CTGF-siRNA对低氧诱导肺成纤维细胞胶原合成的影响

目的 观察针对结缔组织生长因子(CTGF)的小干扰RNA(siRNA)对低氧诱导的人肺成纤维细胞胶原合成的影响.方法 应用siRNA表达载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,将CTGF-siRNA表达质粒稳定转染人肺成纤维细胞MRC-5, 并将人肺成纤维细胞在低氧条件下(37 ℃, 5%CO2, 1%O2)培养1、2、4、6及12 h.采用定量PCR法测定CTGF及Ⅰ型胶原基因表达,并应用Western blot 法检测CTGF及Ⅰ型胶原蛋白表达变化.结果 低氧培养1 h后,人肺成纤维细胞即可刺激诱导CTGF mRNA表达,其升高水平可持续至6 h.而在CTGF-siRNA表达质粒稳定转染的MRC-5细胞内,低氧诱导的CTGF、Ⅰ型胶原基因及蛋白表达均降低(P<0.05).结论 针对CTGF的siRNA在体外可明显抑制低氧诱导的MRC-5肺成纤维细胞的胶原合成.     

SiRNA-Smad3沉默人瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad3对纤维连接蛋白及Ⅰ型胶原表达的影响

目的:探讨SiRNA-Smad3沉默人瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid fibroblast,KFB)内Smad3基因后,对KFB细胞内纤维连接蛋白及Ⅰ型胶原表达水平的影响.方法:分别用针对人Smad3 mRNA基因的特异性干扰片段和无关干扰片段转染体外原代培养的人KFB,经RT-PCR、Western blot、免疫组化、免疫荧光方法检测纤维连接蛋白(fibronectin)及Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ,Col Ⅰ)等KFB细胞外基质的合成和分泌情况.结果:75 nmol/L Smad3-siRNA特异性干扰片段转染KFB48h后KFB细胞内Col Ⅰ及FN合成和分泌较非特异性对照组及空白对照组明显降低.结论:Smad3-siRNA可特异性抑制KFB细胞中Smad3基因表达,并有效抑制体外培养的人原代KFB合成和分泌Col Ⅰ及纤维连接蛋白(Fibronectin,FN).     

RNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β1刺激结缔组织生长因子表达的影响

目的 体外构建结缔组织生长因子(CTGF)序列特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体,研究其对人瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGF表达基因和蛋白的影响. 方法 体外构建CTGF序列特异性siRNA质粒表达载体,Dosper脂质体转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞后.用10 ng/ml剂量的转化生长因子(TGF-β1)刺激细胞,采用RQ-PCR和Western blot观察CTGF mRNA和蛋白水平的变化.结果经TGF-β1刺激后,重组质粒组CTGF mRNA仅为止常表达的56.6%(P<0.05),CTGF蛋白仅为正常表达的基线水平(P<0.05). 结论 siRNA质粒表达载体可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGF基因表达和蛋白分泌,即使在TGF-β1刺激条件下,其分泌功能仍明显受抑.     

针对CTGF的shRNA抑制TGFβ1诱导人肾小管上皮细胞合成胶原

目的研究针对结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对转化生长因子β1(TGFβ1)诱导人肾小管上皮细胞株(human renal tubular epithelial cell,HKC)合成胶原的抑制作用.方法设计和构建带有U6启动子的能产生针对CTGF的shRNA的RNA干扰表达质粒,转染至受TGF β1刺激的HKC,以RT-pCR和Western blot检测HKC转染前后CTGF表达,以3H脯氨酸掺入法检测总胶原合成量.结果和仅受TGFβ1刺激组相比,转染了RNA干扰表达质粒的受TGFβ1刺激的HKC CTGFmRNA和蛋白表达明显减弱,总胶原合成量下降(P＜0.01).结论针对CTGF的短发夹RNA能明显抑制TGF β1诱导HKC合成胶原.     

