RON基因在淋巴瘤的表达及与EB病毒感染相关性研究

目的 研究RON基因在不同淋巴瘤组织及其细胞株中的表达情况及与EB病毒感染的相关性. 方法 通过免疫组织化学染色法检测淋巴瘤患者以及正常和炎性淋巴组织RON的表达,计算RON阳性组织的比例及RON蛋白表达阳性标记强度特征;蛋白免疫印迹法检测淋巴瘤细胞株RON的表达情况;并且用原位杂交的方法检测EBV编码的小RNA （EBER）在伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤组织的表达情况.结果 RON在霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤组织中阳性率分别为55.0％ （11/20）、66.7％（8/12）,高于其在良性淋巴组织（正常淋巴组织及炎性淋巴组织）中的表达（P均＜0.05）.进一步发现霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤组织芯片及其细胞株L428和Raji细胞株中RON表达水平远高于其他淋巴瘤.霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤中EB病毒的阳性和RON过表达相关性密切.结论 RON在淋巴瘤中表达呈异质性,其中伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤中高表达,而且两者的RON过表达和EB病毒感染密切相关.     

PD-1、FOXP3和CSF-1R蛋白表达对霍奇金淋巴瘤患者预后的影响

目的:研究集落刺激因子1受体(CSF-1R)、叉头转录因子3(FOXP3)和程序性死亡1(PD-1)蛋白表达对霍奇金淋巴瘤患者预后的影响。方法:记录本院收治的54例霍奇金淋巴瘤患者的临床特征资料和治疗方案。采集患者标本,采用免疫组织化学染色法检测微环境相关的预后因子CSF-1R、FOXP3及PD-1蛋白表达,同时通过原位杂交技术检测EB病毒及其小编码的mRNA(EBER);探讨CSF-1R、FOXP3及PD-1 3种蛋白表达与霍奇金淋巴瘤患者预后的关系,并采用单因素分析和多因素分析(Cox比例风险模型)研究影响霍奇金淋巴瘤患者预后的相关因素。结果:54例霍奇金淋巴瘤患者中,CSF-1R~+22例(40. 74%),FOXP3高表达28例(51. 85%),PD-1~+9例(16. 67%)。单因素分析结果发现,国际预后指数(IPI)评分、EBER和FOXP3蛋白表达是霍奇金淋巴瘤患者无进展生存(PFS)的影响因素(均P 0. 05);临床分期(Ann Arbor分期)、IPI评分、EBER、CSF-1R和FOXP3蛋白表达是患者总生存(OS)的影响因素(均P 0. 05)。多因素分析(Cox比例风险模型)结果发现,EBER状态是霍奇金淋巴瘤患者PFS、OS的影响因素(P 0. 05); FOXP3蛋白表达是患者PFS的影响因素(P 0. 05); Ann Arbor分期、CSF-1R蛋白表达均是患者OS的影响因素(均P 0. 05)。结论:CSF-1R、FOXP3与霍奇金淋巴瘤患者的预后有密切联系,可为该病的靶向治疗提供一定的依据。     

不同类型淋巴瘤组织中EB病毒的表达及意义

目的 检测100例淋巴瘤患者中潜伏膜蛋白1(LMP1)及EBV编码的小RNA(EBER)的表达情况;观察LMP1与EBER的相关性及二者与淋巴瘤类型的相关性,为淋巴瘤的诊断提供依据。方法 采用免疫组化SP法和原位杂交法分别检测100例淋巴瘤患者中LMP1和EBER的表达情况,比较两种方法的敏感性。结果 （1）仅经典型霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤表达LMP1和EBER及NK/T细胞淋巴瘤表达EBER,其余类型淋巴瘤中非肿瘤细胞可散在表达EBER。并且经典型霍奇金淋巴瘤LMP1表达率明显高于弥漫性大B细胞淋巴瘤（P<0.05）;从EBER阳性表达率看,NK/T细胞淋巴瘤最高,霍奇金淋巴瘤次高,二者均明显高于弥漫性大B细胞淋巴瘤（均P<0.05）。在所有患者中EBER的表达率明显高于LMP1(P<0.05)。（2）从LMP1及EBER表达模式看,LMP1阳性的肿瘤细胞通常散在分布,而EBER阳性的肿瘤细胞通常呈簇状或片状分布、甚至弥漫分布。并且不同类型淋巴瘤EBER的表达模式也不同。结论 EBV的表达与NK/T细胞淋巴瘤、经典型霍奇金淋巴瘤密切相关,并且可以作为辅助诊...     

