肾癌相关抗原G250致敏的树突状细胞瘤苗体外诱导特异性抗肾癌免疫

目的 探讨肾癌相关抗原G250致敏的树突状细胞(DC)瘤苗体外诱导自体T淋巴细胞特异性抗肾癌免疫效应.方法 自健康人外周血中提取单核细胞,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4刺激活化、经肾癌相关抗原G250致敏(同时设未致敏的DC为对照),用流式细胞仪检测DC细胞和T细胞表面分子的表达,MTT检测肾癌相关抗原G250致敏的DC刺激自体T淋巴细胞增殖效应,以及诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对不同靶细胞(肾癌细胞株786-0、肺癌细胞株A549)的杀伤活性.结果 两组细胞均高表达CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR,较低表达CD1a,两组无明显差异(P＞0.05).经G250蛋白致敏的DC激发自体T细胞增殖的能力明显强于未致敏组的DC,由其激活的CTL对786-0的杀伤率明显高于对照组(P＜0.05),而两组对A549细胞均无明显杀伤活性.结论 肾癌相关抗原G250致敏的DC瘤苗体外可有效的诱导特异性抗肾癌效应.     

抗原致敏IL-12基因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究

【目的】探讨肾癌细胞抗原致敏白介素-12（IL-12）基因修饰的树突状细胞（DC）体外诱导、激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫杀伤肾癌细胞的效能及相关免疫机制。【方法】采用重组逆转录病毒介导IL-12基因修饰人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DC；超声细胞破碎法提取肾癌细胞粗提抗原（Ag）致敏经IL-12转染的DC；ELISA法检测各组DCs和各组CTLs上清中IL-12、IFN-γ因子的分泌水平；流式细胞仪（FACS）分析各组DCs表面CD83、CD86、HLA-DR的表达；MTT法检测DC刺激同源T淋巴细胞增殖的能力及CTL免疫杀伤肾癌细胞的效能；统计学分析比较各组间的差异。【结果】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC高表达CD83和CD86分子分别为（65．9％±3．1％，92．8％±3．4％），分泌高水平IL-12（279．6±1．7）pg／mL及IFN-γ（892±31）pg／mL，刺激同源T淋巴细胞增殖明显，诱导激活的CTL上清中IFN-γ水平（1146±31）pg/mL显著高于对照组；CTL对肾癌细胞有强大的杀伤作用，显著高于各对照组。【结论】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC能有效地诱导CTL特异性抗肿瘤免疫应答。其机制可能与IL-12基因修饰和抗原致敏活化了DC抗原提呈第二信号，促进了DC高分泌IL-12因子，激活了T淋巴细胞致使CTL分泌IFN-γ的能力增强密切相关。     

抗原致敏IL-12基因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究

 【目的】探讨肾癌细胞抗原致敏白介素-12（IL-12）基因修饰的树突状细胞（DC）体外诱导、激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫杀伤肾癌细胞的效能及相关免疫机制。【方法】采用重组逆转录病毒介导IL-12基因修饰人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DC；超声细胞破碎法提取肾癌细胞粗提抗原（Ag）致敏经IL-12转染的DC；ELISA法检测各组DCs和各组CTLs上清中IL-12、IFN-γ因子的分泌水平；流式细胞仪（FACS）分析各组DCs表面CD83、CD86、HLA-DR的表达；MTT法检测DC刺激同源T淋巴细胞增殖的能力及CTL免疫杀伤肾癌细胞的效能；统计学分析比较各组间的差异。【结果】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC高表达CD83和CD86分子分别为（65．9％±3．1％，92．8％±3．4％），分泌高水平IL-12（279．6±1．7）pg／mL及IFN-γ（892±31）pg／mL，刺激同源T淋巴细胞增殖明显，诱导激活的CTL上清中IFN-γ水平（1146±31）pg/mL显著高于对照组；CTL对肾癌细胞有强大的杀伤作用，显著高于各对照组。【结论】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC能有效地诱导CTL特异性抗肿瘤免疫应答。其机制可能与IL-12基因修饰和抗原致敏活化了DC抗原提呈第二信号，促进了DC高分泌IL-12因子，激活了T淋巴细胞致使CTL分泌IFN-γ的能力增强密切相关。     

