膜联蛋白V真核表达载体的构建

目的：构建人膜联蛋白V基因真核表达载体,探讨人膜联蛋白V的生理功能。方法：PCR方法扩增含EcoRI及BamHI酶切位点的膜联蛋白V基因序列,对真核表达载体pcDNA3．1(-)和膜联蛋白V基因扩增产物进行双酶切,用连接酶将二者连接并转化到大肠杆菌BL21,重组质粒经测序鉴定,称为pcDNA3．1(-)AxV。结果：酶切琼脂糖电泳分析pcDNA3．1(-)AxV中含有膜联蛋白V基因,序列分析表明与文献报道的序列完全一致。结论：成功地构建了人膜联蛋白V基因的真核表达载体,为研究其生理作用奠定了基础。     

Caveolin-1基因PEGFP—N1真核表达载体的构建及表达

目的：克隆caveolin-1（CAV1）基因开放阅读框的cDNA序列,构建PEGFP—N1／CAV1的真核表达载体。方法：设计并合成带酶切位点及保护碱基的引物,RT—PCR法扩增caveolin-1基因,PEGFP—N1载体及caveolin-1基因片段进行限制性双酶切,电泳后回收切开的PEGFP—N1及caveolin-1片段,经连接反应后构建PEGFP—N1／CAV1真核表达载体。结果：PEGFP—N1／CAV1重组质粒经PCR电泳结果显示,得到一条在555bp的片段;重组质粒经限制性内酶切双酶切电泳结果证实,可释放一条在555bp的片段和4．8kbp的载体片段;重组质粒测序结果,经BLAST比对,100％符合;瞬时转染宫颈癌Hela细胞48h荧光显微镜及实时荧光定量PCR证实重组质粒在宫颈癌Hela中得到表达。结论：成功构建了同时携带有绿色荧光蛋白及G418筛选位点的PEGFP—N1／cAV1真核表达载体复合体。     

未知基因CGI-100的克隆及其真核表达载体的构建

目的:为探讨研究未知基因CGI-100的功能,克隆人CGI-100基因并构建其真核表达载体.方法:通过RT-PCR从人白血病K562细胞中克隆CGI-100基因全长编码区,将该cDNA片段亚克隆至载体pMD18-T SimpleT中,经测序鉴定后,用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切将目的cDNA片段定向克隆至相同处理的pIRES2-EGFP真核表达质粒中,然后经酶切、PCR鉴定和DNA序列测定三重鉴定方法对重组质粒进行鉴定.结果:经酶切、PCR及测序鉴定证实,CGI-100基因全长编码区cDNA被准确正向插入至pIRES2-EGFP质粒的酶切位点BamH Ⅰ和Pst Ⅰ之间,未发现碱基突变或移位.结论:成功地构建并鉴定了含CGI-100基因全长编码区的真核表达质粒,为以后研究该基因的功能奠定了基础.     

VR1012-TCRγV1真核表达载体的构建

目的：构建含TCRγV1基因的重组表达载体。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA克隆人VR1012质粒;转化感受态细菌E．Coli DH5α,以通用引物PCR扩增筛选阳性克隆．并双酶切鉴定;小量提取质粒进行测序。结果：测序结果证实重组载体叶1的外源片段序列与GenBank中TCRγV1序列完全相符。结论：成功构建了含TCRγV1基因的重组表达载体。     

人MCHR1真核表达载体的构建

目的 构建人MCHR1真核表达载体.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切和测序鉴定.结果 酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体构建成功.结论 pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础.     

新型基因佐剂SPreS2真核表达载体的构建及其瞬时表达

目的 构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2作为基因佐剂,用以增强或调节弓形虫DNA疫苗的体液及细胞免疫效果。方法 采用重叠延伸PCR技术,扩增乙肝病毒表面抗原S和PreS2基因,引入编码GSGSGS柔性多肽序列作为接头拼接S和PreS2基因,构建重组克隆载体pMD18T-SPreS2和重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,分别进行PCR、酶切和测序鉴定;脂质体法将重组载体pVAX1 SPreS2转染人成纤维细胞,建立体外真核细胞瞬时表达系统,SDS-PAGE和Western blot检测重组载体转染HFF细胞瞬时表达状况及其表达产物的免疫活性。结果 PCR、酶切、测序结果表明,重组克隆载体pMD18T SPreS2和重组真核表达载体pVAX1 SPreS2正确构建,融合基因SPreS2在真核细胞中可以瞬时表达,其表达产物具有一定的免疫活性。结论 成功构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,为增强或调节弓形虫DNA疫苗免疫效果提供一种新型基因佐剂。     

