人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因的克隆和表达

目的 从尖锐湿疣皮损标本中扩增出人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因．并进行表达、纯化和鉴定。方法用PCR法，从尖锐湿疣标本中扩增出HPV11E7蛋白基因，与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1／E7；重组质粒转入BL21大肠杆菌，经诱导表达融合蛋白GST-E7；该蛋白经剪刀酶切除GST，Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化，SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测鉴定。结果经酶切及序列分析鉴定，重组质粒pGEX-6P-1／E7成功构建．诱导后高表达GST-E7融合蛋白并得到纯化，蛋白质印迹证实表达蛋白为E7蛋白。结论获得高表达、高纯度的HPV11 E7蛋白，为该蛋白的功能及免疫学分析及尖锐湿疣疫苗研究打下了基础。     

病毒性皮肤病

20 0 2 0 735　人乳头瘤病毒 11型 E6基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定 /马军 (西安交大免疫病理研究室 )…∥西安医科大学学报 .- 2 0 0 1,2 2 (5 ) .- 472～ 4 74为构建人乳头瘤病毒 11型 (HPV11) DNA疫苗 ,从尖锐湿疣病变组织中克隆疫苗靶基因 E6。方法 :利用改良提取染色体外游离 DNA的方法制备模板DNA,采用聚合酶链反应 (PCR)技术进行基因克隆。结果 :从病变组织中扩增出了全长人乳头瘤病毒 11型E6基因完整开放阅读框架 ,并插入中介载体 T- eosy中构建重组质粒 ,转化 JM10 9扩增后经酶切、PCR及测序分析 ,证实克隆成功。提示该实验的成功为下一步制备 HPV11的治疗性疫苗奠定了基础。图 4参 7　(沈子伟 )2 0 0 2 0 736　人乳头瘤病毒 16、18型分子流行病学及新株筛查 /董学君 (浙江绍兴市医院中心实验室 )…∥中华传染病杂志 .- 2 0 0 1,19(5 ) .- 2 81～ 2 84用棉签擦拭尖锐湿疣患者病灶 ,女性同时取宫颈分泌物 ,然后采用 PCR方法扩增 HPV公共型 HPV16型和 HPV18型的...     

人乳头瘤病毒11型早期蛋白E6和E7基因的克隆及序列分析

目的：从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒11型(HPV11)早期蛋白E6、E7基因，并进行序列测定及编码氨基酸序列分析，为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法：用PCR法，从CA标本中扩增出HPV11E6、E7基因，与载体pGEX-6P-1连接成重组质粒pGEX-6P-1／E6、pGEX-6P-1／E7，酶切鉴定及双脱氧法测序观察其变异状况。结果：克隆出HPV 11早期蛋白E6、E7基因，成功构建重组质粒pGEX-6P-1／E6、pGEX-6P-1／E7。本研究克隆出的HPV11 E7基因与GenBank标准株序列完全相同，E6基因有两个位点的变化。结论：本研究克隆出的HPV11 E6、E7基因与标准株基本相同，这将为进一步研究E6、E7基因的表达、免疫活性及流行病学奠定基础。     

人乳头瘤病毒16通过DNA甲基化和组蛋白修饰路径的致癌机制研究进展

许多研究表明,人乳头瘤病相关肿瘤中存在DNA甲基化、组蛋白修饰等各种表观遗传学改变。在这些表观遗传学改变的研究中,提示E6和E7可能对人乳头瘤病毒相关肿瘤的DNA甲基化及组蛋白修饰存在直接或间接的影响。其中一个重要的机制可能是E6和E7直接与上述表观遗传学路径中涉及的相关蛋白酶相互作用。进一步明确E6、E7通过DNA甲基化和组蛋白修饰路径的致癌机制。     

Rb基因与HPV相关肿瘤

视网膜母细胞瘤基因与细胞周期调控密切相关，是一种重要的抑癌基因。视网膜母细胞瘤基因结构异常在人乳头瘤病毒相关肿瘤中少见。人乳头瘤病毒早期蛋白7与视网膜母细胞瘤蛋白结合，转录因子游离，导致视网膜母细胞瘤蛋白功能性失活。人乳头瘤病毒早期蛋白7降解视网膜母细胞瘤蛋白能力与恶性肿瘤发生密切相关，其机制有待进一步阐明。     