儿童EB病毒相关平滑肌肿瘤1例报道

<正>EB病毒感染相关肿瘤较多,根据EB病毒感染的潜伏模式分为3型:1型感染表达EB病毒编码的RNA(EBER)和EB病毒核抗原1(EBNA1),如伯基特淋巴瘤;2型感染除了表达EBER和EBNA1外,还表达潜伏膜蛋白(LMPs),如鼻咽癌和霍奇金淋巴瘤;3型感染表达LMPs和所有的EBNAs,如移植后淋巴组织增生性疾病。EB病毒相关平滑肌肿瘤(Epstein-Barr virus-associated smooth muscle tumor,EBV-SMT)为3型潜伏感染,平滑肌肿瘤伴有EB病     

A20的免疫调节作用及其临床意义

A20最初是作为肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导蛋白3(TNFA IP3)而鉴定的,它是炎症信号传导的中心调节因子———NF-κB抑制因子,在天然免疫和过继性免疫调节中发挥了重要作用。近期研究提示,A20是一个肿瘤抑制因子。A20缺失与炎症介导的自身免疫性疾病和淋巴细胞肿瘤的发生发展关系密切。近期有关A20在免疫细胞中的表达特点和生物学功能,在天然免疫、体液和细胞免疫中的调节作用,在淋巴细胞肿瘤中缺失情况以及在自身免疫性疾病中的异常表达等等的研究进展提示:有必要深入认识A20的临床意义和探讨其在诱导免疫耐受、肿瘤免疫调节治疗和抗病毒治疗等方面的应用价值。     

Survivin在中线T细胞淋巴瘤中的表达及其与EB病毒感染的关系

为了探讨凋亡抑制基因存活蛋白（survivin）在中线T细胞淋巴瘤（midline T-cell lymphoma,MTL）中的表达及其与EB病毒（Epstin-Barr virus,EBV）感染的关系,应用免疫组织化学方法检测石蜡切片中存活蛋白和EBV潜伏膜蛋白（latent membrane protein,LMP-1）的表达,采用原位分子杂交技术检测EBV编码的RNA（EBV-encoded RNA,EBER1/2）.结果表明：41例MTL中26例存活蛋白阳性表达（63.42%）,而在10例反应性增生淋巴组织中均未检测出存活蛋白表达;存活蛋白在低度恶性MTL中的阳性表达率为12.50%,在中-高度恶性MTL中的阳性表达率为75.76%,两组之间的差异具有显著性的意义（x^2=8.55,P＜0.01）;EBER 1/2阳性率为70.73%,LMP-1阳性率为41.46%,EBV阳性组与EBV阴性组之间存活蛋白的表达差异无显著性意义（P＞0.05）.结论：MTL组织中存活蛋白表达上调,存活蛋白表达阳性率与MTL的恶性程度有关,存活蛋白基因可能通过肿瘤细胞凋亡的抑制参与MTL的发生发展,但未发现存活蛋白表达与EBV感染之间有明显相关性.     

