对照组;CCK-8细胞药物敏感性实验结果表明PCDH8基因的高表达能显著提高鼻咽癌细胞株CNE-1对顺铂化疗药物的敏感性.结论 PCDH8基因的表达能降低鼻咽癌细胞的增殖、侵袭能力,延缓细胞分裂周期,提高对顺铂化疗药物的敏感性.     

基因转染3T3细胞的hTGFβ1表达

目的：鉴定重组pcDNA3.1-TGFβ1载体在真核细胞中的表达，为其在软骨组织工程中的基因转染创造条件。方法：利用脂质体Fugene6将GFβ1真核表达载体转染至NIH3T3细胞，RT-PCR、ELISA检测h TGFβ1基因的表达，并利用CCL/64细胞株鉴定重组hTGFβ1的生物学活性。结果：质粒转染3T3细胞后，hTGFβ1mRNA及其蛋白的表达均显著增强，且分泌表达的hT GFβ1能明显抑制CCL/64细胞的生长。结论：重组载体在3T3细胞中能表达具有一定生物学活性的hTGFβ1。     

IκBα突变体的真核表达载体构建及表达

目的:构建NF-κB的抑制蛋白IκBα突变体(IκBαM)的真核表达载体,检测其在内皮细胞中的表达。方法:从克隆质粒pSP64TL-IκBαM中用限制性内切酶双酶切IκBαM cDNA片段,克隆到真核表达质粒pcDNA 3.1/myc-His A内构建pcDNA 3.1/myc-His A-IκBαM质粒,并酶切鉴定及测序分析。以脂质体法转染内皮细胞,观察其表达及活性。结果:pcDNA 3.1/myc-His A-IκBαM质粒含有大小正确的IκBαM cDNA碱基片段,其碱基序列为编码目的基因的正确序列。pcDNA 3.1/myc-His A-IκBαM质粒能在内皮细胞中表达,并抑制IL-6分泌。结论:真核表达质粒pcDNA 3.1/myc-His A-IκBαM构建成功,IκBαM蛋白在内皮细胞中表达,并具有良好的生物学活性。     

外源性FHIT基因对人胶质瘤细胞U87增殖与凋亡的影响

目的探讨外源性脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的表达对胶质瘤细胞系U87增殖和凋亡作用的影响。方法通过脂质体介导将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B-FHIT和空载体质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B分别转染胶质瘤细胞系U87。实验细胞分U87-FHIT组(转染FHIT基因的U87细胞)、U87-vector组(转染空载体质粒的U87细胞)和空白对照组(亲本U87细胞)。Western blot和免疫荧光染色检测外源性FHIT蛋白的表达;MTT法及流式细胞术观察转染前后细胞生长特性的变化。结果U87-FHIT组细胞的生长抑制率和凋亡率明显高于U87-vector组和空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论外源性FHIT基因表达能诱导U87细胞凋亡,抑制其生长,具有抗胶质瘤作用。     

hTERT基因反义cDNA转染对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响

目的: 研究反义hTERT基因对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响.方法: 构建反义hTERT基因的真核表达载体,采用LIPOFCTAMINETM Reagent转染卵巢癌细胞系SKOV3,通过RT-PCR、Trap-ELASA、生长曲线、裸鼠体内致瘤能力等方法比较转染前后细胞hTERT基因表达、端粒酶活性、细胞生长、致瘤性等方面的变化.结果:转化细胞系细胞hTERT基因的表达受到抑制,端粒酶活性下调,肿瘤细胞的增殖与生长速度明显降低,细胞的克隆形成能力及裸鼠体内的成瘤能力下降,肿瘤的恶性表型部分逆转.结论:应用反义技术下调hTERT基因表达可有效降低端粒酶活性并部分逆转卵巢癌细胞的恶性表型,hTERT基因可望成为卵巢癌基因治疗的新靶点.     

6A8 α-甘露糖苷酶表达减弱抑制鼻咽癌细胞CNE-2L2 转移的分子机制

目的 探讨6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制对鼻咽癌细胞CNE-2L2间粘附性、细胞表达E-cadherin及对细胞接种裸鼠皮下所生长肿瘤肺转移的影响。方法 软琼脂培养观察非锚定状态下细胞间的粘附;间接免疫荧光染色、免疫组化染色及RT-PCR检测E-cadherin的表达;CNE-2L2细胞接种裸鼠皮下,8周后病理切片检测所长肿瘤肺转移程度。结果 6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制的CNE-2L2细胞(AS)在非锚定状态下发生粘附,此粘附对Ca^2 有依赖性。野生型CNE-2L2细胞弱表达E-cadherin,但AS细胞的E-cadherin表达明显增强。E-cadherin表达增强既见于蛋白质水平,也见于mRNA水平。AS细胞接种裸鼠皮下所长肿瘤的肺转移明显受抑。结论 6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制使CNE-2L2细胞间的粘附性增强,细胞表面E-cadherin表达增强,细胞接种裸鼠皮下所长肿瘤的肺转移明显受抑。     

