重组活化凝血因子Ⅶ药物的临床应用和研发现状

凝血因子Ⅶ(FⅦ)是一种维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶,作为外源性凝血途径的启动子,主要用于体内产生FⅧ或FⅨ抑制剂的血友病A或B患者的治疗.重组活化凝血因子Ⅶ(rFⅦa)是FⅦ制品最主要的产品,在临床得到广泛的应用.为进一步提高患者疗效和用药顺应性,长效rFⅦa成为当前国际上的研究热点.该文综述了rFⅦa的药理特性、临床...     

人Survivin基因重组腺病毒载体的构建及其表达

目的　构建含有人Survivin基因的重组腺病毒载体,为转染树突状细胞(DC)构建DC疫苗和基因治疗奠定基础。方法　自行设计一对分别含有KpnⅠ和XholⅠ酶切位点的Survivin基因上下游引物,以质粒pCITE/Survivin为模板,通过PCR扩增获得Survivin基因全序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV,获得重组质粒pAdTrack CMV Survivin。通过KpnⅠ和XholⅠ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack Survivin转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy 1 的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。同时将病毒上清转染成纤维细胞,通过观察GFP的表达以及Western blot分析观察Survivin蛋白表达。结果　成功构建了含有人Survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为1 65×108pfu/L。Western blot检测可见16 5kD的Survivin蛋白表达。结论　该重组腺病毒载体的构建及成功转染到成纤维细胞内表达为下一步以人Survivin作为靶抗原的基因治疗奠定了基础。     

脑红蛋白重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的：为进一步研究脑红蛋白（NGB）的生理功能并为基因治疗缺血性脑损伤提供有效的表达载体，应用细菌内同源重组方法分别构建含NGB及绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒表达载体，并对其进行鉴定。方法：用电转方法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌，制备BJ5183-pAdEasy-l细菌，再以后者作为电感受态细菌，与线性化质粒pShuttle-CMV-NGB进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-NGB，转染293细胞。制备含脑红蛋白基因的重组腺病毒。结果：通过PCR、序列测定和Western印迹杂交鉴定，确认该重组腺病毒表达载体可正确表达脑红蛋白。结论：成功地构建了表达NGB基因的重组腺病毒载体，为深入开展脑红蛋白的功能研究以及用于缺血性脑损伤疾病的基因治疗奠定了基础。     

携带人血红素氧合酶-1基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建人血红素氧合酶 - 1(hHO - 1)重组腺病毒,为基因治疗心肌细胞缺氧性损伤提供可能.方法:将hHO - 1 cDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pSGCMV,得到重组质粒pSGCMV - hHO - 1.采用位点特异性重组系统(Cre/Loxp)将pSGCMV - hHO - 1与腺病毒骨架载体pBHGloxP△E3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,生成带有hHO - 1基因的重组腺病毒载体Ad - hHO - 1.重组腺病毒质粒在293细胞中扩增,氯化铯梯度离心纯化.结果:经酶切鉴定和测序证实载体构建的正确性,病毒滴度为2.0×1010pfu/ml.结论:成功构建带有hHO - 1 cDNA的重组腺病毒,可用于对心肌细胞缺氧性损伤的基因治疗研究.     

重组人survivin腺病毒的构建与鉴定

目的构建人survivin基因shRNA重组腺病毒载体,为缺氧性肺动脉高压（Hypoxic pulmonary hypertension, HPH）的基因治疗研究提供实验基础。方法构建survivin-siRNA表达质粒,测序鉴定正确后,将survivin-siRNA表达质粒与含有腺病毒右臂的骨架质粒pBHGE3共转染至人293A细胞,包装成腺病毒Ad-survivin并扩增,TCID50法测定病毒滴度。将人肺动脉平滑肌细胞缺氧培养24 h,并将细胞分为空白对照组（Con组）,阴性对照组（Ad-LacZ组）,不同Ad-survivin序列的干扰组（sh1组、sh2组、sh3组）。Ad-survivin感染缺氧人肺动脉平滑肌细胞,Western blot检测survivin蛋白,验证重组腺病毒干扰效果。结果①将shRNA片段与pAd-U6-CMV连接后的质粒进行测序,结果提示目的基因片段插入成功;②TCID50法测定病毒Ad-survivin-shRNA1、Ad-survivin-shRNA2和Ad-survivin-shRNA3的滴度分别是1×1010,1.2×1010,1×1010;③sh2组缺氧人肺动脉平滑肌细胞内survivin蛋白表达明显低于其他4组(P＜0.05)。结论本研究成功构建人survivin腺病毒载体,为研究survivin基因在缺氧性肺动脉高压中的作用提供了实验基础。     