人脐静脉内皮细胞损伤过程中核转录因子κB及单核细胞趋化蛋白1mRNA的变化

背景:既往实验表明,炎性因子与内皮细胞的功能有密切的关系,观察保护和损伤因素对体外培养人血管内皮细胞炎性因子作用的报道较少.目的:实验拟观察姜黄素和肿瘤坏死因子α对人脐静脉内皮细胞分泌核因子κB以及单核细胞趋化蛋白1mRNA的影响.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2006-12/2007-08在解放军第四军医大学组织工程实验室完成.材料:健康人脐带由解放车第四军医大学唐都医院提供.内皮细胞培养采用M199完全培养基.方法:实验分为3组,正常对照组为无血清M199培养基;肿瘤坏死因子α组:在正常细胞培养液中加入浓度为10μg/L的肿瘤坏死因子α诱导损伤1.5h;姜黄素组:先在培养液中加入10μg/L的肿瘤坏死因子α30min诱导损伤,再分别加入终浓度为6.25,12.5,25,50,100mg/L的姜黄素孵育1h.主要观察指标:①四甲基偶氮唑盐法检测不同浓度姜黄素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响.②免疫细胞化学染色法观察胞核内核转录因子κB的表达.③反转录-聚合酶链反应检测单核细胞趋化蛋白1mRNA的表达.结果:姜黄素可以提高肿瘤坏死因子α诱导损伤的人脐静脉内皮细胞活性(P＜0.01),并呈一定剂量依赖性.肿瘤坏死因子α可刺激核因子κBp65表达的强度,姜黄素可以减少核因子κBp65的表达.与正常对照组相比,肿瘤坏死因子α作用30min后,单核细胞趋化蛋白1mRNA相对表达量明显增高(p＜0.01);加入不同浓度的姜黄素作用1h后,单核细胞化蛋白1mRNA相对表达量明显减低(P＜0.05, P＜0.01).结论:姜黄素对损伤的内皮细胞具有保护作用,其作用途径可能通过抑制核转录因子κB活性,并下调单核细胞趋化蛋白1mRNA的表达,从而阻滞了单核细胞的聚集.     

霍奇金病H／R—S细胞起源和克隆性的研究进展（二）

3霍奇金病和EB病毒的关系现在国内外的许多研究已经证实约40％～50％的霍奇金病与EB病毒有关，在发展中国家更高。在这些病例中通过EBER原位杂交，发现EBV存在于H／R－S细胞中，至少有50倍以上的扩增。用Sorthern杂交还发现，EBV在肿瘤细胞的克隆性增生前就存在。免疫组化染色揭示EBV在H／R－S细胞中以Ⅱ型潜伏感染的方式存在，表达LMP－1－3蛋白和EBNA－1。LMP－1以转染方式象癌基因一样作用，有潜在抗调落和促进霍奇金病形成的功能。但这一学说难以解释另外约50％的无EBV的病例。4霍奇金淋巴瘤的病理发生学（图1）这一学说…     

免疫组化染色及荧光原位杂交法检测肺鳞状细胞癌中间变性淋巴瘤激酶基因蛋白表达情况的临床研究

目的应用免疫组化染色法、荧光原位杂交法检测肺鳞状细胞癌中间变性淋巴瘤激酶基因蛋白(ALK)的表达情况。方法选择2018年5月至2019年5月驻马店市中心医院收治的85例肺鳞状细胞癌患者作为研究对象,85例肺鳞状细胞癌患者均接受手术治疗,获取其术中切除肿瘤标本行免疫组化染色法检测ALK蛋白,经荧光原位杂交法检测EML4-ALK基因融合。结果85例肺鳞状细胞癌患者经免疫组化染色法对ALK蛋白检出阳性率为9例(10.59%),荧光原位杂交法对EML4-ALK基因融合检出率仅为2例(2.35%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论肺鳞状细胞癌患者ALK表达阳性较为少见,荧光原位杂交法检测肺鳞状细胞癌EML4-ALK基因融合阳性率更低。     

亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌外膜蛋白与外排泵基因adeB分析

目的了解耐亚胺培南鲍曼不动杆菌中外膜蛋白表达以及外排泵基因adeB的分布情况。方法收集该院2008年9月至2010年12月亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌65株,采用PCR方法扩增外膜蛋白CarO编码基因及外排泵adeB基因;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析耐药菌与敏感菌外膜蛋白表达的差异。结果 65株菌均检出CarO编码基因与adeB基因,其中2株菌CarO编码基因上游存在ISAba1插入序列。SDS-PAGE显示,耐药菌株与敏感菌株在外膜蛋白上存在主要有大约24×103蛋白的缺失和48×103蛋白的高表达。结论外膜蛋白CarO和adeB基因在亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌中广泛存在,adeB基因的高表达以及外膜蛋白表达的差异是鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药的重要机制。     

