离体培养神经干细胞中NMDA受体亚单位NR2B的表达

目的研究离体培养的大鼠神经干细胞（NSCs）中N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体亚单位NR2B的表达。方法从孕18～19天胎鼠海马中分离、培养、传代、鉴定NSCs，用免疫细胞化学、Western blot免疫印迹检测传代1次NSCs中NMDA受体亚单位NR2B的表达。结果源自孕18～19天胎鼠海马的NSCs，即可以表达NMDA受体亚单位NR2B。结论体外培养的NSCs能表达NMDA受体亚单位NR2B。     

NMDA受体亚单位NR1、NR2A和NR2B mRNA在成年大鼠海马的表达

目的 研究NMDA受体亚单位（NR1，NR2A和NR2B）mRNA在正常成年大鼠海马结构各区的表达及形态特点。方法 原位核酸分子杂交组织化学反应和图像处理与分析。结果 NR1，NR2A和NR2BmRNA在正常大鼠海马结构各区锥体细胞和颗粒细胞普遍表达，其中NR1mRNA的表达最强，NR2AmRNA的表达最弱，NR1mRNA在齿状回（DG）的表达水平明显强于CA1区和CA3区；NR2AmRNA在CA1区的表达水平则强于CA3区和DG；NR2BmRNA在海马各区的表达水平基本相同。结论 NR1，NR2A和NR2BmRNA在正常成年大鼠海马各区的表达模式不同，其中NR2AmRNA在海马CA1区以及NR1mRNA在DG高表达的分布特点可能与海马的学习，记忆等生理功能以及选择性易损现象有关。     

NMDA受体NR1亚单位与学习记忆

谷氨酸（Glu）是脊椎动物中枢神经系统中的主要兴奋性神经递质，其受体可分为代谢型和离子型两大类。离子型受体由三种组成：AMPA受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoepionate receptor，AMPAR），KA受体（kanieacid，KAR）及NMDA受体（N-methyl-D-Aspartic acid receptor，NMDAR）。其中NMDA受体被认为是突触可塑性及皮质和海马神经元长时程增强效应（Long-term potentiation，LTP）的主要调控者，     

Axin基因在脑肿瘤干细胞和神经干细胞中的表达及其多态性研究

目的观察Axin基因在脑肿瘤干细胞和神经干细胞中的表达及其多态性,为临床治疗脑肿瘤疾病提供实验依据。方法取大鼠神经干细胞及胶质瘤肿瘤干细胞,采用RT-PCR、基因测序等方法研究Axin基因在脑肿瘤干细胞和神经干细胞中的表达,对反应产物进行测序,观察两组之间的序列差异,并与Genebank Axin基因序列进行比较。结果相差显微镜下观察,呈悬浮状态的脑肿瘤干细胞聚集在一起的小球,随着培养时间的延长,小球数量增多,球体不断增大但并不均一,长出的新球体大小均一,数量多。分离原代的神经干细胞形成细胞球。脑肿瘤干细胞中Axin序列的表达与神经干细胞及Genebank中Axin比较差异性很大,其相似性为75．6%。结论Axin基因在神经干细胞中正常表达,而在脑肿瘤干细胞中表达过低,说明Axin在脑肿瘤细胞增殖中起着重要的抑制作用。     

NMDA受体NR2B亚单位特异性单克隆抗体的制备及人胚脑 …

目的：制备ＮＭＤＡ受体ＮＲ２Ｂ亚单位特异性单克隆抗体，对人胚脑皮层ＮＲ２Ｂ的表达作免疫印迹分析。方法：制备ＮＲ２ＢＣ末端９３４－１４５７氨基酸与ＧＳＴ的融合蛋白，并以此作为免疫的，经常规杂交瘤技术制备单克隆抗体。用该抗体对不同周的人胚脑皮层的ＮＲ２Ｂ蛋白作免疫印迹分析，结果：本研究制备的ＮＲ２Ｂ单克隆抗体能特异地识别１８０ｋＤａ的ＮＲ２Ｂ蛋白，并首次发现人胚脑皮层ＮＲ２Ｂ亚单位蛋白的表达。结论：成     

