β-catenin特异性抑制剂XAV939对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖抑制的实验研究

目的:通过短发夹RNA(shRNA)干扰β-catenin基因的表达及使用β-catenin特异性抑制剂XAV939作用于套细胞淋巴瘤(MCL)Jeko-1细胞株,了解特异性抑制β-catenin活性对Jeko-1细胞增殖及细胞凋亡的影响。方法:将构建β-catenin shRNA真核表达载体转染Jeko-1细胞,应用RT-PCR和Western blot的方法鉴定干扰效果,用不同浓度XAV939处理MCL细胞株Jeko-1;应用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术分析细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、Cyclin D1、C-MYC、caspase-3表达水平的变化。结果:shRNA转染48 h后,RTPCR、Western blot检测发现,Jeko-1细胞的β-catenin的mRNA、蛋白表达下降;无论使用shRNA或抑制剂处理,均可抑制Jeko-1细胞增殖,促进其凋亡;Western blot检测显示,凋亡相关蛋白BCL-2、Cyclin D1、C-MYC的表达下降,而BAX、caspase-3表达上升。结论:特异性抑制β-catenin活性能有效地抑制Jeko-1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。     

地西他滨联合硼替佐米对套细胞淋巴瘤细胞株的增殖抑制作用及其相关机制

目的:观察地西他滨(DAC)联合硼替佐米(BTZ)对套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系Jeko-1和Grante519细胞增殖的影响,并探讨其相关作用机制。方法:用不同浓度的DAC、BTZ单药和2药联合在体外对人MCL细胞株Jeko-1、Grante519细胞进行处理,采用CCK8法检测不同处理因素对细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测上述药物对细胞凋亡的影响,RT-PCR和Western blot方法从m RNA和蛋白水平检测上述药物对MCL细胞凋亡和信号传导相关基因PCDH8、NF-κB、Caspas3、BCL-2、CCND1和BAX表达水平的影响。结果:低浓度DAC能明显抑制Jeko-1、Grante519细胞的增殖并诱导其凋亡,效应呈剂量和时间依赖性(r=0.892,r=0.812;r=0.886,r=0.784)。单药DAC处理后,在Jeko-1和Grante519细胞中均可观察到Caspase3、BAX和PCDH8表达水平的升高(均P0.01),BCL-2、CCND1表达水平的降低(均P0.05),但对NF-κB表达水平无显著影响;高浓度BTZ能明显抑制Jeko-1和Grante519细胞的增殖,并诱导其凋亡,效应呈剂量和时间依赖性(r=0.854,r=0.763;r=0.927,r=0.742);单药BTZ能引起Jeko-1和Grante519细胞中Caspase3、BAX表达水平升高(P0.01),NF-κB、BCL-2和CCDN1表达水平的降低(P0.01),但对PCDH8表达水平无明显影响;与单药处理组相比,DAC联合BTZ显著增加了对Jeko-1和Grante519细胞的抑制率和凋亡率(P0.01),并显著提高Jeko-1和Grante519细胞PCDH8、Caspase3、BAX表达水平(P0.01),明显降低NF-κB、BCL-2和CCND1表达水平(P0.01)。结论:DAC与BTZ具有正协同作用,其对MCL细胞的增殖抑制作用可能是2药联合后加强了对NF-κB信号通路的抑制作用,并且下调BCL-2水平,上调BAX水平,从而引起下游的Caspase3蛋白表达水平进一步升高,以达到更高的抗肿瘤作用。     