EB病毒LMP2A和EB病毒BZLF1融合基因反转录病毒表达载体的构建

目的:将LMP2A和BZLF1基因进行融合同时可发挥LMP2A诱导特异性CTL和BZLF1基因诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用,协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞。实验拟构建含EB病毒潜伏膜蛋白2A编码基因和即刻早期基因融合基因的反转录病毒表达载体,并筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法:实验于2006-08/2007-08在济宁医学院微生物教研室和青岛大学医学院微生物教研室进行。应用反转录-聚合酶链反应分别获得潜伏膜蛋白2A和即刻早期基因编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸技术将两段基因通过多肽接头(Gly_4Ser)_3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro,形成重组质粒pMSCVpuro-Z2A,脂质体法将pMSCVpuro-Z2A转染反转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒进行滴度测定,RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果:限制性酶切、PCR及测序鉴定证实Z2A正确插入逆转录病毒表达载体,筛选获得了稳定产毒的嘌呤霉素抗性细胞克隆,收获病毒的滴度为7.8×10~6 CFU/L,且重组逆转录病毒在PT67细胞能有效转录。结论:携带Z2A基因的重组反转录病毒表达载体pMSCVpuro-Z2A构建成功,转染PT67细胞后包装出重组反转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Z2A的产毒细胞系PT67-Z2A。     

核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β诱导的软骨细胞中基质金属蛋白酶9的表达

背景：小干涉核糖核酸是核糖核酸干涉的起始诱导物，在细胞内引起强烈的核糖核酸干涉，降解目的基因的信使核糖核酸，以控制目的基因表达。目的：利用核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制软骨细胞中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的活性及其基质金属蛋白酶9的表达，观察在软骨细胞中核因子κBp65与细胞因子的关系。设计、时间和地点：单一样本观察．细胞学体外实验，于2006—09／2007—09在北京大学医学部中心实验室完成。材料：SD大鼠关节软骨细胞。方法：利用质脂体将筛选优化好的核因子κBp65特异性小于涉核糖核酸转染软骨细胞，特异性抑制核因子κBp65的表达，继而抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的活性及基质金属蛋白酶9的表达。主要观察指标：利用电泳迁移率试验检测核因子κB的活性，反转录聚合酶链反应和蛋白质免疫印记法分析从信使核糖核酸和蛋白质两水平检测基质金属蛋白酶9的表达。结果：核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制核因子κBp65的表达，降低肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的转录活性，抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的基质金属蛋白酶9的表达。 结论：在软骨细胞中核因子κBp65与肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β关系密切。     

核因子κ Bp65特异性小干涉核糖核酸抑制肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β诱导的软骨细胞中基质金属蛋白酶9的表达

背景：小干涉核糖核酸是核糖核酸干涉的起始诱导物，在细胞内引起强烈的核糖核酸干涉，降解目的基因的信使核糖核酸，以控制目的基因表达。目的：利用核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制软骨细胞中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的活性及其基质金属蛋白酶9的表达，观察在软骨细胞中核因子κBp65与细胞因子的关系。设计、时间和地点：单一样本观察．细胞学体外实验，于2006—09／2007—09在北京大学医学部中心实验室完成。材料：SD大鼠关节软骨细胞。方法：利用质脂体将筛选优化好的核因子κBp65特异性小于涉核糖核酸转染软骨细胞，特异性抑制核因子κBp65的表达，继而抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的活性及基质金属蛋白酶9的表达。主要观察指标：利用电泳迁移率试验检测核因子κB的活性，反转录聚合酶链反应和蛋白质免疫印记法分析从信使核糖核酸和蛋白质两水平检测基质金属蛋白酶9的表达。结果：核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制核因子κBp65的表达，降低肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的转录活性，抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的基质金属蛋白酶9的表达。 结论：在软骨细胞中核因子κBp65与肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β关系密切。     