肺癌可溶性抗原致敏的DC诱导CTL特异性杀伤肺癌细胞的实验研究

目的 通过对负载人肺癌GLC-82细胞可溶性抗原的树突状细胞（DC）体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）对肺癌细胞的杀伤研究，为以DC为基础的肺癌免疫瘤苗的临床应用提供一定的实验依据。方法 通过用3MKCl提取法和弱酸洗脱法获得人肺腺癌细胞GLC-82的可溶性抗原多肽，用GLC-82细胞抗原多肽冲击致敏从人外周血单核细胞（PBMC）中用GM-CSF、IL-4和TNF—α体外诱导扩增并经鉴定的DC；利用负载GLC～82细胞抗原多肽的DC，刺激同种异体外周血T淋巴细胞活化增殖，诱导产生具有识别肺癌细胞抗原的特异性CTL；进一步探讨该CTL对GLC-82，肺癌CALU-6和人红白血病K562细胞的体外杀伤效应。结果 人PBMC体外经7d诱导出的DC，经光镜、电镜、免疫组化证实具有典型的树突状细胞特性；经GLC-82抗原致敏的DC诱导同种异体T淋巴细胞活化增殖产生CTL，诱导激活的CTL与靶细胞共育时镜下发现CTL靠近并聚集在肿瘤细胞周围，致使肿瘤细胞发生凋亡和坏死。结论肺癌可溶性蛋白抗原能活化致敏DC，无需明确肿瘤特异抗原，获取方法简便可行；联合应用GM—CSF、IL-4和TNF—α诱导人PBMC中的单核细胞，能诱导出功能较强的DC；致敏DC能强烈刺激初始型同种异体T淋巴细胞增殖产生CD8^＋表达增加的CTL;激活的CTL对肺癌靶细胞发挥高效而特异的细胞毒效应，对非肺组织瘤靶细胞也具有非特异性杀伤效应。     

携带不同 HBV抗原基因片段的重组腺相关病毒转染树突状细胞诱导CTL的效应研究

目的：了解携带不同HBV抗原基因片段的重组腺相关病毒（rAAV‐HBV‐S、C、E、X）转染慢性乙型肝炎患者来源的树突状细胞（DC）诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的效应。方法采用携带不同HBV抗原基因片段的rAAV‐HBV‐S、C、E、X转染慢性乙型肝炎患者外周血中分离出的单核细胞,并在GM‐CSF、IL‐4和TNF‐α作用下继续培养7 d获得成熟的DC。通过观察DC的状态和流式细胞仪（FACS）检测各段 HBV转染后DC分化抗原（CD）的表达,评价其成熟与功能。将同一个体的DC与T细胞混合培养制备CTL ,通过四甲基偶氮唑盐（MTS）细胞杀伤实验研究被激活的CTL对HBV感染的靶细胞HepG2．2．15特异性的细胞毒作用。结果不同 HBV 抗原基因 rAAV‐HBV‐S、C、E、X 转染DC后 CD14、CD80、CD83、CD86的表型表达中, CD80、CD83差异有统计学意义（P＜0．05）;rAAV／HBV‐X转染的DC其CD80表达最高,rAAV／HBV‐S转染的DC其CD83表达最高。转染不同 HBV 抗原基因片段 rAAV（S、C、E、X）的 DC 诱导的 CTL 对 MHC‐Ⅰ类抗原阳性且有 HBV 的靶细胞（HepG2．2．15）的特异性杀伤效率显著高于对无 HBV的靶细胞（HepG2）的非特异性杀伤效应（P＜0．01）,但不同rAAV‐HBV组间差异无统计学意义（P＞0．05）。结论 rAAV‐HBV‐S、C、E、X转染DC均可诱导CTL引起M HC‐Ⅰ依赖的特异性细胞毒效应。     

In vitro induction of specific anti-tumoral immunity against laryngeal carcinoma by using human interleukin-12 gene-transfected dendritic cells

摘要：【目的】探讨经白介素-12（IL-12）基因修饰体外诱导的树突状细胞（DC）后激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫杀伤喉癌细胞的效能。【方法】应用pAdEasy腺病毒表达载体系统构建重组IL-12腺病毒载体;体外诱导分化喉癌患者外周血单个核细胞来源的DC;用IL-12基因转染喉癌抗原致敏的DC,流式细胞仪分析DC表型的变化; ELASA法检测转染组DC分泌IL-12的水平及其刺激的T细胞分IFN-γ因子的水平; MTT法检测DC刺激的T淋巴细胞增殖反应及CTL特异性杀伤喉癌细胞的效能;统计学分析比较转染组与未转染组间的差异。【结果】成功构建IL-12重组腺病毒颗粒。经Ad-12转染的DC后能高表达成熟表面分子标志CD83,CD86,分别为 (60.2±1.8%), (88.9±2.1%)转染后DC疫苗的 IL-12的分泌水平、刺激同源T淋巴细胞增殖能力及其分泌IFN-γ的水平、诱导细胞毒T 淋巴细胞（CTL）对喉鳞癌细胞Hep-2的免疫杀伤能力明显高于未转染组（P<0.05）。【结论】经IL-12基因修饰的喉癌患者外周血单个核细胞来源的DC后其能促进DC成熟,提高其抗原提呈能力,有效的刺激T淋巴细胞增殖,诱导CTL特异性抗喉癌免疫应答。     