RNA干扰抑制大鼠肌腱细胞中V型胶原基因的表达

目的：利用RNA干扰技术（RNAi）下调肌腱细胞中V型胶原蛋白的表达,拟为后续探讨V型胶原在损伤肌腱修复过程中的作用提供可行的试验方法。方法：分别设计干扰大鼠V型胶原[COL5（1）2（2）]两个亚基COL5 1和COL5 2表达的siRNA序列,转染大鼠肌腱细胞。通过实时荧光定量PCR和免疫荧光法检测V型胶原在基因和蛋白水平的表达。结果：转染特定的siRNA后,V型胶原两个亚基的基因表达被抑制约70%,蛋白表达也被明显抑制。结论：RNAi法可有效地抑制大鼠肌腱细胞中V型胶原的基因和蛋白水平表达。为进一步研究V型胶原在肌腱损伤修复过程中的作用提供了可行的试验方法。     

CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体并观察其介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人肝癌细胞CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响?方法:针对已经筛选确定的人CTGF基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Plk0.1-GFP-SP6载体连接产生shRNA 慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定?用脂质体转染法将质粒共转染293T 细胞,将包装产生的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,Real-time PCR?Western-blot检测CTGF mRNA和蛋白的表达?结果:PCR与DNA测序证实合成的含CTGF shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确?经RNA干扰后的靶细胞CTGF mRNA以及蛋白表达水平明显降低?结论:成功构建人CTGF基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染HepG2细胞可有效降低CTGF mRNA和蛋白的表达,为以CTGF基因为靶点的肝癌基因治疗研究奠定了基础?     

瘢痕疙瘩组织中胶原合成情况的研究

目的 探讨瘢痕疙瘩中胶原过度积累的形成原因。方法 用透射电镜观察瘢痕疙瘩的超微结构。用ABC法免疫组化检测瘢痕疙瘩中新合成的胶原。用地高辛标记的人Ⅰ型前胶原al(Ⅰ）cDNA探针与从瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中提取RNA进行斑点杂交。结果 在超微结构上,多数瘢痕疙瘩成纤维细胞拥有丰富的高度发达的粗面内质网。斑点杂交结果显示瘢痕疙瘩组织中Ⅰ型胶原mRNA水平升高。免疫组化染色显示瘢痕疙瘩中成纤维细胞有丰富的Ⅰ型前胶原表达。结论 在活跃增生的瘢痕疙瘩中,成纤维细胞胶原合成功能处于活化状态,胶原合成增加是瘢痕疙瘩中胶原过度积聚的重要原因。     

成纤维细胞Ⅰ型胶原基因shRNA载体的构建及干扰效果

目的 构建有效针对人成纤维细胞Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体,检测RNA干扰后对病理性瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响.方法 设计合成4对针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA靶序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4),将合成的shRNA片段通过重组技术克隆到真核表达载体pmU6,经酶切与测序验证表明成功构建针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体(Col-shRNA1、Col-shRNA2、Col-shRNA3、Col-shRNA4),并将该干扰载体与空载体分别通过脂质体转染人的病理性瘢痕成纤维细胞(依次为Col-shRNA1组、Col-shRNA2组、Col-shRNA3组、Col-shRNA4组、空载体转染组),另选未处理的成纤维细胞作为空白对照组,采用RT-PCR与羟脯氨酸含量测定试剂盒检测该干扰载体的干扰效应.结果 酶切与测序结果表明成功构建了针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体.Ⅰ型胶原基因mRNA的相对表达水平在空白对照组与空载体转染组之间差异无统计学意义(P＞0.05);而干扰组Col-shRNA(1～4)与空载体转染组之间比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).空白对照组与空载体转染组的羟脯氨酸含量及胶原合成差异无统计学意义,干扰组(Col-shRNA1、Col-shRNA2、Col-shRNA3、Col-shRNA4)的羟脯氨酸含量和胶原合成与空载体转染组比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).结论 成功构建了4组有效针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体,它们均能明显抑制病理性瘢痕成纤维细胞Ⅰ型胶原基因的表达与减少细胞胶原的合成,其中Col-shRNA1对成纤维细胞Ⅰ型胶原基因表达的干扰效果最强.     

HSP47 siRNA重组质粒对裸鼠瘢痕疙瘩模型的体内干预研究

目的 利用RNA干扰(RNAi)技术通过热休克蛋白47(HSP47) siRNA重组质粒和脂质体的混合液对裸鼠瘢痕疙瘩模型的体内干预,分析HSP47基因在瘢痕疙瘩生成中的意义.方法 构建裸鼠瘢痕疙瘩动物模型,第16天实验组(n=8)在瘢痕疙瘩内注射HSP47 siRNA重组质粒、脂质体混合液0.25 ml,对照组(n=8)裸鼠瘢痕疙瘩内注射PBS液0.25 ml.所有动物原笼饲养,7天回收标本,分别作mRNA水平、胶原蛋白水平检测及免疫组化染色.结果 实验组体内干预后,HSP47的基因表达水平均较对照组明显下降(P＜0.01),胶原的表达水平明显低于对照组(P＜0.01).结论 HSP47基因能促进瘢痕疙瘩生成,其可能成为抑制瘢痕疙瘩的新靶点.     