重组人白细胞介素6和肿瘤坏死因子融合蛋白的构建和表达

本文利用ＰＣＲ技术和基因定位突变技术，将编码人白细胞介素６（ｈＩＬ－６）和肿瘤坏死因子αｈＴＮＦα）成熟肽的基因通过中间接头连接成编码单一蛋白的基因，构建了融合蛋白表达载体ＰＢＩＴ，并在大肠杆菌中得到了表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的电泳胶薄层扫描显示，融合蛋白的表达量是菌体总蛋白量的２０％，其分子量约为３７ｋＤ。活性检测证实，融合蛋白既有ＩＬ－６活性，又有ＴＮＦ活性。     

肠道淋巴瘤临床病理、免疫表型及与EB病毒相关性的研究

目的研究肠道非霍奇金淋巴瘤的临床病理、免疫表型及与EBV感染的相关性。方法应用多种抗体标记B淋巴细胞(CD20，CD79a，CD45RA，k，λ，CD5，CD10，bcl-2，cyclin D1)和T淋巴细胞(CD3g，CD8，CD45RO，CD56，GramB，TIA)，同时进行细胞增殖活性的检测(Ki-67)、免疫组织化学染色(SABC法)、EBV寡核苷酸探针(EBER)原位杂交。结果60例中，免疫组化证实B细胞性淋巴瘤48例(80％)，T细胞性淋巴瘤12例(20％)。EBV—EBER原位杂交40例中6例阳性表达，均为T细胞性淋巴瘤，阳性细胞占肿瘤细胞的30％～80％，34例B细胞性淋巴瘤：EB病毒检测阴性。结论肠道淋巴瘤以B细胞淋巴瘤多发，并以惰性的黏膜相关性边缘区B细胞性淋巴瘤多发，与EBV无相关性。肠道T细胞性淋巴瘤侵袭性较强，且与EBV相关性较高。     

高尿酸血症患者G-308A肿瘤坏死因子α基因型及mRNA表达与血尿酸的关系

背景:高尿酸血症作为代谢综合征的组成成分,其介导炎症的作用日益引起关注。目前,肿瘤坏死因子α启动子区-308A取代G(G-308A肿瘤坏死因子α)与代谢综合症的关系还存在争议。目的:探讨高尿酸血征患者G-308A肿瘤坏死因子α基因型分布与肿瘤坏死因子αmRNA表达及C-反应蛋白浓度的关系。设计:以高尿酸血症患者为研究对象、正常人为对照组,进行对比观察。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院。对象:在5003名健康查体中筛选188例高尿酸血症患者、51名健康者。高尿酸血症患者中单纯高尿酸血症40例,高尿酸血症并脂代谢紊乱42例,高尿酸血症并脂代谢紊乱和高血压80例,痛风26例(在实验开始前的1周,停用别嘌呤醇)方法:采用聚合酶链反应扩增后Ncol消化法,电泳后检查G-308A肿瘤坏死因子α基因型分布。采用反转录聚合酶链反应半定量法,观察肿瘤坏死因子αmRNA表达情况。采用高灵敏酶联免疫吸附双抗体夹心法测定血清C-反应蛋白浓度。采用尿酸氧化酶法测定血尿酸。胰岛素抵抗指数采用稳态模型评估法。主要观察指标:①基因型频率Hardy-Weinberg平衡检验结果。②在高尿酸血症中G-308A肿瘤坏死因子α基因型分布和肿瘤坏死因子αmRNA表达的变化。③G-308A肿瘤坏死因子α基因型AA GA组和GG组肿瘤坏死因子αmRNA表达量及其他指标的变化。④多元逐步回归分析。结果:患者188例、正常人51例全部进入结果分析。①239例被研究者G-308A肿瘤坏死因子α基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。②由于人群AA型基因分布频率少,因此采用AA GA与GG型比较。结果显示在高尿酸血症伴脂代谢紊乱和高血压患者中AA GA分布(30%)高于对照组(12%)(P<0.05);其余各组之间无明显差异。③肿瘤坏死因子αmRNA表达量和血清C-反应蛋白浓度痛风组>高尿酸血症伴脂代谢紊乱和高血压组>高尿酸血症伴脂代谢紊乱组>单纯高尿酸血症组,均明显高于对照组(P<0.05～0.01);其中高尿酸血症伴脂代谢紊乱和高血压组以及痛风组肿瘤坏死因子αmRNA表达量高于单纯高尿酸血症组(P<0.05～0.01)。AA GA组腰围与臀围比值、收缩压、舒张压、血尿酸、三酰甘油、肿瘤坏死因子αmRNA表达量和血清C-反应蛋白浓度明显高于GG型组(P=0.05～0.01)。④调整性别、年龄、收缩压、舒张压、空腹血糖、体质量指数、总胆固醇、高密度胆固醇后。多元逐步回归分析显示三酰甘油、血尿酸和肿瘤坏死因子α308A携带者与肿瘤坏死因子αmRNA表达量有关;并显示腰臀比、血尿酸和肿瘤坏死因子αmRNA表达量与C-反应蛋白浓度变化相关。结论:高尿酸血症个体中肿瘤坏死因子α308A携带者的基因型与肿瘤坏死因子α表达和血浆C-反应蛋白水平有关。     