腺病毒介导siCD44实验性治疗人CNE-2L2鼻咽癌

目的探讨用siCD44治疗实体瘤的可能性。方法以高表达CD44的人鼻咽癌细胞CNE-2L2为研究对象,用软琼脂集落形成实验和细胞接种裸鼠后成瘤性生长及肿瘤肺转移检测细胞恶性生物学行为。构建Ad5-siCD44,用293细胞包装产生病毒。接种CNE-2L2细胞于裸鼠皮下,待肿瘤长到50～100mm3大小,瘤体内注射Ad5-siCD44,以注射PBS或Ad5-egfp为对照,2周后比较肿瘤的大小和重量。结果CD44表达抑制致细胞的恶性生物学行为明显受抑。瘤体内注射PBS、Ad5-egfp和Ad5-siCD442周后,肿瘤的平均体积分别为(3.139±0.850)、(3.612±0.888)和(1.512±0.742)cm3,实验组与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。3组的平均瘤重分别为(2.28±0.73)、(1.83±0.26)和(1.20±0.64)g,实验组与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。结论瘤体内注射Ad5-siCD44对CD44高表达的鼻咽癌细胞CNE-2L2所生成的肿瘤有一定治疗作用。     

6A8 α—甘露糖苷酶表达低下致人鼻咽癌细胞CNE—2L2生长抑制

目的：研究6A8 α-甘露糖苷酶与CNE－2L2肿瘤细胞生长的关系。方法：用腺相关病毒载体将反义6A8 cDNA导入鼻咽癌细胞CNE－2L2。细胞中6A8 α-甘露糖苷酶表达情况用单抗6A8a免疫荧光染色、α－甘露糖苷酶添生及ConA结合试验检测。以野生型细胞、转导了空载体或正义6A8的细胞作对照,以MTT、集落形成及裸鼠实验检测肿瘤细胞生长。结果：转导反义6A8能抑制CNE－2L2细胞6A8 α-甘露糖苷酶表达,6A8 α－甘露糖苷酶表达抑制的CNE－2L2细胞的MTT值、形成集落数及接种裸鼠皮下后所长肿瘤的重量均较对照显著降低可减小（P＜0．001）。结论：6A8 α－甘露糖苷酶表达低下致人鼻咽癌细胞CNE－2L2生长抑制。     

反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响

目的观察反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响.方法克隆人VEGF基因,将VEGF-cDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA3,构建反义VEGF表达载体pcDNA3-VEGF(-);利用阳离子脂质体载体,稳定转染人喉癌Hep-2细胞,并通过流式细胞仪检测,观察转染细胞细胞周期的改变,在透射电镜下观察转染细胞超微结构的改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况.结果成功克隆了人VEGF基因,并构建了携带反义VEGF基因的真核表达载体pcDNA3-VEGF(-);将其稳定转染人喉癌Hep-2细胞,获得了稳定表达反义VEGF的细胞系,与正常Hep-2细胞相比,该细胞系细胞周期及超微结构均无明显改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,与对照组相比,肿瘤的生长速度明显减缓.结论反义VEGF基因转染可以有效地抑制喉癌的生长.     

RASSF1A基因对食管癌细胞EC9706生长抑制作用的研究

目的观察RASSF1A基因对食管癌细胞EC9706生长的抑制。方法将包含RASSF1A基因的质粒转染RASSF1A表达缺失的EC9706细胞,建立稳定转染细胞系,通过MTT法检测细胞活性和增殖能力、流式细胞仪检测其对细胞周期的影响、裸鼠移植瘤实验检测转染细胞的体内成瘤特性。结果稳定表达RASSF1A的EC9706细胞较对照组细胞的RASSF1A蛋白表达增加;细胞生长速度减慢（P〈0．01）;细胞周期中G1期比例增加,S期比例减少（G1期：RASSF1A组细胞：68．53％±3．34％;空质粒组：54．25％±4．61％;未转染组：53．41％±5．60％。S期：RASSF1A组细胞：（23．19±5．04）％;空质粒组：（31．81±2．05）％;未转染组：32．09％±1．99％）（P〈0．01）;同时裸鼠致瘤能力也被抑制（P〈0．05）。结论RASSF1A基因的外源性表达能显著抑制食管癌细胞在体内外的生长,提示该基因在食管癌的发生发展中发挥重要作用。