大鼠海马脑片长期培养中NMDA受体亚单位NR2A和NR2B的表达变化

目的 研究在长期培养大鼠海马脑片各区中N-甲基-D-门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体亚单位NR2A，NR2B表达的变化规律。方法 400μm厚大鼠海马脑片，体外培养1，2，3，4，5周，再作20μm厚冰冻切片，行NR2A，NR2B免疫组织化学反应和图像分析。结果 NR2A，NR2B在培养各周海马脑片各区锥体细胞和颗粒细胞体均有表达，NR2B还在CA1区锥体细胞顶树突明显着色。1周时，NR2A的表达较弱；4周时升至高峰，在CA3区，NR2B的表达1周时即达高峰；但在CA1区其表达至3周时始达高峰。结论 长期培养大鼠海马脑片各区中NR2A，NR2B的表达有时空变化，且二者的表达模式不同，提示此间NMDA受体的结构和功能可能也有改变。     

嗅球损伤对成年大鼠脑室下区神经干细胞增殖和NMDA受体亚单位2B表达的影响

目的 研究嗅球损伤对成年大鼠脑室下区（SVZ）神经干细胞增殖和NMDA受体亚单位2B表达的影响.方法 正常成年雌性SD大鼠60只,随机分成正常对照组、生理盐水组、嗅球损伤组,嗅球内局部注射N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）制作嗅球损伤模型,术后分3d、7d、14 d、28 d四个时间点取脑.行免疫组织化学染色观察神经干细胞（Nestin）、增殖细胞（Ki67）及NMDA受体亚单位NR2B阳性细胞数.结果 （1）各组大鼠SVZ均可见Nestin阳性细胞,嗅球损伤后7 d Nestin IOD值增加[（29601±1788）/0.01 mm2,P＜0.05],14 d达到高峰[（31400±3435）/0.01 mm2,P＜0.05],28 d后有所下降[（27600±3209）/0.01 mm2,P＜0.05].（2）各组大鼠SVZ均表达Ki67阳性细胞,嗅球损伤后7d、14 d和28 d SVZ Ki67阳性细胞数分别为[（28.60±2.41）/0.01 mm2]、[（34.00±2.55）/0.01 mm2]、[（30.40±1.14）/0.01 mm2],显著高于正常组和生理盐水组阳性细胞数（P＜0.05）.（3）各组大鼠SVZ均表达NR2B阳性细胞,嗅球损伤3d,NR2B阳性细胞数开始增加[（58.80±2.95）个/0.01 mm2,P＜0.05],14 d达到高峰[（68.40±4.04）个/0.01 mm2,P＜0.05],28 d阳性细胞数有所下降,但维持较高的水平[（62.20±3.56）个/0.01 mm2,P＜0.05].（4）嗅球损伤后不同时间点NR2B阳性细胞数与Ki67阳性细胞数有高度正相关性,r=0.968,P＜0.05.结论 （1）嗅球损伤能刺激成年大鼠SVZ神经干细胞的增殖;（2）嗅球损伤后NDMA受体亚单位NR2B表达增加,并且与神经干细胞的表达变化趋于一致,因此推断NR2B可能参与SVZ神经干细胞的增殖过程.     

缺氧对大鼠皮层、海马NMDA受体NR1亚单位磷酸化的影响

目的 观察缺氧模型大鼠皮层、海马NMDA受体NR1亚单位酪氨酸磷酸化的变化.方法 成年大鼠置于模拟海拔5 500 m高度的低压氧舱内,每天缺氧8 h,分别缺氧3、7、14 d和21 d.采用免疫组化、Western blot 免疫共沉淀方法检测皮层、海马NR1及其酪氨酸磷酸化的变化.结果 免疫组化显示缺氧皮层、海马NR1表达都明显高于对照组(P《0.01).Western blot检测进一步证明NR1的表达显著高于对照组(P《0.01),且随着缺氧时间的延长而增加.缺氧各组酪氨酸磷酸化水平亦显著高于对照组(P《0.01),缺氧14 d后酪氨酸磷酸化达到最高峰,而后开始下降,21 d时仍显著高于对照组(P《0.01).结论 高原缺氧条件下大鼠皮层、海马NMDA受体NR1亚单位表达及酪氨酸磷酸化水平显著增加,酪氨酸磷酸化的变化可能是影响NMDA受体功能的主要原因.     