苯丁酸氮芥抗套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1作用机制的研究

目的:探讨苯丁酸氮芥抗套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1作用机制。方法:应用MTT法检测苯丁酸氮芥对Jeko-1细胞增殖的影响,Hoechst染色及Annexin V-FITC双染检测苯丁酸氮芥对Jeko-1细胞凋亡的影响,Western blot检测苯丁酸氮芥对Jeko-1细胞凋亡相关蛋白BAX,BCL-2,procaspase 3,procaspase 8,procaspase 9表达水平及PI3K/AKT信号通路的激活情况。结果:苯丁酸氮芥0、5、10和20μmol/L作用Jeko-1细胞24、48、72 h后,细胞增殖受到抑制,并呈时间及剂量依赖性(r=0.873,r=0.932)。0,5,10,20μmol/L苯丁酸氮芥作用Jeko-1细胞72 h后,细胞凋亡率显著提高,BAX,procaspase 3,procaspase 8及procaspase 9蛋白表达水平显著上调,BCL-2表达水平显著下调,PI3K蛋白及AKT磷酸化水平显著降低。结论:苯丁酸氮芥能显著诱导套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1凋亡,其作用机制与调节PI3K/AKT信号通路有关。     

miR-215、KDM1B在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中的表达及临床意义

目的:检测miR-215、KDM1B在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者中的表达,初步探究其临床意义。方法:选择本院50例DLBCL患者作为DLBCL组以及30例反应性淋巴结炎患者作为对照组,应用RQ-PCR检测患者病理组织中miR-215的表达水平,免疫组织化学检测KDM1B蛋白表达,比较不同临床特征的患者病理组织中miR-215、KDM1B的表达水平,比较不同表达水平miR-215、KDM1B的患者的生存情况。miR-215 mimics转染DLBCL的SU-DHL-4细胞株,采用CCK-8法检测细胞增殖率,AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡,Western blot检测KDM1B蛋白的表达变化。结果:DLBCL组中的miR-215表达低于对照组,而KDM1B蛋白阳性高表达率高于对照组,差异均有统计学意义(P 0.01)。Spearman等级相关分析显示,miR-215表达与KDM1B蛋白表达存在负相关(r=-0.751,P 0.05)。miR-215和KDM1B表达与DLBCL患者B组症状、血清LDH水平、IPI评分、Ann-Arbor临床分期、肿瘤大小存在相关性(P 0.05)。Kaplan-Meier检测结果显示,miR-215高表达组患者5年生存率显著高于低表达患者(P=0.013),而KDM1B阳性高表达组患者5年生存率显著低于阳性低表达患者(P=0.024)。miR-215 mimics转染72 h后,miR-215 mimics组细胞增殖率明显低于对照组和NC mimics组(P 0.05),细胞凋亡率均明显高于对照组和NC mimics组(P 0.05),KDM1B蛋白表达水平明显低于对照组和NC mimics组(P 0.05)。结论:DLBCL患者病理组织中miR-215低表达、KDM1B蛋白高表达,这可能成为DLBCL诊断和预后指标。miR-215可靶向抑制KDM1B的表达,抑制DLBCL细胞增殖,促进细胞的凋亡。     

单胺氧化酶抑制剂苯乙肼对套细胞淋巴瘤细胞生长增殖的影响及相关机制研究

目的:研究单胺氧化酶抑制剂苯乙肼在体外对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞的增殖抑制作用及其可能的作用机制。方法:应用MTT方法绘制细胞生长曲线,应用流式细胞术观察细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax及P21蛋白表达水平的变化,组蛋白H3K4单甲基化、双甲基化、三甲基化及组蛋白H3乙酰化状态的变化,以及Wnt信号转导通路相关蛋白表达水平的变化。结果:单胺氧化酶抑制剂苯乙肼可上调Bax、caspase-3、P21蛋白表达,下调Bcl-2,抑制Jeko-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,并呈浓度依赖性(r=0.981);苯乙肼上调Jeko-1细胞组蛋白H3K4me1和H3K4me2水平及H3乙酰化水平,而组蛋白H3K4me3水平无明显改变;苯乙肼处理24 h后Jeko-1细胞的WNT通路蛋白p-GSK-3β、β-catenin、c-myc、cyclin D1表达均下降(P0.05)。结论:单胺氧化酶抑制苯乙肼能调控组蛋白甲基化、乙酰化,抑制Wnt/β-catenin信号转导通路,从而诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖,有望成为套细胞淋巴瘤的靶向治疗药物。     

