滑动窗PCA分时段方法在诺西肽发酵过程中的应用

抗生素的发酵过程通常可以划分为几个不同的发酵时期，识别抗生素发酵过程不同发酵时期对补料及不同的控制策略的实施至关重要，而目前划分不同时期的依据一般是根据生产经验来进行判断，从而很大程度地影响产品的产量。本文将滑动窗PCA分时段方法应用于抗生素诺西肽发酵过程阶段的划分。通过分析过程相关性的变化进行子阶段的划分，阶段划分结果与过程知识相一致。这不仅可以估计生产状况，增进对发酵过程的理解，而且可以指导适时地实施各种控制策略，从而提高产品的产量。     

那西肽产生菌S.actuosus选育及发酵条件的优化

目的　提高那西肽产量。方法　介绍那西肽产生菌活跃链霉菌S .actuosus(Z10 ) 的诱变育种 ,诱变的方法有紫外线、亚硝基胍及两者的联合诱变 ,并对高发酵单位菌种优化发酵条件和测定其生化曲线。结果　通过紫外线及亚硝基胍联合诱变获得高产菌株Z12 ,该菌种进行 4次传代试验显示稳定 ,经发酵条件优化后在培养基中添加 2 %黄豆粉 ,0 .0 1%硫酸锰可以提高那西肽产量。菌种Z12 相对于出发菌种Z10 提高那西肽产量达 5 8.9%。结论　通过紫外线及亚硝基胍联合诱变可以筛选到高活力菌种     

那西肽产生菌Streptomyces actuosus的诱变

本文介绍了亚硝基胍(NTG)、溴乙锭(EB)、紫外线(UV)和吖啶类染料等各类诱变剂对含硫多肽类抗生素那西肽产生菌的诱变,其中吖啶类染料的诱变作用最强,突变率可达0.4％以上。本文也比较了发芽孢子和原生质体的诱变,结果显示了两个材料的突变率比较接近。通过对1万余株诱变后菌株的观察,本研究共获得15株负变株。3株正变株和4株营养缺陷型。这些突变株将作为进一步研究的材料和手段。     

基于尼龙膜的点杂交条件的建立及优化

目的:进行基于尼龙膜的点杂交条件的建立及优化。方法:采用带正电荷的尼龙膜对斑点杂交的每一步骤进行优化,包括预杂交液,杂交液,洗涤和封闭液等及各步反应时间,并采用最终确立的条件检测糖基转移酶基因多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(pp-Gal NAcT2)在K562、NB4、NI H3T3和SGC7901细胞株中的差异表达以验证膜杂交条件的可行性。结果:建立并优化了膜斑点杂交的条件,本底清晰,结果可靠。结论:建立的斑点杂交技术经济简便,切实可行。     

人肽抗生素hPAB-β多拷贝串联基因工程菌的筛选及发酵研究

目的：对已构建的人肽抗生素hPAB-β 1～8拷贝串联基因工程菌进行筛选，并对其优势菌株进行发酵研究，为hPAB-β的规模生产奠定基础。方法：对1～8拷贝串联基因工程菌的目标蛋白表达率进行比较后，选择2～5拷贝菌进行菌产量、目标蛋白表达率、包涵体溶解性、亲和层析效果比较，确定最佳多拷贝菌；对其摇瓶条件下发酵的培养液、温度、气体条件、IPTG诱导时机、浓度及时间进行研究。结果：在相同条件下，3拷贝菌产量(3．153g／L)最高，目标蛋白表达率(27．8％)接近最高水平，包涵体能溶解完全；利用亲和层析能成功捕获融合蛋白，后者经羟胺裂解，可获得相对分子质量与合成hPAB-β成熟肽大小相符的小肽，筛选出的优势菌传代稳定，其最佳摇瓶发酵条件为37℃，160r／min条件下，在改良M9-cAA培养液中培养至吸光值(A600)≈2．5时，以终浓度为100μmol／L的IPTG诱导表达5h。结论：确定了3拷贝菌为最佳多拷贝菌，并确定了其最佳摇瓶发酵参数。     