NMDA受体亚单位NR1在长期培养大鼠海马脑片中的免疫活性变化

目的　研究NMDA受体亚单位NR1在长期培养大鼠海马脑片各区中免疫组织化学反应活性变化规律。方法　将新生 6～ 9天大鼠海马和齿状回切成 4 0 0 μm厚脑片 (即海马脑片 ) ,分别体外培养 1、2、3、4、5周时再作 2 0 μm厚冰冻切片 ,行NR1免疫组织化学反应和图像分析。 结果　NR1在培养各周海马脑片各区锥体细胞和颗粒细胞胞体的免疫反应均呈阳性 ,胞膜深染 ,胞质淡染。培养 1周时 ,其反应强度为CA3区 >CA1区 >齿状回(DG) ;之后则为CA1区 >CA3区 >DG ;3周时各区反应均达高峰。结论　NR1在长期培养大鼠海马脑片各区的免疫活性有时空差异 ,提示NMDA受体的结构和功能在长期海马脑片培养中可能发生变化     

NMDA对离体培养人海马神经干细胞凋亡的影响

目的研究N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）对离体培养的人胚胎海马神经干细胞（NSCs）凋亡的影响。方法从胎龄8～12周人胚脑中分离、传代培养并鉴定海马NSCs,取传代培养的海马NSCs随机分组：①正常组;②μmol／LNMDA组;③10μmol／LNMDA组;④30μmol／LNMDA组;⑤100μmol／LNMDA组。每组设4个复孔,分别在3、7、12天取各组细胞,用Hoechst33258进行荧光染色,计算海马NSCs的凋亡率。结果在3、7、12天时,各实验组的人胚胎海马NSCs凋亡率与正常组相比均无明显差异。结论-定条件下,早期离体培养人胚胎海马NSCs对浓度为100μmol／L及其以下的NMDA有较好的耐受性。     

RNA干扰介导ABCE1基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的ABCE1在人肺腺癌A549细胞增殖中的作用进行初步探讨。方法以人肺腺癌A549细胞系为研究对象,针对其ABCE1基因序列设计小干扰RNA片段,重组其短发夹状RNA（shRNA）表达载体,转染入细胞。用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）方法分别检测转染后ABCE1的mRNA和蛋白的表达水平,MTT法检测增殖能力。结果RT-PCR和Western blot显示shRNA对ABCE1基因和蛋白水平均有显著的下调作用。人肺腺癌A549细胞的生长速度减慢。结论下调ABCE1基因后,A549细胞的增殖能力得到了明显的抑制,有可能成为临床治疗A549的靶点之一。     

子宫肌瘤孕激素受体亚型表达的研究

目的　研究子宫肌瘤中孕激素受体亚型的表达 ,探讨孕激素受体亚型 (hPR)在子宫肌瘤发病中的作用。方法　运用Westernblot、RT -PCR方法和计算机图像分析、半定量技术测定子宫肌瘤及正常肌层中孕激素受体亚型在蛋白和mRNA水平的表达。结果　子宫肌瘤中hPRs的表达均明显高于周围正常肌层 (P <0 .0 5 ) ,肌瘤及正常肌层组织中hPR -A含量均高于hPR -B ;而在mRNA水平上则无显著性差异 (P >0 .0 5 )。本实验中同时检测到第 3种亚型hPR -C的表达 ,且肌瘤中hPR -C显著高于正常肌层 (P <0 .0 5 )。在增生期和分泌期之间 ,hPR及其亚型无论在蛋白水平还是在mRNA水平均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　①子宫肌瘤hPRs蛋白的表达均明显高于周围正常肌层 ,而在mRNA水平上却无显著性差异 ;hPR蛋白的活性可能受转录后调节。②子宫肌瘤中hPR -C表达显著高于正常肌层 ,hPR -C的局部高表达可增强hPR -A、hPR -B的转录激活作用 ,可能与肌瘤局部的增生活跃有关     

pE6/p53/GFP重组真核表达载体的构建及其对肺腺癌细胞周期的影响

目的构建放射诱导启动子序列所调控的wt-p53抑癌基因的真核表达载体pE6-p53／GFP,并研究其功能。方法全基因合成方法获得放射敏感性增强子E6;PCR法从pcDNA3．1（＋）／p53质粒中扩增p53 cDNA全长序列;双酶切IRES2-EGFP双顺反子表达载体,获得IRES2-EGFP报告基因片段,以pCI-neo为载体构建重组pE6／p53／GFP。重组体经双酶切、测序鉴定其正确性。采用脂质体法将重组质粒转染H1299（p53^-/-）细胞,G418筛选出稳定表达细胞株。RT-PCR分析基因整合;Western blot方法分析不同放射剂量后P53蛋白表达情况及持续时间;流式细胞技术分析E6对肺腺癌细胞周期的影响。结果正确构建pE6／p53／GFP重组质粒,并在被转染细胞核内检测到p53基因表达;4Gy照射12h后p53基因表达显著增强;放疗后转染组细胞发生显著G1期阻滞,克隆形成率下降。结论成功构建了放射反应元件E6控导的pE6／p53／GFP重组质粒。     