pcDNA3/TCRγV1真核表达载体的构建及表达

目的：构建含TCRγV1基因的真核表达质粒并检测其存小鼠骨骼肌中的表达。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取RNA,用RT-PCR法扩增含BamH Ⅰ与Hind Ⅲ酶切位点的TCRγV1基因序列,将TCRγV1基因PCR产物插入pcDNA3后转化到大肠杆菌DH5α,阳性克隆酶切鉴定后测序分析。大量提取质粒,股四头肌注射法免疫小鼠,RT—PCR法检测小鼠肌肉巾TCRγV1 mRNA的表达。结果与结论：pcDNA3／TCRγV1重组质粒构建成功,并能在小鼠骨骼肌中表达。     

CRMP-1 真核表达载体的构建

 目的构建人坍塌反应调节蛋白1（CRMP-1）CRMP-1基因表达载体,以研究CRMP-1 蛋白在目的细胞中的生物学功能。方法
从购买的人胚肾细胞株293T 中提取总RNA,经过RT-PCR 方法扩增含人CRMP-1基因的全长cDNA,将CRMP-1基因开放阅
读框（ORF）cDNA 序列,克隆到真核表达载体p3x-FLAG-myc-CMV-24 中,构建真核表达质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24。
以酶切和CRMP-1基因序列测定方法鉴定重组质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24 的正确性。结果酶切鉴定和CRMP-1基因序列测定均证实
重组质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24 构建正确。结论成功构建人CRMP-1基因真核表达载体。     

survivin启动子的真核表达载体构建

目的构建以survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达的真核表达载体pEGFP-C1/Surv。方法用PCR扩增survivin启动子,构建其真核表达载体并检测survivin启动子的活性。结果PCR成功扩增出survivin启动子,其真核表达载体构建成功。结论survivin启动子能驱动EGFP的表达,证明其具有活性。     

FTH1真核表达载体的构建与鉴定

目的构建携带人铁蛋白重链多肽1（FTH1）基因的真核表达载体pCMV－Myc-FTH1,为研究FXR1P与FTH1体内相互作用奠定基础。方法以人胎脑cDNA文库为模板进行聚合酶链反应（PCR）特异扩增FrH1基因片段,将扩增片段经EcoRI和XhoI双酶切后克隆到同样经EcoRI和XhoI双酶切的pCMV－Myc载体,酶切鉴定阳性克隆并进一步测序鉴定。结果成功构建了pCMV－Myc—FTH1重组真核表达载体。结论pCMV－Myc—FFH1重组真核表达载体的构建为进一步在细胞内鉴定FXR1P与VrH1相互作用奠定了基础。对研究FXR1在脆性x综合征中的作用机理提供了依据。     

Limk1不同突变体HA融合表达载体构建及在细胞内定位

目的：构建LIM激酶（Limk）1不同突变体的HA融合表达载体,并在真核细胞中表达,观察这些突变体在细胞内定位.方法：利用聚合酶链式反应（PCR）扩增Limk1全长序列,构建HA-Limk1真核表达质粒;利用定点突变策略对HA-Limk1进行核定位信号（NLS）缺失突变,命名为Limk1-NLS（del）;用合成两条互补序列退火获得目标片段插入载体的策略构建Limk1-NLS;将2表达质粒转染HepG2细胞,细胞免疫荧光方法以及核质分离后用western-blot检测其在细胞中定位.结果：经测序鉴定Limk1及其不同突变体序列正确,在HepG2细胞中高表达;其中HA-Limk1在细胞质、细胞核均有表达,Limk1-NLS （del）主要定位于细胞质,Limk1-NLS主要定位于细胞核.结论：成功构建了Limk1全长及不同突变体的HA融合表达载体,初步明确突变体在细胞内的定位.     

