利用目标基因测序技术发现马方综合征FBN1新突变

目的:建立目标基因捕获结合第二代测序技术,对马方综合征(Marfan syndrome,MFS)患者的原纤维蛋白-1(fibrillin-1,FBN1)基因进行突变筛查,探讨MFS与FBN1基因突变的关系。方法:提取5例MFS患者外周血全基因组DNA,利用GenCap目标基因捕获技术(北京迈基诺公司),设计FBN1的65个外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用illumina hiseq2000第二代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger测序法对突变位点进行验证。结果:设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。5例患者目标区域平均测序深度为173.85~280.73,97.10%~98.00%目标区域4×覆盖度。经过数据分析及Sanger测序验证,发现1个新的无义突变c.5968 CT(p.Gln1990X)。结论:本研究所建立的GenCap目标基因捕获技术结合illumina hiseq2000第二代测序技术成功的发现了FBN1的新突变。该方法快速而有效,可以使我们对MFS分子病因学有更好的认识。     

目标基因捕获测序技术检测肺动脉高压致病基因突变的研究

目的:利用目标基因捕获测序技术,对9例肺动脉高压(PAH)患者进行4个已知致病基因突变筛查,探讨利用目标基因捕获测序技术对PAH进行基因诊断的可行性。方法:抽取PAH患者外周血,提取全基因组DNA,制备文库。设计骨形成蛋白2型受体(BMPR2)、激活素受体样激酶1(ACVR1)、细胞内皮糖蛋白(En G),信号蛋白SMAD4基因(SMAD4)外显子区域特异性捕获探计,利用目标基因捕获技术,进行杂交,富集目标基因组区域的DNA片段,利用Illumina Hi Seq 2000进行高通量测序,分析致病基因突变与PAH的相关性。结果:9例患者中,2例患者发现BMPR2基因突变,1例发现ACVRL1突变,BMPR2突变临床症状较重,ACVRL1突变发病年龄较小。结论:本研究利用目标基因捕获测序技术,在9例PAH患者中查出3个致病基因突变。该方法快速有效,可实现对PAH致病基因突变的初步筛查,对PAH的临床基因诊断具有重要价值。     

利用目标基因捕获结合二代测序技术发现左心室心肌致密化不全MYBPC3基因错义突变

目的:建立目标基因捕获结合第二代测序技术,对孤立性左心室心肌致密化不全(IVNC)患者的已知致病基因MYBPC3进行突变筛查。方法:收集5例IVNC患者及一级亲属的超声影像学资料,并提取外周血全基因组DNA,设计MYBPC3外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,富集目标基因组区域DNA片段,利用二代测序技术,确定突变位点,并使用Sanger测序法在其一代亲属中验证。结果:目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA目标靶片段。在5例IVNC患者中,发现1例MYBPC3基因杂合非同义突变c.G1000A(p.E334K),该突变位于MYBPC3基因第13外显子中,测序深度249.65。经过数据分析与Sanger测序验证后,父亲发现此突变位点,母亲未发现提示突变的父亲的遗传。结论:本研究所建立的Gen Cap目标基因捕获测序技术结合二代测序技术成功发现了MYBPC3基因突变。     

目标基因捕获测序技术鉴定肥厚型心肌病致病突变的研究

目的:利用目标基因靶向捕获高通量测序方法鉴定肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)致病突变,并进行基因型-临床表型的分析,以期对临床诊治提供参考依据。方法:连续收集10例HCM患者血液与临床资料。提取全血基因组DNA、文库制备,靶向富集8个编码肌小节蛋白的HCM的致病基因,并行高通量测序。结果:10例患者[平均年龄为(46±7.9)岁,女性占50%]中,4例患者发现5个基因突变位点。双突变(TNNT2 R286H和MYH7 R663H)携带者具有HCM家族史,发病早,左心室重度肥厚,心电图呈现传导阻滞。MYBPC3 D770N和MYBPC3 S236G突变携带者发病年龄晚,左心室肥厚程度较轻。MYH7 R869C突变携带者年龄大,左心室肥厚程度较重,心电图呈现明显左心室肥大证据。结论:对10例HCM患者利用目标基因捕获测序技术筛选出5个致病突变。携带不同突变的患者其临床表型不一致,这对患者的预后和治疗提供了有利的依据。     