人脑钠素基因工程菌的发酵条件及产生物纯化研究

为进一步提高工程菌的下游纯化效率，本文利用高效表达质粒载本将多拷贝脑钠素基因转入宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉＭ５２１９，摸索最佳发酵条件，热诱导获较高表达；通过超声裂解收获目的蛋白包涵体，采用制备性电泳成功获得纯度大于９５％的５ＢＮＰ融合蛋白；经ＢＮＰ／ＳＫＡＴＯＬＥ裂解成单后测得有舒张血管活性。该纯化路线为后续工作提供了线索。     

基因工程菌发酵表达rhG-CSF的条件优化

目的通过优化基因工程菌Escherichia coli BL21（DE3）Plys表达重组人粒细胞集落刺激因子（rhGCSF）蛋白的发酵工艺,提高蛋白产量。方法以100 L规模发酵为例,从不同的接种量（1%～10%）、加入IPTG进行诱导时的不同OD600nm值,诱导表达后的不同溶氧可控制范围（20%～80%）等方面进行优化。用SDS-PAGE对蛋白表达量进行检测。结果优化后的方案为：采用5%的接种量,在OD600nm达到10～15时加入诱导剂IPTG,诱导起始后前20 min控制溶氧在80%以下,20 min后通过补加氨水控制pH在7.0左右,补料调节控制溶氧在20%～40%的范围内,诱导表达5 h后收集菌体。优化后的发酵方案极大提高了蛋白表达量。结论 rhG-CSF蛋白发酵方案的优化对大规模生产具有重要的指导意义。     

一株L－亮氨酸产生菌的研究

以天津短杆菌（ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍＴｉａｎｊｉｎｅｓｅ）Ｔ６～１３为出发菌株，采用紫外线进行诱变处理，筛选α－氨基－β－羟基戊酸和利福平抗性突变株，获得一株Ｌ－亮氨酸产生菌Ｎｏ。１４５，Ｌ－亮氨酸摇瓶产量可以达３２．１ｍｇ／ｍＬ。在１６Ｌ发酵罐中培养６０ｈ，Ｌ－亮氨酸产量可以达２１．８ｍｇ／ｍＬ葡萄糖转化率可以达２０％。发酵液经７３２强酸性阳离子树脂提取，再以等电点一有机溶媒法结晶。产品经生物鉴定，红外吸收光谱，纸层析和比旋光度等项测定，证明产品为Ｌ－亮氨酸。     

降血糖色素产生菌F120固态发酵条件研究

目的 本实验室筛选到一株可以代谢产生大量吲哚醌色素的土曲霉F120;吲哚醌色素具有显著降血糖活性;为了提高F120菌株产吲哚醌色素的产量,本实验对F120菌株固态发酵条件进行优化研究.方法 使用大米作为固态发酵培养基,考察单因素对产量的影响,通过正交试验确定最优发酵条件.结果 吲哚醌色素的最高产量可达1.131 5g/kg.结论 菌株F120的固态发酵条件优化后,产量大幅提高,并且发酵方法简单可靠.     

基于微生物基因组的新型天然产物发现策略

微生物天然产物的生物合成是一个从基因到化合物的过程。微生物基因组内未被发掘的孤儿或沉默途径所编码的新型次级代谢产物的合成潜力远远超过现已发现的代谢产物数量。微生物基因组大规模测序的广泛开展,为天然产物的发现和研究提供了新的研究领域和契机。本文主要介绍基于微生物基因组序列的新型天然产物的发现策略及其研究进展。可以预计,随着实验技术的不断发展,采用基于基因的药物发现模式可以充分发掘微生物产生天然产物的潜力,微生物基因组内的孤儿或沉默途径编码的未知代谢产物将成为新药开发的重要源泉。     