肾癌冻融抗原致敏树突状细胞介导的CTL对肾癌786-0细胞株的体外杀伤作用研究

目的：研究肾癌冻融抗原负载树突状细胞（DCs）诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肾癌786-0细胞株的体外杀伤效应;方法：利用人外周血体外经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、人白介素-4（rhIL-4）和肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导产生的DCs负载肾癌冻融裂解物后诱导产生特异性CTL,观察杀伤后肿瘤细胞的形态变化,MTT法测定细胞毒性试验,ELISA测定细胞因子的分泌。结果：（1）负载肾癌抗原的DCs能促进T细胞的增殖;（2）诱导产生的特异性CTL对肾癌细胞具有高杀伤率,显著高于非特异性T细胞（P〈0．05）;（3）肾癌冻融抗原能够上调DCs人白介素-12（rhIL-12）的分泌,提高抗肿瘤的作用。（4）杀伤后的肾癌细胞发生明显凋亡。结论：由肾癌冻融抗原致敏的DCs所诱导产生的抗原特异性CTL对肾癌786-0细胞株有明显的杀伤效应,提示DCs瘤苗具有为肾癌患者进行特异性过继免疫治疗的临床应用前景。     

肿瘤抗原冲击DC诱导淋巴细胞对小鼠胃肠癌的杀伤作用

目的：用胃肠癌冻融抗原冲击树突状细胞（DC）诱导荷瘤小鼠脾细胞，观察DC及细胞毒T细胞（CTL）的生物学功能及对胃肠癌靶细胞体外杀伤作用。方法：小鼠骨髓细胞经GM-CSF、IL-4诱导和胃肠癌细胞系 KATO3、CT26细胞冻融抗原（Ag）的冲击，诱生致敏的DC与活化脾淋巴细胞共培养，获得的CTL对相应靶细胞及对照黑色素瘤细胞进行体外杀伤。结果：制备的DC与CTL具有良好的生物学活性，胃肠癌 Ag冲击的DC诱导的CTL对相应靶细胞的杀伤率分别平均75.98%和86.75%，且效靶比显示量效关系；对无关靶细胞A375为10.57%和11.53%。结论：胃肠癌Ag冲击致敏的DC能诱导CTL产生特异性杀伤作用。     

负载LMP－1基因的树突状细胞诱导CTL对鼻咽癌细胞的杀伤效应

目的：探讨超声联合微泡造影剂能否增强绿色荧光蛋白（GFP）质粒pEGFP—C3－LMP－1转染树突状细胞（Dendriticcells,DC）,进而探讨转染LMP－1基因的DC诱导细胞毒性T淋巴细胞（cTL）对鼻咽癌（NPc）细胞株的体外杀伤作用。方法：体外培养的人DC分为四组：①单纯质粒组（A组）：加入质粒;②超声照射组（B组）：质粒＋超声辐照;③微泡造影剂组（c组）;质粒＋微泡造影剂;④超声＋微泡造影剂组（D组）：质粒＋微泡造影剂＋超声辐照。荧光显微镜观察GFP质粒在DC内的表达,流式细胞仪评价GFP质粒的转染效率。另将体外培养的DC分为两组用于检测DC表面袁型的表达及体外杀伤实验：①空白对照组,单纯培养的DC;②基因转染组,具体实验方法同上述D组。流式细胞仪检测DC表面分子表型的表达。DC和T细胞混合共培养获得的CTL为效应细胞,LMP－1表达阳性的NPC细胞株C666—1为靶细胞,按效靶比10：1的比例混合培养24h后,MTT法检测CTL对靶细胞的杀伤作用。结果：D组DC内有较多的绿色荧光表达,且转染效率最高（14．86±2．36）％,和其余各组均有显著性差异。LMP—1基因转染组DC表面标志CD80、CD83、cD86、CD40、HLA—DR的表达明显高于对照组。所诱导产生CTL对靶细胞有明显的杀伤作用,其杀伤效率为（41．72±3．53）％,明显高于空白对照组（7．62±2．36）％。结论：超声联合微泡造影剂可有效地介导GFP质粒转染DC。LMP－1基因转染组De诱导产生特异性的CTL对靶细胞有明显的杀伤作用。     

抗原致敏树突状细胞诱导CTL杀伤K562细胞体外实验研究

目的 研究体外负载K562细胞冻融抗原的树突状细胞（DC）诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的特异性杀伤作用。方法 联合应用细胞因子从外周血单个核细胞（PBMC）诱导培养出DC,在体外负载K562细胞冻融抗原。采用乳酸脱氢酶释放法,对比K562冻融抗原致敏DC组、未致敏DC组、淋巴细胞组、前列腺癌PC3冻融抗原致敏DC组分别激活的CTL对K562细胞的杀伤作用。结果 培养出具有典型特征的DC;在效靶比为10：1及20：1时。K562冻融抗原致敏DC组诱导的CTL对K562细胞的杀伤率分别为55．9％土22．0％、90．2％＋24．8％,均高于其他3组（p,0．05）。结论 K562细胞冻融抗原致敏DC可诱导激活CTL,具有明显杀伤K562细胞作用。并具有特异性。