用IRES及dhfr构建哺乳动物细胞双表达载体

目的 :构建同时表达抗体的重链和轻链的哺乳动物细胞双表达载体。方法 :将微小RNA病毒内部核糖体进入位点 (IRES) ,亚克隆到质粒载体 pCdhfr1多克隆位点 ,构建了哺乳动物细胞双表达载体 pCdhfr5。 结果 :pCdhfr5具有两处多克隆位点 ,由IRES相连。能同时表达两个外源基因。把绿色荧光蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因分别亚克隆到 pCdhfr5的上下游多克隆位点MCS1和MCS2构建了表达质粒 pFN ,经脂质体法转染CHO细胞 ,筛选到同时表达新霉素磷酸转移酶和绿色荧光蛋白的表达株。结论 :双表达载体的构建成功为进一步研究表达抗体全分子的CHO细胞株奠定了基础     

人骨形态发生蛋白12基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建及制备人骨形态发生蛋白12(BMP12)基因重组腺病毒,证明其可感染脂肪组织来源干细胞并表达蛋白。方法:将包含有BMP12cDNA全长序列的BMP12-pED6质粒用限制性内切酶EcoRI进行酶切,得到一个1260bp大小的含有BMP12cDNA的目的基因片段。将目的基因片段插入质粒pcDNA3.1后,用KpnI和PmeI进行双酶切,插入pAdtrack-CMV。插入目的基因片段的穿梭质粒pAdtrack-CMV-BMP12用PmeI进行酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1一起电转化入感受态BJ5183菌株。用PCR及多种酶切方法鉴定重组体。最终将线性化的重组质粒利用脂质体转入293A细胞中进行病毒包装。BMP12基因随着重组腺病毒在感染的293A细胞中扩增而得到复制,并通过CsCl梯度离心法得以纯化。Elisa法检测Ad-BMP12感染脂肪组织来源干细胞后BMP12的蛋白表达。结果:pAdtrack-CMV-BMP12经酶切证实有1260bp的插入片段。酶切及PCR鉴定证实BMP12基因重组腺病毒载体构建成功。GFP(green fluorescent protein)表明重组腺病毒扩增成功并制备出高滴度重组病毒。该重组病毒可成功感染脂肪来源组织干细胞并表达BMP12蛋白。结论:BMP12基因能够重组于腺病毒载体,可以进行有效扩增,产生高浓度的重组腺病毒,从而用于BMP12基因治疗的研究。     

重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞的作用及辐射敏感性的影响

目的 探讨重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞的抑制作用及其辐射增敏性。方法 利用四氮唑盐(MTT)比色法分析重组人p53腺病毒注射液、放射治疗以及两者联合应用对人淋巴瘤细胞Raji 和Daudi的抑制作用;通过蛋白质的Western印迹分析法(Western blotting)分析淋巴瘤细胞内P53蛋白的表达;应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测淋巴瘤细胞内p53基因的mRNA表达。结果 MTT结果显示重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞具有一定的抑制作用,但抑制作用不显著,Raji 及Daudi 细胞最大剂量的抑制率分别为27.5%±4.1%和28.1%±1.6%,也未见明显的辐射增敏效应。Western blotting和RT-PCR结果表明,外源性P53蛋白和p53基因的mRNA均有所表达,但未见高效表达和明显的辐射增敏性。结论 重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞的抑制作用及辐射增敏性不显著。     

同源异形盒Gax基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的:构建同源异形盒Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定。方法:采用两步CaC l2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠Gax基因,将Gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(33.5 kb)的B J5183细菌,经细菌内同源重组产生携带Gax基因的重组腺病毒载体pAd-Gax,经限制性内切酶BstⅨ和PacⅠ鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,包装产生携带Gax基因的重组腺病毒Ad-Gax。利用GFP的表达鉴定Ad-Gax。结果:构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1010pfu/L。结论:成功地构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

腺病毒载体的研究进展

基因治疗技术的发展已逐步成为解决生物学基本问题的一种手段,载体技术研究与开发得到迅速发展。现在应用的载体可分为两大部分：非病毒载体和病毒载体,而腺病毒载体是几个常用病毒载体之一,与其他病毒载体不同,腺病毒载体的诸多优点决定了腺病毒载体在基因治疗领域中具有广阔的应用前景。     

重组人p53腺病毒制品治疗原发性肝癌的进展

近几年来,利用抑癌基因治疗原发性肝癌逐渐成为研究的热点之一,重组人p53腺病毒(rAd-p53)制品治疗原发性肝癌也越来越受到高度关注。本文通过总结近几年这方面的研究进展,以评价其临床应用价值与发展前景。     