PLK1在套细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

目的:研究PLK1在套细胞淋巴瘤中的表达,探讨shRNA干扰沉默PLK1基因表达对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖、凋亡、周期的影响。方法:应用免疫组织化学S-P法检测42例套细胞淋巴瘤和30例反应性增生淋巴结炎患者组织中PLK1蛋白并进行分析与比较。PLK1 shRNA慢病毒感染Jeko-1细胞,应用RQ-PCR检测PLK1 mRNA的表达及Western blot检测PLK1蛋白的表达,鉴定PLK1 shRNA干扰沉默效果,CCK-8试验检测细胞增殖,AnnexinⅤ/PI双染检测细胞凋亡, PI单染检测细胞周期,Western blot测定凋亡相关蛋白BAX BCL-2、Caspase-3的变化。结果:套细胞淋巴瘤患者组织中PLK1阳性率66.67%(28/42),明显高于增生淋巴结炎患者组织的20%(6/30)(P 0.05)。PLK1阳性表达与套细胞淋巴瘤患者B症状、IPI评分、Ann-Arbor临床分期存在相关性(P 0.05)。PLK1 shRNA慢病毒感染Jeko-1细胞72 h后,PLK1 mRNA和PLK1蛋白表达明显下降(P0.05),PLK1 shRNA组细胞增殖率明显低于对照和Neg shRNA组(P 0.05),PLK1 shRNA组细胞的凋亡率为(27.42±3.44)%,明显高于对照组的(1.23±0.42)%和Neg shRNA组的(2.07±0.58)%(P 0.05)。细胞周期分析发现,PLK1 shRNA组的G2/M期细胞比例为(27.21±3.59)%,高于对照组的(13.28±2.63)%及Neg shRNA组的(14.34±2.37)%(P 0.05)。凋亡相关蛋白检测显示,促凋亡蛋白BAX上调,抑制凋亡蛋白BCL-2表达下调、caspase-3表达上调。结论:PLKl在套细胞淋巴瘤患者组织中过量表达,干扰沉默PLK1基因可抑制人套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞细胞增殖,诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期于G2/M期。     

miR-543调控肾透明细胞癌细胞增殖和侵袭的机制分析

目的探讨与分析miR-543调控肾透明细胞癌(CCRCC)细胞增殖和侵袭的机制。方法 CCRCC细胞系ACHN随机分为三组:空白组、阴性对照(NC)组与miR-543组,NC组与miR-543组分别转染照NC与miR-543模拟剂,空白组不进行转染。MTT检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Transwell检测细胞转移与侵袭比率,Western blot检测蛋白表达水平。结果转染后24 h与48 h,与NC组与空白组相比,miR-543组的细胞增殖抑制率显著增加(P0. 05),细胞凋亡率显著增加(P 0. 05),细胞转移与侵袭相对数显著降低(P 0. 05),SDF-1、CXCR7蛋白相对表达量显著降低(P 0. 05),NC组与空白组比较差异无统计学意义(P 0. 05)。且miR-543对细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、细胞转移与侵袭、SDF-1和CXCR7蛋白相对表达量的影响均不具有时间依赖性。结论 miR-543能抑制调控肾透明细胞癌细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡,且不具有时间依赖性,其作用机制可能与抑制SDF-1/CXCR7表达有关。     

MiR-101在乳腺癌中的表达及其意义

目的:探讨miR-101在乳腺癌组织中的表达变化。方法:收集乳腺癌组织及对应的癌旁组织,以qRT-PCR方法测定miR-101在乳腺癌组织中的表达变化。在乳腺癌细胞中转染miR-101 mimics、mimics control,以qRT-PCR方法检测上调效果,MTT方法测定细胞增殖变化,流式细胞术测定细胞凋亡变化,Transwell小室测定细胞迁移和侵袭数目变化,蛋白质印迹法测定细胞中cleaved caspase-3和MMP-2蛋白表达变化。结果:miR-101在乳腺癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织(P<0.05)。与miR-NC比较,miR-101细胞中miR-101表达水平升高,细胞增殖能力降低,细胞凋亡率升高,细胞侵袭和迁移数目下降,细胞内的cleaved caspase-3蛋白水平表达升高,MMP-2蛋白表达水平减少(P<0.05)。结论:MiR-101在乳腺癌组织中表达下调,上调miR-101抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移并诱导细胞凋亡。     