长双歧杆菌液态发酵条件的优化及生长曲线的测定

目的优化长双歧杆菌的液态发酵条件。方法通过单因素试验方法,考察长双歧杆菌液态培养基的最佳初始pH、培养温度、接种量和培养时间。结果长双歧杆菌的最佳发酵条件为:发酵液初始pH 7.0、发酵培养温度39℃、发酵接种量6%、最佳培养时间8～10 h。结论本课题研究确定的发酵工艺有效地提高了长双歧杆菌的培养效率。     

酶活性RNA（Ribozyme）的发现及其认识论

酶活性ＲＮＡ是一类具有携带遗传信息和催化作用双重功能的ＲＮＡ分子这一发现打破了“酶的本质是蛋白质”的传统观念。利用Ｒｉｂｏｚｙｍｅ所进行的基因干预和基因治疗展现出重要的实用价值。     

海蛇发酵去腥后与其生药材的对比研究

目的探讨海蛇经发酵去除腥味后,与其生品在生药学方面的差异,确定发酵对海蛇各方面的影响。方法利用性状、显微、薄层及红外扫描四个方面对海蛇生品与发酵品进行研究。结果海蛇生品与发酵品的生药学特征,发酵前后有一定的差别。发酵品与生品含有同样的氨基酸成分,海蛇在发酵去腥后,仍保持良好的功效。结论发酵对海蛇的生药学特征影响不大,采用发酵去除海蛇腥味具有一定的可行性。     

HLA基因DRB1*150106的发现及家系调查分析

目的:用DNA测序的方法确定新的HLA等位基因,调查分析该基因的遗传情况。方法:用SSO流式荧光微技术HLA分型技术进行HLA-A、B、DRB1中低分辨查测对疑为新基因的样本用DNA测序方法确定新的基因,并对该新基因携带者家系调查。结果:用流式荧光微珠法HLA分型检测出现无法解释的结果,怀疑为新的基因序列,经对怀疑为新基因第二外显子进行测序分析,确定为新的基因序列,与之相近序列等位基因DRB1*150101相比,在2外显子164 A>T,家系分析该新基因来自受检者母亲一方。结论:该新基因已由WHO HLA因子命名委员会注册,命名为DRB1*150106(DQ514601、HW10003803),该新基因的产生机制及生物等功能有待进一步研究。     

新型阳离子脂质体的制备及其转染效率的测定

目的制备以新型细胞转染素为阳性成分的阳离子脂质体,作为基因载体,用于基因转染的实验研究和肺部疾病的基因治疗.方法用薄膜法制备N4-精胺胆固醇羰酰氨阳离子脂质体,通过电镜观察和电泳,检测其形态、结构和细胞转染条件,并对SPC肿瘤细胞进行转染,评估其转染效率.结果制备的新型阳离子脂质体具有良好的微囊形态,当脂质体∶质粒为(6～8)∶1时,其转染效率可达60%.结论成功制备了新型阳离子脂质体,在适当条件下其具有较高的转染活性,为以后的基因转染和基因治疗打下基础.     

具有高效降解地塞米松能力的伯克霍尔德菌CQ001株的分离及功能基因组学分析

目的 研究细菌对地塞米松类甾体激素的降解作用及其分子机制,为构建清除水环境医源性地塞米松类药物污染的工程菌奠定基础.方法 采用富集培养法从医院废水中分离降解地塞米松的细菌,采用固相萃取-高效液相色谱(HPLC)法检测细菌对地塞米松的降解效能,通过16S rDNA序列测定进行鉴定.用Illumina Hiseq4000结合第三代测序技术对降解菌的全基因组测序,并进行序列组装、注释和分析,对降解地塞米松相关基因进行RT-qPCR验证.结果 分离到1株对地塞米松有较高降解作用的细菌,经鉴定属于伯克霍尔德菌属(Burkholderia),命名为Burkholderia sp.CQ001.该菌对地塞米松磷酸钠及地塞米松的降解率分别为84.8％和77.11％.全基因组测序表明Burkholderia sp.CQ001包含2条染色体和4个巨型质粒,与代谢相关基因大部分集中在2号染色体上,共3 260 157 bp.生物信息学分析表明,该菌含有甾体代谢通路中许多重要酶类的编码基因,其中与地塞米松降解相关的有ABC转运子,3-甾酮-9 α-脱氢酶等,这些基因在以地塞米松磷酸钠为碳源的培养条件下表达量不同程度地高于以蔗糖为碳源的培养条件.结论 Burkholderia sp.CQ001是一株具有强大的代谢功能和代谢途径丰富的细菌,具有降解地塞米松类甾体激素的性能,该菌株为后续研究甾体激素的降解机制和构建清除水环境医源性地塞米松类药物污染的工程菌提供了菌种.     