微粒子载体携反义MCP-1基因的转染抑制腹主动脉瘤生长的实验研究

目的　探讨微粒子携反义单核细胞趋化蛋白 1(MCP 1)基因局部定位转染对大鼠腹主动脉瘤生长的影响及机制。　方法　将大鼠制成腹主动脉瘤模型后 ,分成微粒子 DNA组和空载粒子对照组、生理盐水对照组 ,分别进行腹主动脉局部定位转染 ,2周后观察腹主动脉直径的变化 ,应用聚合酶链反应 (PCR)观察微粒子作为基因转染载体的可行性 ,应用原位杂交、Western蛋白质印迹等方法观察反义基因转染后对内源性MCP 1基因表达的抑制作用。　结果　基因转染后 2周 ,微粒子 DNA组腹主动脉直径为 (1 79± 0 12 )mm ,明显小于 2个对照组 (P <0 0 1) ,PCR扩增见该组动脉组织提取的DNA中有特异性条带出现 ,动脉壁中MCP 1基因的mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组 (P <0 0 1)。　结论　微粒子可有效地用作基因转染的载体 ;反义MCP 1基因的转染可通过抑制内源性MCP 1基因的表达和动脉壁巨噬细胞的浸润而达到抑制腹主动脉瘤生长的作用。     

宏基因组学第二代测序技术辅助诊断流行性斑疹伤寒1例

流行性斑疹伤寒是由普氏立克次体引起的急性传染病。该病发作突然, 临床表现不典型, 易漏诊、误诊, 病死率高。本研究报道1例以高热、头痛、乏力起病的患者, 经验性抗感染治疗无效后, 经血清学和宏基因组学第二代测序确诊为普氏立克次体感染, 单用多西环素治疗后病情好转。     

二代测序技术检测结直肠癌驱动基因突变分析

目的:用二代测序技术(NGS)检测结直肠癌患者的基因状态特征。方法:收集2016年8月至2020年12月90例结直肠癌患者血液和组织样本,利用NGS技术1021panel进行检测分析驱动基因突变情况。结果:43例组织标本和83份血液标本,同时有血液和组织标本患者36例。组织标本中 KRAS和 B...     

二代测序技术在胆管恶性狭窄诊疗中的应用

胆管恶性狭窄的诊治是临床重大疑难问题,二代基因测序技术具有所需样本少、检测范围广、准确性高等优点,现本文就该技术在胆管恶性狭窄中的应用作一总结。     

脑脊液宏基因组第二代测序在艾滋病疑似中枢神经系统感染性疾病中的应用

目的 评估宏基因组第二代测序(mNGS)在艾滋病疑似中枢神经系统(CNS)感染中的应用价值,为艾滋病合并CNS感染诊断提供参考.方法 对重庆市公共卫生医疗救治中心2019年7月至2020年7月收治的73例艾滋病疑似CNS感染并行脑脊液mNGS患者的资料进行回顾性分析,收集患者临床表现、影像学资料、脑脊液检查结果,计算感...     

宏基因二代测序技术对感染性疾病患者的诊断价值及其临床应用

目的利用宏基因二代测序(mNGS)技术,检测其和传统培养法的区别,探讨病原微生物及检出序列数与感染患者病情程度和预后的相关性。方法选取2018年5月至2019年9月在上海市第十人民医院就诊的94例患者样本。分别进行传统培养和mNGS检测,对2种技术的诊断效果、假阳性率、假阴性率进行了分析。然后收集感染组75例患者的血液标本和临床信息,根据mNGS是否检出病原体将患者分为检出组(51例)和未检出组(24例)。测定外周血白细胞、C反应蛋白、降钙素原和中性粒细胞计数,用酶联免疫吸附试验法测定血清中细胞因子的浓度。分析患者病原体检出率与病情严重程度、住院时间等相关性分析。结果纳入的94例样本中,感染组75例(7979%),非感染组16例(1702%),未知组3例(319%)。样本类型中血液占比最多(34/94),其次为肺泡灌洗液(28/94)、组织、痰液、胸水、脓液等。下呼吸道感染所占比例最高(60/94),其次是血流感染、胸水、中枢系统感染、心血管系统感染等。mNGS的敏感度显著高于培养法(χ^2=-223.107,P<005)。mNGS的特异度与培养法差异无统计学意义(χ^2=3.840,P=005)。感染未检出组患者住院时间也明显高于检出组(t=4.724,P<005)。单因素分析发现检出组患者外周血白细胞计数、中性粒细胞计数、C反应蛋白、降钙素原显著高于未检出组(t值分别为-8.848、-4.724、-4.335、-4.335,P值均<005);检出组中肿瘤坏死因子α、白细胞介素2R、白细胞介素8水平均高于未检出组(t值分别为-5.585、-7.258、-4.678,P值均<005)。logistic多因素回归分析去除混杂因素后,显示性别、年龄、白细胞介素2R与病原体检出阳性有关。结论mNGS在结核、真菌、病毒和厌氧菌诊断方面优势更明显,其阳性率高于传统方法3倍以上。感染患者的病原体检出率较高,其检出病原体核酸序列是患者预后不良的高危因素,有显著的临床价值。     