shRNA抑制Smad3基因的表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7表达的影响

目的 构建抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloidfibroblast,KFB)Smad3基因表达的shRNA真核表达载体.研究Smad3 shRNA对KFB Smad7表达的影响.方法 用前期实验筛选出的1对最有效siRNA重组构建Smad3 shRNA表达质粒.通过脂质体介导的方法,将Smad3 shRNA转染到KFB,用RT-PCR及Western blot的方法检测Smad3、Smad7在不同时间点(0～9 d)表达的变化.结果 ①RT-PCR和Western blot的结果证实Smad3 shRNA载体构建成功.②转染Smad3 shRNA后,随着时间的延长,KFB中Smad3的mRNA与蛋白表达都显著减低,到72 h作用最强.光密度分析与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).Smad7的mRNA与蛋白表达都明显升高(P＜0.05).结论 体外构建的shRNA-Smad3 RNAi真核表达载体能显著抑制KFB Smad3的表达.Smad3可能对Smad7起反向调节的作用.     

影响广地龙粗提液蚓激酶活力因素的研究

目的 以广地龙粗提液中的蚓激酶为研究对象,研究影响其酶活力的影响因素,并计算其酶学反应动力学常数.方法 将蚓激酶与酪蛋白溶液一起培养,通过检测溶液中反应得到的酪氨酸含量,计算蚓激酶的酶活力;分别研究溶液pH值,不同的金属离子、吐温-80、EDTA的浓度,及乙醇的体积分数等条件对蚓激酶酶活性的影响,用米氏方程拟合蚓激酶降解酪蛋白过程,计算动力学参数.结果 蚓激酶的活力受pH的影响明显,当pH7.0时酶活力最高;随着钙离子浓度的增加酶活力降低,Na+、Mg2+、Ba2+对酶的活力影响不大,K+、Fe2+对酶的活力有一定的促进作用;乙醇对蚓激酶的活力具有抑制作用,体积分数为60％时蚓激酶完全失活:EDTA会降低蚓激酶的活力:吐温-80能提高蚓激酶的活力:蚓激酶降解酪蛋白的活化能Ea=-19.4 kJ/mol.结论 研究结果可为蚓激酶的提取分离及制剂研究提供参考.     

铁缺乏症对人体影响的研究进展

铁是人体中最丰富的微量元素，目前的研究发现缺铁不仅对血液系统有影响，而且还使单胺氧化酶的合成减少引起认知障碍，影响胶原质的合成，使血管支架不稳定、骨骼密度和硬度下降；缺铁还会引起RhoA和活性一氧化氮表达的增加，引起线粒体功能异常、肌小节不规则形成，从而导致心脏的异常肥厚增大，铁缺乏引起呼吸链中含铁酶的含量和活性降低，使ATP的合成减少，导致大鼠耐力下降。铁的缺乏对人体的影响是巨大而多面的。     

氟尿嘧啶微球体外释药的影响因素

目的 探讨对以羧甲基壳聚糖为载体的氟尿嘧啶微球体外释药特性的影响因素。方法 超声作用下采用乳化交联法制备氟尿嘧啶羧甲基壳聚糖微球（Fu—CMCS-MS）；光镜观察微球的形态和粒径分布；恒温振荡透析法和紫外分光光度法测定Fu—CMCS-MS的药物释放，考察5种因素对微球体外释药的影响。结果 超声作用下制得Fu—CMCS-MS成球性良好，粒径分布均匀，微球76．4％在1～3μm，平均粒径1．6μm。微球体外释药受投药方式、投药量、交联剂、释放介质和超声作用的影响显著，前期释药速率快，遵守溶胀控制机制，缓释后期释药缓慢，遵守扩散控制机制。结论 超声作用下以戊二醛乳化交联所制Fu—CMCS-MS在体外具有缓释作用。     

西方关于安乐死法律地位争议的思考

从西方安乐死立法运动的历史看,尽管赞成和反对的理由各异,但从根本上来说,体现的是传统文化和现代文明的激烈冲突.随着社会的进步和科学技术的发展,传统文化将发生更新以适应现代文明的进步.这场争论将导致建立新的生命观,为安乐死立法扫清障碍.     