盐酸青藤碱对Jeko-1细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制研究

目的:探讨盐酸青藤碱对人套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株增殖、凋亡及AKT信号通路的影响。方法:应用四甲基偶氮唑盐方法(MTT)绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化,Western blot检测细胞周期蛋白CyclinD1、凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、Caspase-3及Akt信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K的变化。结果:盐酸青藤碱能明显抑制Jeko-1细胞株的增殖,Jeko-1细胞经终浓度为0、1、2和4 mmol/L盐酸青藤碱作用24 h后,凋亡率分别为(2.21±1.05)%、(11.29±2.42)%、(18.79±2.84)%和(31.05±3.52)%,其差异有统计学意义(P0.01);Western blot检测发现,细胞周期蛋白CyclinD1、凋亡相关蛋白BCL-2表达下降,而BAX、Caspase-3蛋白表达上调,Akt信号通路相关蛋白中Akt表达无变化,而p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K蛋白磷酸化水平降低。结论:盐酸青藤碱可明显抑制Jeko-1细胞增殖,其机制有可能通过下调Akt信号通路中的p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K磷酸化水平,从而抑制Akt信号通路,促进细胞凋亡。     

三氧化二砷诱导套细胞淋巴瘤细胞株凋亡及机制研究

本研究旨在探讨三氧化二砷(ATO)诱导套细胞淋巴瘤(MCL)细胞株凋亡的效应及其机制。以不同浓度的ATO处理细胞,再通过MTT法检测细胞MCL细胞株(jeko-1,mino,JVM-2)增殖;用AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测jeko-1细胞的凋亡;用DiOC6(3)染色流式细胞术检测jeko-1细胞的线粒体跨膜电位丢失;用Western blot检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)及凋亡相关蛋白MCL-1,BCL-2,PUMA,NOXA,cCaspase-3,cCaspase-9,cPARP在ATO处理前后的表达变化。结果表明:ATO抑制MCL细胞增殖,诱导MCL细胞凋亡,并且引起MCL细胞线粒体跨膜电位丢失,引起MCL-1,PUMA,cyclin D1蛋白表达水平降低,cPARP,cCaspase-3,cCaspase-9表达水平增加,不影响BCL-2,NOXA表达。结论:ATO能有效抑制MCL细胞增殖,诱导MCL细胞株凋亡,其中细胞凋亡的线粒体途径起着重要的作用。     

miR-152通过调控FOXR2表达抑制人前列腺癌细胞增殖的研究

目的探讨人前列腺癌PC-3细胞中miR-152调控叉头框蛋白R2(FOXR2)对细胞增殖的影响。方法采用实时荧光定量PCR检测人正常前列腺上皮细胞RWPE-1和前列腺癌PC-3细胞中miR-152、FOXR2 mRNA的相对表达水平,Western blot检测FOXR2蛋白水平。miR-152 mimics、miR-152 inhibitor或FOXR2-siRNA转染PC-3细胞后,观察细胞增殖能力的变化。miR-152 mimics、miR-152 inhibitor分别与FOXR23′UTR双荧光素报告基因质粒共转染PC-3细胞,检测荧光素酶活性。miR-152 mimics和miR-152 inhibitor转染PC-3细胞后,检测miR-152、FOXR2 mRNA的相对表达水平及FOXR2蛋白水平。结果与RWPE-1细胞比较,PC-3细胞中miR-152的相对表达水平显著降低(P=0.001),而FOXR2 mRNA的相对表达水平及蛋白水平显著升高(P=0.003、0.003)。miR-152 mimics、miR-152 inhibitor或FOXR2-siRNA转染PC-3细胞后,细胞增殖能力分别显著降低、升高、降低(P=0.022、0.029、0.006)。miR-152 mimics和FOXR23′UTR野生型质粒共转染后荧光素酶活性被显著抑制(P=0.001),而共转染miR-152 inhibitor可显著增加荧光素酶活性(P=0.001)。与对照组比较,miR-152 mimics转染PC-3细胞后,miR-152的相对表达水平显著升高(P<0.001),而FOXR2 mRNA的相对表达水平及蛋白水平显著降低(P<0.001、0.001),细胞活性显著降低(P=0.013);miR-152 inhibitor转染PC-3细胞后,miR-152的相对表达水平显著降低(P<0.001),而FOXR2 mRNA的相对表达水平及蛋白水平显著升高(P<0.001、P=0.007),细胞活性显著升高(P=0.018)。结论miR-152可通过负调控FOXR2表达发挥抑制人前列腺癌PC-3细胞增殖的作用。     