北京市1株人狂犬病病毒分离鉴定及其分子特征

目的研究北京市一株人狂犬病病毒的N、G基因的分子特征,比较与全国流行株以及疫苗株之间的差异。方法以直接免疫荧光技术检测病人脑组织,昆明乳鼠颅内接种法分离病毒株。以RT-PCR方法扩增病毒的核蛋白及糖蛋白基因,克隆测序后进行遗传学分析。结果直接免疫荧光检测到病人脑组织中的病毒颗粒,用乳鼠颅内接种法分离到了毒株。命名为Beijing（H）株。遗传分析表明Beijing（H）株与目前我国的主要流行株N基因和G基因的核苷酸序列同源性分别是97．6％～99．1％和97．5％～99．7％。推导的氨基酸序列同源性分别是97．6％-99．2％和97．7％-99.8％。结论Beijing（H）株为基因1型狂犬病毒,属于我国目前的流行株,其与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异。     

产胞外蛋白酶细菌的快速筛选及其发酵产酶条件的初步研究

目的探讨产胞外蛋白酶细菌的快速筛选方法和产酶条件优化。方法取昆明郊区的农田土壤及河沟淤泥,采用含脱脂奶粉的菌种筛选培养基和划线法分离产蛋白酶的菌株,选用5种培养基进行发酵产酶条件优化。结果农田土壤中含有种类较多的产蛋白酶的菌株,菌种单一性不强。YPD培养基发酵的菌种蛋白酶活性高于其他4种培养基。结论利用含脱脂奶粉的筛选培养基进行初筛,YPD进行发酵培养复筛,可以显著提高筛选效率。     

Role of coxsackievirus and adenovirus receptor in the pathogenesis of dilated cardiomyopathy and its influencing factor

Background Although clinical treatment for heart failure and sudden death has been improved over the last few decades, the morbidity and mortality of dilated cardiomyopathy （DCM） have increased. So a better understanding of the underlying molecular events leading to DCM is urgent. Persistent viral infection （especially coxsackievirus group B3） of the myocardium in viral myocarditis and DCM has never been neglected by experts. Recent data indicate that the up-regulation of coxsackievirus and adenovirus receptor （CAR） in viral cardiomyopathy contributes to viral infection as a key factor in the pathogenesis of this disease. This study aimed to investigate the role and regulatory mechanism of CAR in DCM by the bioinformatic method. Methods We identified the clusters of genes co-expressed with CAR by clustering algorithm based on the public available microarray dataset of DCM （Kittleson, et al. 2005）, and mapped these genes into the protein-protein interaction networks to investigate the interaction relationship to each other at the protein level after confirming that the samples are characterized by the cluster of genes in correctly partitioning. Results The gene cluster GENESET 11 containing 33 genes including CAR with similar expression pattern was identified by cluster algorithm, of which 19 genes were found to have interaction information of the protein encoded by them in the current human protein interaction database. Especially, 12 genes present as critical nodes （called HUB node） at the protein level are involved in energy metabolism, signal transduction, viral infection, immuno-response, cell apoptosis, cell proliferation, tissue repair, etc. Conclusions The genes in GENESET 11 together with CAR may play a pathogenic role in the development of DCM, mainly involved in the mechanism of energy metabolism, signal transduction, viral infection, immuno-response, cell apoptosis and tissue repair.