人血管内皮生长因子B的重组腺病毒制备与鉴定

血管内皮生长因子Ｂ(ＶＥＧＦ Ｂ)是一种近年来发现的血管内皮生长因子家族的新成员 ,结构与ＶＥＧＦ较为相似 ,能竞争性地与ＶＥＧＦ的受体之一ＶＥＧＦＲ 1结合〔1〕。研究表明 ,尽管ＶＥＧＦ Ｂ广泛存在于多种组织 ,但以心肌和骨骼肌为主。在胎儿发育期及缺血缺氧条件下 ,ＶＥＧＦ Ｂ在心肌中的表达量显著升高〔2〕。笔者认为 ,ＶＥＧＦ Ｂ可能对心肌缺血区的血管再生起着积极的促进作用 ,而该方面的研究国内外均未见报道。本研究在获取人ＶＥＧＦ Ｂ( 186)基因的基础上构建成ＶＥＧＦ Ｂ腺病毒重组粘粒 ,为研究其在心肌缺血区基因转染后…     

重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP的构建与鉴定

目的人血管内皮生长因子（的hVEGF165）为靶基因,增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因构建体的复制缺陷型腺病毒载体,为基因治疗牙周进一步再生奠定了基础。方法质粒的pDC316-的VEGF165为模板,PCR扩增基因片段进行消化,获得的hVEGF165用于连接到含有绿色荧光蛋白标记基因重组质粒的消化方法的pDC316-MCMV-EGFP质粒载体,PCR鉴定和双酶切证实成功构建重组质粒;使用ADMAX包装系统,改造的质粒共转染用质粒骨架293包装细胞系和重组病毒的扩增;扩增病毒的离子交换纯化;TCID50测定病毒粒子和效价的数目;的荧光的荧光显微镜重组腺病毒表达。结果 PCR鉴定,酶切分析和测序证实成功构建人VEGF基因的携带绿色荧光蛋白标记（的hVEGF165）重组质粒的pDC316-的hVEGF165-MCMV-EGFP和同源重组腺病毒Ad5的-的hVEGF165-EGFP的成功。扩增和纯化后,腺病毒颗粒的数量测量5.4×1011VP/mL,约2.0,为1.8×1010CCID50/mL的滴度OD260/OD280值。结论成功构建携带hVEGF165基因重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP并获得高滴度病毒颗粒,为hVEGF165基因功能研究以及细胞移植、基因治疗提供有效的工具。     

人血管内皮生长因子-D的重组腺病毒制备与鉴定

生物旁路是近年来缺血性心脏病治疗研究的一个新热点。本研究旨在构建人血管内皮生长因子－Ｄ重组腺病毒,为基因转染研究所准备。用重组粘粒和ＤＮＡ－ＴＰＣ混合后,以磷酸钙共沉淀法转染２９３细胞,获取重组腺病毒。重组粘粒插入方向及重组腺病毒均经酶切鉴定为正确。所得重组腺病毒为Ｅ１缺陷,可用于体内基因治疗研究。     

携载人基质金属蛋白酶组织抑制剂-2基因重组腺病毒载体的构建

目的　构建携载人基质金属蛋白酶组织抑制剂 2 (hTIMP 2 )基因的重组腺病毒载体 ,为基因治疗提供实验基础。方法　利用基因重组技术将腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1以及线性化的重组穿梭质粒 pTrack CMV hTIMP 2共转化BJ5 183受体菌并在其中发生同源重组 ,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子 ,重组腺病毒质粒AdhTIMP 2经过 2 93细胞的包装 ,扩增和纯化后 ,测定病毒滴度。一步法提取细胞总RNA ,RT PCR检测hTIMP 2的mRNA。收集细胞上清 ,进行Western杂交检测TIMP 2蛋白。结果　得到了携带hTIMP 2基因的重组腺病毒 ,纯化后滴度为 4× 10 11pfu/ml,应用RT PCR和Westernblot方法 ,在转染 2 93细胞后 2 4h即可检测到hTIMP 2的表达。结论　成功地构建了携带hTIMP 2的重组腺病毒载体 ,为下一步的基因治疗提供了基础。     

人Toll样受体2胞外区基因重组腺病毒的制备及鉴定

目的 构建含有人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的重组腺病毒载体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增TLR2胞外区全长基因,克隆人pMD18-T载体并经测序验证后,通过KpnⅠ和HindⅢ双酶切将目的 片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中.将构建止确的重组质粒pAdTrack-CMV-TLR2用Pme Ⅰ酶切线性化后转化感受态AdEasier-1细菌,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒.将鉴定正确的重组质粒pAd-TLR2经PacⅠ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞中进行包装并扩增病毒.观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并测定病毒滴度,用PCR法鉴定重组腺病毒.结果 RT-PCR扩增得到的目的 基因片段与GenBank中的序列一致,经酶切鉴定及PCR检测证实携带人TLR2胞外区全长基因的重组腺病毒制备成功,获得高滴度(3×109pfu/ml)的重组腺病毒.结论 成功制备了表达人TLR2胞外区基因的重组腺病毒,为后续研究奠定了基础.     