miR-17-92簇对慢性粒细胞白血病细胞K562增殖和凋亡的影响

目的 探讨miR-17-92簇对慢性粒细胞白血病(CML)细胞K562增殖和凋亡的影响。方法 采用RT-qPCR检测CML细胞K562中miR-17-92表达水平;采用Lipofectamin 2000转染miR-17-92 mimic,CCK-8检测转染后K562细胞增殖能力; Annexin V-FITC/PI标记,流式细胞仪检测转染后K562细胞凋亡情况,Western blotting检测转染后K562细胞中转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白表达水平。结果 CML CD34+细胞中miR-17-92表达水平显著高于健康者CD34+细胞,差异有统计学意义(P值均0. 05)。转染miR-17-92后,K562细胞增殖能力较对照组显著升高,凋亡能力较对照组显著降低,差异有统计学意义(P值均0. 05)。转染miR-17-92后K562细胞中TGF-β1蛋白表达水平较对照组均显著升高,差异有统计学意义(P值均0. 01)。结论 miR-17-92表达促进细胞的增殖能力,抑制细胞的凋亡,在CML中发挥促癌基因作用,其作用机制可能与TGF-β1信号通路的激活有关。     

长链非编码RNA HOTAIR靶向调控miR-206对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA HOTAIR对人胃腺癌细胞(AGS)增殖、凋亡的影响。方法实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测正常胃上皮细胞(GES-1)与胃癌AGS细胞中HOTAIR的表达水平,以及si-RNA HOTAIR(si-HOTAIR)转染胃癌AGS细胞后HOTAIR及微小RNA-206(miR-206)的表达水平。生物信息学预测HOTAIR与miR-206的结合位点,荧光素酶报告实验验证二者靶向关系。将细胞分为对照组、si-HOTAIR组、si-HOTAIR+miR-206抑制剂组,采用CCK-8、平板克隆形成实验检测各组细胞的活性和增殖能力,流式细胞术检测各组细胞的凋亡水平,免疫印迹实验检测相关抗凋亡蛋白CDK9的表达水平。结果与正常人胃黏膜上皮GES-1细胞相比,AGS细胞中HOTAIR的表达量显著增高(P 0. 001),miR-206的表达水平显著降低(P 0. 01)。转染si-HOTAIR的AGS细胞中HOTAIR表达量显著降低(P 0. 01),miR-206表达水平显著增高(P 0. 01)。实验结果显示,miR-206模拟物(miR-206 mimics)能显著降低野生型HOTAIR质粒的荧光素酶活性(P 0. 01)。与对照组相比,si-HOTAIR组细胞增殖能力显著降低,凋亡能力显著提高(P 0. 001);与si-HOTAIR组相比,si-HOTAIR+miR-206抑制剂组细胞增殖能力显著增高,凋亡能力显著降低(P 0. 01)。实验结果显示,si-HOTAIR能显著降低CDK9的蛋白水平表达,miR-206抑制剂能显著减弱si-HOTAIR对CDK9表达的抑制作用。结论 HOTAIR能通过靶向调控miR-206促进胃癌细胞的增殖,抑制胃癌细胞的凋亡。     