炔诺酮肟对家兔卵巢作用的形态学研究

家兔从妊娠第1天始,每天经口给予炔诺酮肟4mg/kg,连续3天,第9天处死。取卵巢作HE、ACP、ALP、SDH及3β-HSD染色,部分卵巢作超微结构观察。结果表明:炔诺酮肟呈明显的抗着床作用,卵巢黄体平坦,缩小。光镜观察,黄体细胞呈较明显的颗粒变性及空泡变性。组化染色,ACP活性增强(P<0.01)。3β-HSD活性减弱(P<0.01),ALP及SDH活性无明变化(P>0.05)。超微结构可见,黄体细胞胞质中滑面内质网明显减少,脂滴聚集,溶酶体数量增多,形状多样,脂质空泡化及类似髓鞘样结构等。提示由于药物抑制了卵巢3β-HSD活性,使卵巢激素生物合成受阻;此外,ACP活性增加,提示溶酶体通透性增加。     

海口市社区老年人健康管理效果评估

目的 评估海口市社区60岁及以上老年人群分类健康管理效果,为制定老年人健康管理策略和措施提供依据.方法 采用社区干预试验方法,于2015年6月至2016年7月选取海口市美兰区大致坡、三江两社区各1000名自愿参与的60岁及以上老年人作为干预组和对照组,在开展基线调查后对干预组进行分类管理,对照组不做干预.比较两组人群12个月前后健康知信行、健康状况相关指标与卫生利用23个测量指标变化值和高血压或糖尿病发生率.结果 干预组除口味偏咸和过去6个月上门诊次数外,健康知识整体知晓率、定期监测血压、定期监测血糖、吸烟、每天吃蔬菜水果、充足睡眠、经常参加锻炼、感到压力大、感到担心害怕、月平均医疗费用、就医首选社区医院、小病首选社区医院、血压、空腹血糖14个变量得到显著的改善,差异有统计学意义(P均<0.05),遵医嘱服用降压药、遵医嘱服用降糖药、饮酒、饮用豆浆牛奶、BMI和过去6个月住院次数和天数7个指标差异无统计学意义(P>0.05);对照组吸烟、饮酒、充足睡眠、血压、血糖5个指标差异无统计学意义(P>0.05),遵医嘱服用降压药、遵医嘱服用降糖药、定期监测血压、就医首选社区医院、小病首选社区医院5个指标第二次问卷情况优于第一次,其他13个指标第一次问卷情况优于第二次,差异均有统计学意义(P<0.05).干预组高血压或糖尿病发生率为3.4%,对照组为10.9%,差异具有统计学意义(P<0.001).结论 对社区老年人群实施分类健康干预管理,可有效降低高血压、糖尿病等慢性病发病风险,控制医疗保险费用支出.应制订相应管理办法加强非患病老年人健康管理.     

地塞米松对骨质疏松性骨内种植体的影响

目的　研究地塞米松对骨质疏松性兔骨内种植体骨整合的影响。方法　将 12只骨质疏松症兔随机分为 2组 ,每组 6只 ,另取同龄健康新西兰雌兔 6只作为健康对照组。在各兔胫骨内植入纯钛螺纹状种植体 ,对骨质疏松症组中的 1组予以地塞米松治疗。种植体植入 2周、4周和 8周后分别获取各组标本 2个 ,行组织学、影像学等检测 ,观察各组种植体的骨整合效果。结果　各组种植体的骨整合效果在植入 4周时有较大差异 ,由高到低依次为 :正常组 >地塞米松组 >骨质疏松症组 ,但 8周时差异不明显。结论　地塞米松对骨质疏松性骨内种植的骨整合有促进作用。     

苦参碱对大鼠原代培养皮质神经元GABAR蛋白表达的影响

目的观察苦参碱对大鼠原代培养皮质神经元γ-氨基丁酸受体（GABAR）蛋白表达的影响，探讨苦参碱抑制中枢的作用机制。方法对Wistar新生大鼠原代培养皮质神经元分别给予剂量为0．5、1．0、2．0mmol／L培养基的苦参碱进行药物干预，4h后用细胞免疫组化方法测定GABAR的蛋白表达。结果与阴性对照组相比，各给药组神经元GABAR蛋白表达均显著增加（P〈0．05）。结论苦参碱使GABAR蛋白表达增强。     

《内经》体质理论发微

就<内经>体质与疾病、体质与辨证论治的有关理论进行了探讨.(1)探讨体质与发病的关系,从体质的角度来研究疾病的发生、发展、转归与预后;(2)探讨体质与辨证的关系,"辨体"、"辨质"固然重要,但其最终目的是为了强化辨证;(3)探讨体质与调理治疗的关系,从理论与治疗方法上的创新两方面,展现体质与论治的紧密结合.