构建Egr-1启动子调控Smad7基因的重组腺病毒及启动子活性研究

目的　构建含Egr 1启动子和Smad7cDNA的重组复制缺陷型腺病毒并研究射线诱导Egr 1基因启动子调控Smad7体外表达的时间和剂量效应 ,为下一步的基因治疗奠定基础。方法以Adeno XTM表达试剂盒为基础 ,应用分子克隆技术 ,将穿梭质粒pShuttle的CMV启动子替换为Egr 1启动子 ,将Smad7cDNA亚克隆至穿梭质粒内 ,与腺病毒DNA重组 ,在HEK2 93细胞中进行包装、扩增 ,纯化测定病毒滴度。通过Westernblot检测X射线照射激活Egr 1启动子调控Smad7体外表达的时间和剂量效应。结果　经酶切、PCR及测序鉴定证实成功构建了含Egr 1启动子和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒pAdES。病毒滴度为 3 0× 10 1 1 TCID50 ml。感染重组腺病毒的靶细胞经不同剂量的深部X射线照射后Smad7蛋白表达量存在一定的时间、剂量差异 :实验组Smad7蛋白表达量在照射后 1h即已升高 ,2～ 7h之间维持在一个较高水平 ,尔后表达量开始下降 ;实验组中Smad7蛋白表达量随着吸收剂量的增加而增加 ,在 8～ 15Gy之间维持一个较高的表达水平。而对照组Smad7蛋白表达量无明显的时间和剂量效应。结论　成功构建了含Egr 1启动子和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒pAdES ,重组于腺病毒内的Egr 1启动子经射线激活后具有调控下游Smad7表达的活性。     

双基因重组腺病毒表达载体pAdxsi—GFP-HIF—KGF的构建及表达

目的：构建同时携带低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和角质细胞生长因子（KGF）的腺病毒载体（pAdxsi—GFP—HIF—KGF）,观察其在A549中的表达。方法：从低氧处理A549细胞中PCR扩增HIF—1αDNA,并连接到载体pShuttle—CMV—EGFP上得到重组质粒pShuttle—GFP—HIF,同时将从质粒pIRES2一EGFP—KGF扩增的KGF基因也克隆其上,获得穿梭重组质粒pShuttle—GFP—HIF—KGF。再将其重组到pAdxsi病毒骨架载体上,构建携带HIF-1仅和KGF双基因的重组腺病毒载体。观察重组腺病毒转染3_549细胞后表达情况。结果：证实携带HIF—1α和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi—GFP—HIF—KGF成功构建。其转染A549细胞后可有效表达HIF一1和KGF蛋白,48h时HIF-1蛋白表达水平为（56．36±4．53）ng／ml,KGF蛋白表达水平为（60．20±2．92）ng／ml。结论：成功构建了双基因腺病毒载体pAdxsi—GFP—HIF—KGF,其可有效转染表达,具有进一步在肺损伤防治应用的前景。     

人p58.2重组逆转录病毒载体的构建及稳定包装细胞系的鉴定

目的　构建并稳定携带人p5 8.2基因的重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　用PCR技术从pSPORT1 -p5 8.2扩增出编码p5 8.2N端 1～ 345个氨基酸的全长基因 ,定向克隆入逆转录病毒载体pMSCV neo中 ,酶切鉴定 ;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT6 7,G4 1 8筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果　双酶切鉴定 ,成功构建重组逆转录病毒载体 ;重线逆录病毒载体转入包装细胞 ,经G4 1 8筛选 ,形成了抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 3× 1 0 5cfu/ml,提示构建携带人p5 8.2基因的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论　构建人p5 8.2基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对血液系统疾病进行基因治疗的方法     

负载人miR-29a复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的包装负载人miR-29a前体全长cDNA（pre-miR-29a）的复制缺陷型腺病毒载体（Ad-miR29a）。方法将pre-miR-29a全基因合成后,插入腺病毒穿梭质粒pDC315,与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE13、Cre共转染人胚肾293细胞（HEK293）,包装重组慢病毒Ad-miR29a,扩增、收集并纯化。对纯化后的Ad-miR29a进行滴度测定、感染性鉴定及PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×109 pfu/ml。PCR鉴定Ad-miR29a可扩增出pre-miR-29a特异片段,而对照Ad-LacZ不能扩增出pre-miR-29a特异片段。Ad-miR29a感染人胃癌SGC-7901细胞后,可明显提高miR-29a的表达丰度。结论成功包装了负载miR-29a的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究microRNAs在肿瘤发生发展中的作用,以及miR-29a在肿瘤治疗中的价值奠定了基础。