miR-181a-5p对T淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖和凋亡的影响

目的探究miR-181a-5p对T淋巴细胞白血病(T lymphocytic leukemia, TLL)Jurkat细胞增殖及凋亡的影响。方法采用miR-181a-5p mimic、pc-B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma 2, BCL-2)不同组合方式转染Jurkat细胞,并将细胞分为Jurkat组、mimic-scramble组、miR-181a mimic组、pc-BCL-2组和mimic+pc-BCL-2组。RT-PCR检测miR-181a-5p的表达及pc-BCL-2 mRNA水平,Western Blot检测BCL-2蛋白表达,CCK8和流式细胞学检测细胞增殖和凋亡情况。结果与mimic-scramble组比较,miR-181a mimic组miR-181a-5p表达水平显著升高,BCL-2 mRNA水平下降,差异有统计学意义(P0.01)。与Jurkat组比较,miR-181a mimic组BCL-2蛋白表达量及细胞增殖倍数降低,细胞凋亡率明显升高,pc-BCL-2组BCL-2蛋白表达量及细胞增殖倍数升高,细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P0.01);与miR-181a mimic组比较,mimic+pc-BCL-2组BCL-2蛋白表达量及细胞增殖倍数升高,细胞凋亡率显著下降,差异有统计学意义(P0.01)。结论 miR-181a-5p通过靶向抑制BCL-2表达以抑制TLL细胞系Jurkat细胞增殖、诱导细胞凋亡。     

miR-21对晶状体上皮细胞增殖、迁移的影响

目的探讨miR-21对晶状体上皮细胞增殖、迁移的影响。方法人晶状体上皮细胞(HLE-B3)随机分为三组,实验组转染miR-21模拟剂(mimic),对照组转染miR-21阴性对照(NC),空白组加入等剂量的磷酸盐缓冲液(PBS)。噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,双染法检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移,Western-blot检测细胞Bcl-2、Akt蛋白表达。对三组上述各指标进行比较。结果转染48 h后,实验组中miR-21相对表达水平显著上升,与空白组、对照组比较差异均有统计学意义(P 0. 05)。转染24 h、48 h后,实验组的细胞增殖活性显著低于空白组与对照组(P 0. 05);转染48 h后,实验组的细胞凋亡率显著高于空白组与对照组(P 0. 05),迁移距离与过膜细胞数都显著少于空白组与对照组(P 0. 05)。转染48 h后,实验组的Bcl-2、Akt蛋白表达水平显著低于空白组与对照组(P 0. 05),空白组与对照组对比差异无统计学意义(P 0. 05)。结论 miR-21能通过调节晶状体上皮细胞中Bcl-2、Akt蛋白的表达,从而抑制细胞增殖与迁移,促进细胞凋亡。     

MiR-543对人白血病细胞株K562增殖与凋亡的调控及其机制研究

目的:探讨miR-543对人白血病细胞株K562增殖与凋亡的调控作用及其机制。方法:选择2018年2月-2018年9月在本院接受治疗的CML患者46例(男性27例,女性19例)作为CML组,同时选择30例同期体检健康者作为对照组。利用Lipofectamine 2000脂质体将miR-543模拟物(mimic)及阴性对照mimic转染至K562细胞后,应用CCK8方法检测miR-543对K562细胞增殖的影响,荧光素酶报告法分析miR-543对Wnt基因的靶向关系,流式细胞术检测miR-543对白血病细胞凋亡影响,Western blot方法检测Wnt、β-catenin、BCL-2、C-Myc及BAX表达水平。结果:慢性髓系白血病患者的miR-543水平显著低于健康对照组(P 0.05);miR-543 mimic组的miR-543的表达水平显著高于空白对照组(P 0.05);miR-543 mimic组的Wnt基因mRNA水平显著低于空白对照组(P 0.05)。miR-543 mimic可降低Wnt野生质粒的荧光素酶表达水平(P 0.05);miR-543 mimic对Wnt突变质粒的荧光素酶表达水平无抑制作用(P 0. 05)。miR-543 mimic组K562细胞增殖水平显著低于空白对照组及阴性对照scramble mimic组(P 0. 05)。miR-543 mimic组K562细胞凋亡水平显著高于空白对照组及阴性对照scramble mimic组(P 0. 05)。miR-543 mimic组细胞的Wnt、β-catenin、BCL-2及C-Myc蛋白水平均显著低于空白对照组及阴性对照(scramble mimic)组(P 0.05);miR-543 mimic组的BAX蛋白水平高于空白对照组及阴性对照(scramble mimic)组(P 0.05)。结论:miR-543可靶向Wnt蛋白,抑制Wnt信号通路活性,从而抑制白血病细胞的增殖能力,提高细胞凋亡水平。     