核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制肿瘤坏死因子α诱导大鼠关节滑膜细胞中一氧化氮合酶2和环氧合酶2的表达

目的:利用核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制肿瘤坏死因子α诱导的关节滑膜细胞中一氧化氮合酶2和环氧合酶2的表达,探讨基因治疗类风湿性关节炎的新方法。方法:实验于2005-03/2006-03在北京大学医学部中心实验室(国家级)完成。①实验材料:清洁级健康近交系SD大鼠10只;一氧化氮合酶2,环氧合酶2,3-磷酸甘油醛脱氢酶引物(由北京奥科生物公司合成);肿瘤坏死因子α(Sigma公司);核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸和转染条件由北京大学运动医学研究所陈连旭博士提供。②实验干预:切取大鼠髋关节和膝关节的滑膜体外培养滑膜细胞。利用脂质体siPORTTMLipid将核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸转染滑膜细胞,再加入肿瘤坏死因子α刺激。阴性对照为任意编码的小干涉核糖核酸,阳性对照为针对3-磷酸甘油醛脱氢酶的小干涉核糖核酸。③实验评估:提取滑膜细胞中的核蛋白,利用电泳迁移率试验检测核因子κB的活性;提取滑膜细胞的核糖核酸和总蛋白,利用反转录聚合酶链反应和蛋白质免疫印记法从信使核糖核酸和蛋白质两水平检测一氧化氮合酶2和环氧合酶2的表达。结果:①肿瘤坏死因子α和核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸对核因子κB转录活性的影响:与正常滑膜细胞相比,肿瘤坏死因子α可以显著提高核因子κB的结合能力,而事先转染小干涉核糖核酸48h,再用肿瘤坏死因子α刺激,核因子κB的结合能力又显著降低。②核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸对核因子κB下游因子的影响:在培养的滑膜细胞中,肿瘤坏死因子α可以显著增加一氧化氮合酶2和环氧合酶2的表达;在转染小干涉核糖核酸抑制核因子κBp65的表达后再用肿瘤坏死因子α刺激,一氧化氮合酶2和环氧合酶2的表达被抑制。结论:①核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸可降低肿瘤坏死因子α诱导的滑膜细胞中核因子κB的转录活性,抑制其下游因子一氧化氮合酶2和环氧合酶2的表达。②核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸可用于基因治疗类风湿性关节炎的试验研究。     