两种实验性腹主动脉瘤大鼠模型的比较

为探讨和比较两种腹主动脉瘤大鼠模型特征，以便进一步为腹主动脉瘤体内研究提供基础，选取SD大鼠肾下腹主动脉猪胰腺弹力蛋白酶恒压灌注，或使用豚鼠肾下腹主动脉正位替换。利用特殊染色和免疫组化技术，分别于术后2周和4周，观察腹主动脉形成率、形态学变化及基质金属蛋白酶水平。结果发现，64%酶灌注大鼠和88%异种移植大鼠形成腹主动脉瘤，均无出血或腔内血栓形成。与灌注型腹主动脉瘤相比，移植型腹主动脉瘤壁损伤更为严重，基质金属蛋白酶2及基质金属蛋白酶9表达也显著增高。证明两种方法均能诱导腹主动脉瘤形成，但以移植模型更为稳定可靠。     

单核细胞趋化蛋白1反义寡核苷酸抑制大鼠腹主动脉瘤的形成

为了观察单核细胞趋化蛋白 1对腹主动脉瘤形成的影响 ,建立大鼠腹主动脉瘤模型 ,局部转染单核细胞趋化蛋白 1基因的反义寡核苷酸。结果表明 :动脉灌注 3d ,苏木素—伊红染色即可见明显的炎性细胞浸润 ,逆转录聚合酶链反应提示单核细胞趋化蛋白 1的mRNA表达在灌注 14d达高峰 ,蛋白印迹及免疫组织化学染色提示蛋白产物均在 14d达到高峰 ,并且与动脉瘤的形成呈平行关系。反义寡核苷酸可以抑制单核细胞趋化蛋白 1基因的mRNA及蛋白产物表达 (P <0 .0 1) ,延缓腹主动脉瘤形成 ,抑制率为 92 %～ 12 5 % ,并存在一定的量效关系。本研究提示单核细胞趋化蛋白 1参与腹主动脉瘤的形成 ,反义技术可以减少单核巨噬细胞浸润并抑制腹主动脉瘤的形成和发展。     

腹主动脉瘤发病中平滑肌细胞增殖与凋亡的关系

探讨在腹主动脉瘤形成过程中细胞周期调控下的细胞增殖与死亡的关系。选取豚鼠-大鼠异种移植腹主动脉瘤模型，以平滑肌细胞α-肌动蛋白、增殖细胞核抗体免疫组织化学检测和原位末端DNA标记法分别作为血管平滑肌细胞定性定位、细胞增殖与凋亡分析方法，利用计算机图像分析技术动态观测后1、2、3、4周阳性细胞灰度值和百分比。结果发现，1-2周，移植腹主动脉直径已有中度扩张，细胞增殖指数大于细胞凋亡指数；3-4周，移植物呈显著扩张，细胞凋亡指数大于细胞增殖指数；移植组血管平滑肌细胞凋亡与移植动脉直径呈现显著正相关。证明细胞增殖和凋亡贯穿于腹主动脉损伤重构的全过程，两者平衡失调导致了腹主动脉瘤的形成和发展。     

腹主动脉瘤患者CD4+CD28－T淋巴细胞及Th1细胞因子的变化及临床意义

目的 探讨CD4+ CD28-T细胞及Th1细胞因子在大小腹主动脉瘤患者血清中的数量变化及临床意义.方法 腹主动脉瘤患者60例,其中小腹主动脉瘤30例,大腹主动脉瘤30例,对照组30例,采用流式细胞术测定3组受检者外周血CD4+、CD8+、CD4+ CD28-T亚群数量及占淋巴细胞的比例,运用酶联免疫吸附法实验(ELISA)检测上述各组人群血浆中γ干扰素、肿瘤坏死因子α表达水平.结果 腹主动脉瘤组CD4+ CD28-T细胞表达水平显著升高,其中CD4+ CD28-T细胞在小腹主动脉瘤组升高最为显著(P＜0.05).腹主动脉瘤患者血浆中γ干扰素、肿瘤坏死因子α表达水平也呈明显升高,其表达水平的升高与腹主动脉瘤直径呈正相关性.结论 腹主动脉瘤患者外周血中CD4+ CD28-T淋巴细胞升高,升高的CD4+ CD28-T淋巴细胞可能通过刺激和促进γ干扰素和肿瘤坏死因子α等Th1炎症因子的分泌,在早期腹主动脉瘤发病机制中起着重要的激活作用,并导致腹主动脉瘤局部慢性炎症迁延.