shRNA干扰AKT基因对Jeko-1细胞增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响

目的:探讨RNA干扰沉默AKT基因对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株的增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响。方法:设计针对AKT基因短发夹RNA,将其连入pGPU6/GFP/Neo质粒中,构建AKT shRNA真核表达载体,经脂质体转染入Jeko-1细胞,应用RQ-PCR及Western blot鉴定其干扰效果,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞凋亡的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白信号及通路相关蛋白p-AKT、Notch1、HES1的变化。结果:AKT shRNA转染Jeko-1细胞后,AKT的mRNA和蛋白表达均明显下降,有统计学意义(P0.05);转染组细胞增殖率明显低于Neg-shRNA组和空白对照组(P0.05),AKT shRNA传染48 h后,凋亡率为(37.72±4.39)%,而NegshRNA组和空白对照组分别为(2.62±1.53)%、(1.57±0.42)%,差异有统计学意义(P0.01);凋亡相关蛋白BCL-2表达下降,而BAX、caspase-3、caspase-9表达上升;PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-AKT磷酸化水平下降、Notch1信号通路相关蛋白Notch1、HES1表达下调。结论:干扰沉默AKT基因可抑制套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能是特异性抑制PI3K/AKT信号通路也能下调Notch1信号通路的活性。     

shRNA干扰mTOR基因对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖抑制及其作用机制研究

目的 探讨RNA干扰沉默mTOR基因后对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法 设计针对mTOR基因短发夹RNA,将其连入pGPU6/GFP/Neo质粒中,构建mTOR shRNA真核表达载体,经脂质体转染入Jeko-1细胞,采用实时定量PCR及Western blot方法鉴定其干扰效果;用MTT法绘制细胞生长曲线,经流式细胞术检测细胞凋亡的变化,用Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、procaspase-3 、procaspase-9及mTOR下游底物激酶P70S6K、p-P70S6K的表达.结果 mTOR shRNA转染Jeko-1细胞后,mTOR基因的mRNA及蛋白表达均明显下降(P＜0.05);转染组增殖率明显低于Neg-shRNA组和空白对照组(P＜0.05),mTOR shRNA转染48 h后,凋亡率为(36.62±3.24)％,而Neg-shRNA组和空白对照组分别为(2.58±1.04)％、(1.24±0.30)％,差异有统计学意义(P＜0.05);凋亡相关蛋白 Bcl-2、procaspase-3、procaspase-9的表达下降,而Bax表达上升,mTOR下游底物激酶P70S6K未见明显变化,而其活性形式p-P70S6K的表达下降.结论 干扰沉默mTOR基因后可通过抑制mTOR信号通路的活性,抑制套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖,激活凋亡相关蛋白诱导细胞凋亡.     