IL-18-PE38融合基因真核表达载体的构建及其在软骨细胞中的表达

目的 构建含有白细胞介素-18(IL-18)及毒素融合基因的真核表达载体，并研究其在软骨细胞中的表达情况。方法通过分子克隆技术．将IL-18-PE38融合基因插入真核表达载体PsecTag2B中，构建真核表达载体PsecTag2B-IL-18-PE38，经EcoR Ⅰ单酶切及PCR鉴定。脂质体法将其转入原代软骨细胞，通过荧光免疫细胞化学法鉴定其瞬时表达。结果 经EfoR Ⅰ单酶切及PCR鉴定证实IL-18-PE38融合基因成功克隆入真核表达载体PsecTag2B中。荧光免疫细胞化学法荧光显微镜照片证实此重组基因可在软骨细胞膜及细胞浆中表达。结论 证实了IL-18-PE38融合基因可在软骨细胞中表达，为进一步研究其对类风湿关节炎的治疗奠定了基础。     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的构建人PCK1基因的真核表达载体。方法以人内脏脂肪细胞cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致。重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体。     

分枝杆菌穿梭表达质粒的构建及外源基因在分枝杆菌中的稳定表达

卡介苗（ＢＣＧ）是全球应用最广泛的疫苗，也是一种能携带多种致病菌保护性抗原表达的疫苗载体。本研究以ｐＵＣ１９为骨架，分别克隆入ＢＣＧ分泌抗原８５－Ｂ的调节和信号肽序列、Ｎｅｏ基因序列（编码卡那霉素抗性）以及分枝杆菌质粒复制基因，构建成分枝杆菌－大肠杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－８０００。该重组质粒在分枝杆菌（含ＢＣＧ）、大肠杆菌两个系统中均能稳定复制，并能稳定表达卡那霉素抗性。本研究为把ＢＣＧ和其它分枝杆菌发展成为多价疫苗载体打下了基础。     

bcr/abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建bcr/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/ablmRNA和P210蛋白的影响。方法根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(smallhairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶启动子H1的真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT-PCR分析bcr/ablmRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117、pTER363分别使bcr/ablmRNA的相对水平下降52%、43%,使P210蛋白分别下降47%、40%。结论bcr/abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达。     

一种新型原核表达载体的构建及应用

目的 利用基因重组技术构建一种新型原核表达载体，使之表达带有His和GST标签的融合蛋白。方法 以质粒pGEX为模板，将PCR扩增出的GST基因插入到载体pQE-30中构建pQE-30-GST，经IPTG诱导GST蛋白表达并用Westernblot鉴定。分别将huNSEl88-354、huPrP23-91和huDoppe124-152基因插入pQE-30-GST，转化E-coliM15并诱导表达融合蛋白。采用NiSepharose4B和(或)Glutathione Sepharose 4B纯化融合蛋白，并用羟胺裂解。结果 重组表达载体pQE-30-GST可有效地表达各种His-GST融合蛋白，并可用两种方法纯化不同大小的融合蛋白；利用羟胺可将目的蛋白肽段与His-GST蛋白有效裂解。结论 新型原核表达载体pQE-30-GST可进行多种蛋白质的表达，表达的蛋白质可经两种方法纯化以提高蛋白质的纯度，融合蛋白可经羟胺裂解获得目的蛋白质单体。     

TLR4红色荧光蛋白融合载体的构建与表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的含Toll样受体4（Toll like receptor 4,TLR4）基因的红色荧光蛋白融合表达载体（pDsRed1-N1/TLR4）,并观察在细胞内的表达情况。方法应用PCR扩增鼠TLR4全基因,将其克隆至红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1中,重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后,转染到Hela细胞中,并利用Western blotting鉴定TLR4蛋白在细胞中的表达。结果重组pDsRed1-N1/TLR4融合蛋白在Hela细胞中持续高表达,经连续观察发现48h红色荧光表达量最高。结论成功构建带有红色荧光蛋白的TLR4基因表达载体,为研究TLR4在细胞内的相关生物学功能及与mircoRNA之间的关系提供了方便有力的工具。     

先天性长QT综合征KCNQ1基因真核表达载体的构建及表达

目的　在原核表达载体pSP6 4 KCNQ1的基础上 ,构建KCNQ1的真核表达载体。方法　先将pSP6 4 KC NQ1通过限制性酶切得到KCNQ1cDNA ,将后者克隆入 pEGFP N1中 ,构建中间过渡载体 pEGFP KCNQ1;将pEGFP KCNQ1和 pIRES EGFP分别用NheⅠ和EcoRⅠ双酶切 ,把KCNQ1cDNA克隆到 pIRES EGFP ,即构建了pIRES EGFP KCNQ1。然后利用Effectene转染试剂介导将pIRES EGFP KCNQ1转染HEK2 93细胞。 结果　在原核表达载体 pSP6 4 KCNQ1的基础上 ,获得了KCNQ1的真核表达载体 pIRES EGFP KCNQ1,并使其在HEK 2 93细胞中成功表达。结论　该法可成功构建、表达KCNQ1的真核表达载体 ,为进一步的功能研究奠定了基础。