Construction and transfection of sense／antisense eukaryotic expression vectors for human cathepsin L gene

Objective: To obtain sense/antisense eukaryotic expression vectors for human cathepsin L gene, and study the biological effects on human osteosarcoma cell line MG-63 after transfection. Methods:Cathepsin L gene sense/antisense eukaryotic expression vectors were constructed with recombinant technology and transfected into the human osteosarcoma cell line MG-63. The expression of cathepsin L gene mRNA was examined with RT-PCR and the expression of cathepsin L was examined with Western blot. Results: The sense/antisense recombinant eukaryotic expression vectors for cathepsin L were successfully constructed and transfected into MG-63 cell. Conclusion: Antisense cathepsin L gene can significantly inhibit the expression of cathepsin L mRNA and protein.     

成年期甲减大鼠海马syntaxin-1表达及甲状腺素干预效应

目的 观察成年期甲状腺功能减退症(简称甲减)大鼠海马突触相关蛋白syntaxin-1表达及不同剂量甲状腺素干预后的恢复情况,探讨甲减脑损伤及替代治疗的可能分子机制.方法 通过腹腔注射丙基硫氧嘧啶建立成年期甲减大鼠模型(甲减组)共6周,第5周起每100 g体重腹腔注射给予左旋甲状腺素5 μg(常规剂量组)或20 μg(大...     

携带DNMT1-shRNA真核表达载体的构建及其对DNMT1表达的影响

目的构建携带针对DNA甲基转移酶1（DNMT1）mRNA的shRNA真核表达载体,检测重组质粒对DNMT1的沉默效应。方法以DNMT1mRNA序列为靶基因设计shRNA和阴性对照序列（HK）,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体7P-Gensil-1中,构建真核表达载体P-DNMT1-shRNA、P-HK。将重组质粒转染到大肠杆菌DH5口中,经筛选后对提取质粒测序鉴定。用构建的重组质粒转染T24细胞,进行RT-PCR和western blot检测,观察DNMT1mRNA和蛋白的变化。结果重组质粒经Sac Ⅰ酶切得到大小两个基因片段,与设计相同,经测序显示插入完全正确;DNMT1mRNA在24h、48h和72h的抑制率为28．44％、52．48％、70．91％;其蛋白在24h、48h和72h的抑制率为24．27％、57．79％、69．74％。结论成功构建了P-DNMT1-shRNA真核表达载体并能有效沉默T24细胞中DNMT1H水NA和蛋白的表达。     

新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨新生大鼠海马神经干细胞（NSC）的体外培养和诱导分化的条件和特点。方法分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生成因子和B27联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白（Nestin）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、β-Ⅲ型微管蛋白（Tuj-1）、波形蛋白（Vimentin）和Galc-C免疫荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定。结果体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞和5．溴脱氧尿苷（B枷）标记染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞（Tuj-1染色阳性细胞）、神经胶质细胞（Vimentin染色阳性细胞）和少突胶质细胞（Galc-C染色阳性细胞）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马NSC。     

髓鞘相关蛋白Nogo-A在纯化细胞核中的表达

目的：检测Nogo-A蛋白在纯化后的大鼠脊髓和小脑细胞核中的表达。方法：通过差速离心法得到大鼠脊髓和小脑样本的各亚细胞成分,利用非离子性去污剂NP-40纯化细胞核组分,采用Western blot方法检验核纯度并检测Nogo-A在各亚细胞成分中的表达。结果：纯化的细胞核抽提物中检测到特异的Nogo-A反应条带。结论：Nogo-A在纯化的细胞核中仍有明确表达,进一步证明了Nogo-A蛋白在中枢神经元的细胞核中有定位,并提示Nogo-A很可能以全长形式入核。     

Beclin 1在乳腺浸润性导管癌组织中的表达

目的：探讨Beclin 1在乳腺浸润性导管癌中的表达及临床意义。方法：免疫组织化学EnVision 法、RT-PCR法和Western blot 法检测50例乳腺浸润性导管癌及相应癌旁组织Beclin 1表达,分析其临床意义。结果：三种方法联合检测发现癌组织中Beclin 1阳性率低于癌旁组织,癌组织中Beclin 1相对表达量也低于癌旁组织;癌组织中Beclin 1表达与患者病理分级、临床分期和淋巴结转移情况有关（P＜0．05）,与患者年龄、绝经状况及乳头侵犯状况无关（P＞0．05）。结论：Beclin 1在乳腺浸润性导管癌中存在缺失表达或低表达,并与乳腺癌的发生、发展相关。