miR-141靶向调控Keap-Nrf2/HO-1信号通路对卵巢癌发生发展的影响

目的观察卵巢癌组织和细胞中miR-141的表达,探讨其异常表达对卵巢癌细胞Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)-核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)信号通路的影响。方法回顾性收集2018年1月4日至2018年12月1日就诊于中国人民解放军中部战区总医院妇产科并经病理切片诊断为卵巢上皮癌患者的手术标本15例、良性卵巢肿瘤标本15例及正常卵巢组织标本15例。免疫组化检测不同标本中Keap1、Nrf2、HO-1的阳性表达,qRT-PCR检测卵巢组织及细胞中miR-141和Keap1、Nrf2、HO-1的mRNA表达情况。在SKOV3细胞内转染miR-141 siRNA后,qRT-PCR检测细胞内Keap1、Nrf2、HO-1 mRNA水平的表达情况,Western Blot检测细胞内Keap1、Nrf2、HO-1蛋白水平的表达情况;分别消化、收集转染miR-141 siRNA,阴性对照物,Nrf2 siRNA及阴性对照物的SKOV3细胞后,继续培养0 h、24 h、48 h后,MTT检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,细胞划痕试验检测细胞迁徙改变情况。结果 Keap1蛋白在卵巢癌组织中的阳性表达显著低于良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织。Nrf2和HO-1蛋白在卵巢癌组织中的阳性表达显著低于良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织,差异有统计学意义(P 0. 05);转染miR-141siRNA抑制其表达后,与转染阴性对照物组相比,细胞内Keap1 mRNA水平和蛋白表达显著上升,Nrf2、HO-1 mRNA水平表达变化无显著差异,而蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P 0. 05);转染miR-141siRNA和Nrf2 siRNA组细胞与转染阴性对照物组相比,增殖显著下降,凋亡显著上升,细胞迁移距离显著下降,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论卵巢癌细胞中,miR-141异常高表达,异常高表达的miR-141可以通过调控Keap1-Nrf2/HO-1信号通路影响卵巢癌细胞的增殖与凋亡。     

雷帕霉素通过EZH2/Hedgehog信号通路诱导慢性髓系白血病细胞凋亡

目的:探讨雷帕霉素诱导慢性髓系白血病(CML)细胞凋亡的机制。方法:对CML细胞K562用雷帕霉素10(A组)、15(B组)和20(C组) nmol/L分别处理24 h,对照组不加雷帕霉素。采用MTT法检测雷帕霉素对K562细胞增殖的影响, AnnexinV-FITC/PI双染法检测雷帕霉素对K562细胞凋亡的影响, RT-PCR检测雷帕霉素对K562细胞EZH2/Hedgehog信号通路基因表达水平,Western blot检测雷帕霉素对K562细胞凋亡及相关信号通路蛋白表达水平。结果:MTT法检测发现,不同浓度雷帕霉素对细胞增殖有明显抑制作用,其中C组的细胞存活率37.6%±3.4%,显著低于其它各组(P0.05)。通过AnnexinV-FITC/PI双染法检测发现,C组细胞的凋亡率为93.1%±8.1%,显著高于其它各组(P0.05)。Western blot检测发现,K562细胞在雷帕霉素作用后,C组的Caspase-3和BAX蛋白相对表达水平分别为0.36±0.04、0.39±0.06,显著高于其它各组(P0.05);BCL-2蛋白水平0.17±0.03,显著低于其它各组(P0.05)。RT-PCR检测发现,K562细胞在雷帕霉素作用后,EZH2与Hedgehog基因mRNA水平明显下降(P0.05),而Ptch1基因m RNA水平明显上升(P0.05)。Western blot检测发现,K562细胞在雷帕霉素作用后,其EZH2与Hedgehog蛋白表达水平下降,而Ptch1蛋白水平上升(P0.05)。C组的EZH2与Hedgehog蛋白相对水平分别为0.21±0.03、0.16±0.05,显著低于其它各组(P0.05);Ptch1蛋白水平0.46±0.06,显著高于其它各组(P0.05)。结论:雷帕霉素可抑制白血病细胞中EZH2蛋白表达,从而干扰Hedgehog信号通路的激活,并促进凋亡蛋白的表达,减少抗凋亡蛋白水平,最终诱导白血病细胞的凋亡。