核因子-κB、肿瘤坏死因子-α在糖尿病大鼠膀胱的表达及相互关系的研究

[目的]观察糖尿病大鼠膀胱组织的病理改变,检测核因子-kBp65、肿瘤坏死因子-α表达的变化,并探讨两者关系.[方法]采用右下腹腔内一次性注射链脲佐菌素60 mg/kg诱导Wistar大鼠糖尿病模型26只,分别于成模后1、3、6个月观察膀胱组织的病理改变,检测核因子-κBp65、肿瘤坏死因子-α表达变化.[结果]随糖尿病病程延长,膀胱组织发生病理改变,核因子-κBp65、肿瘤坏死因子-α表达显著增强,两者呈正相关.[结论]核因子-KBp65、肿瘤坏死因子-α与糖尿病膀胱的病理、功能改变相关.     

构建含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体

背景：腺病毒的表达时间有限,会限制目的基因的表达时间和表达量,不利于实验的持续进行,故文章选择慢病毒作为载体,与目的基因大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因片段进行基因重组。 目的：探讨构建含有大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体的方法。 方法：根据GenBank中大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体序列（NM 145681.1）,设计出该基因的特异性引物Trail-AgeⅠ-F和Trail-AgeⅠ-R,用PCR法从大鼠cDNA文库中扩增出目的基因,AgeⅠ酶切将该基因克隆入真核表达载体GV218中,产生目的重组质粒,用脂质体 Lipofeetamine 2000包裹构建的重组质粒和辅助包装载体,3个质粒共同转染293T细胞,产生含有表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的慢病毒颗粒,收集病毒进行滴度鉴定,收集细胞提取蛋白进行基因表达情况的检测。 结果与结论：筛选出的克隆阳性菌测序获得肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因,全长861 bp,与GenBank中发表的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体核苷酸序列完全一致。包装后的病毒LV-mTrail在转染2 d后收集病毒液,经PCR和Western blot方法鉴定,从基因和蛋白的层面均证实携带有目的基因肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因。孔稀释法及实时荧光定量PCR病毒滴度测定法测定结果为2×109 TU/mL。提示大肠杆菌同源重组法能有效和方便地构建出含有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒载体。     

Toll样受体3介导呼吸道合胞病毒感染人肺上皮细胞的炎性反应及其信号转导通路

目的:观察呼吸道合胞病毒感染肺上皮细胞A549后Toll样受体3表达的变化,探讨Toll样受体3介导呼吸道合胞病毒感染肺上皮细胞的炎性反应及其介导的信号转导通路。方法:实验于2006-05/12在安徽医科大学基础医学院分子生物学实验室完成。用呼吸道合胞病毒感染体外培养的A549细胞,于感染后4,8,16,24h收集细胞和细胞培养上清。用Trizol提取细胞总RNA,RT-PCR法检测TOLL样受体3mRNA、肿瘤坏死因子αmRNA表达的变化;提取细胞总蛋白和核蛋白,免疫印迹法分别检测TOLL样受体3蛋白、核内活性核因子κB的变化;用ELISA检测细胞培养上清肿瘤坏死因子α的表达。以未感染病毒的细胞为正常对照组。结果:①呼吸道合胞病毒感染A549细胞后,Toll样受体3和肿瘤坏死因子α的mRNA和蛋白的表达量均升高且有时间依赖性,Toll样受体3mRNA24h表达量是基础表达量的5倍多,肿瘤坏死因子αmRNA24h表达量是基础表达量的3倍多。②A549细胞中核内活性核因子κB有基础表达,经由呼吸道合胞病毒感染,核内活性核因子κB随感染时间的延长升高;同时呼吸道合胞病毒感染能促进Toll样受体3蛋白的表达,高于正常对照组(P<0.01)。③呼吸道合胞病毒感染能促进A549细胞分泌肿瘤坏死因子α,感染24h分泌达到高峰。结论:呼吸道合胞病毒感染A549细胞后上调Toll样受体3表达,其诱导的炎性反应与Toll样受体3介导的信号转导途径有关。