人乳头瘤病毒6b型E7基因的克隆和表达

目的　克隆人乳头瘤病毒 6b型E7(humanpapillomavirus 6bE7)基因 ,构建原核表达载体 ,并进行蛋白表达和纯化。方法　将HPV 6bE7基因经PCR扩增和亚克隆 ,与GST原核表达载体pGEX 4T 2重组 ,转化E .coliP2 3 92 菌表达蛋白 ,经GlutathioneSepharose 4B亲和层析纯化GST HPV 6bE7融合蛋白。结果　限制性酶切和DNA测序表明 ,HPV 6bE7DNA正确克隆于 pGEX 4T 2多克隆位点。经IPTG诱导表达的GST HPV 6bE7融合蛋白主要存在于可溶性上清。经亲和层析 ,每升诱导菌回收 8.4mg融合蛋白 ,10 %SDS PAGE分析融合蛋白表观分子量约 3 7kDa。结论　成功构建了HPV 6bE7基因原核表达载体 ,并大量表达和纯化了GST HPV 6bE7融合蛋白     

16型人乳头瘤病毒E6、E7基因延长人黑素细胞生命期的初步研究

16型人乳头瘤病毒(HPV16)E6/E7基因能有效地使人上皮细胞、角质形成细胞永生化,为探讨HPV16E6/E7对黑素细胞的影响,本研究用Lipofectamine转染法将HPV16E6/E7基因导入正常人黑素细胞,观察其对黑素细胞生命期的影响,并就其意义进行了初步探讨.     

β人乳头瘤病毒与皮肤鳞状细胞癌的相关性研究进展

人乳头瘤病毒根据侵犯部位的不同可分为黏膜型和皮肤型.皮肤型人乳头瘤病毒多为β人乳头瘤病毒,其与皮肤鳞状细胞癌的相关性尚有争议.近年来随着皮肤鳞状细胞癌发病率的增加,其发病机制及β人乳头瘤病毒与皮肤鳞状细胞癌的病因学关系引起了重视.流行病学资料显示,β人乳头瘤病毒与皮肤鳞状细胞癌相关,但是也有部分证据不支持.随着研究的深入,有研究指出,β人乳头瘤病毒可能作为协同致癌因子诱导皮肤鳞状细胞癌的产生,但不参与肿瘤的维持发展过程.     

HPV E6、E7基因在角朊细胞转化过程中的作用

人乳头瘤病毒16、18能诱导人角朊细胞永生化,还可以在活化ras或其它因素的协同下,或经长期传代后使永生化人角朊细胞发生转化,并维持转化后的人角朊细胞的恶性表型。其作用机理可能是人乳头瘤病毒E6、E7蛋白通过结合和失活p53、pRB和其它细胞因子,导致细胞周期紊乱,并干扰细胞的分化过程。人角朊细胞永生化和转化的发生首先需要E6、E7癌蛋白的高表达,此外,有丝分裂的缺陷和遗传学的异常等也是必需条件。     

HPV感染与皮肤癌

实验研究证实 ,皮肤癌组织中可检测到人乳头瘤病毒DNA ,特别是人乳头瘤病毒 16 /18型。人乳头瘤病毒 16型的基因产物E6、E7蛋白可与肿瘤抑制蛋白p5 3、PRb结合 ,使p5 3丧失对损伤DNA的修复功能 ,而且人乳头瘤病毒阳性的黑素瘤患者预后不佳。人乳头瘤病毒感染可加重皮肤癌的恶性度。综述了皮肤恶性肿瘤与人乳头瘤病毒感染的相关性     

HPV感染与皮肤癌

实验研究证实，皮肤癌组织中可检测到人乳头瘤病毒DNA，特别是人乳头瘤病毒16／18型，人乳头瘤病毒16型的基因产物E6，E7蛋白可与肿瘤抑制蛋白p53,PRb结合，使P53丧失对损伤DNA的修复功能，而且人乳头瘤病毒阳性的黑素瘤患者预后不佳，人乳头瘤病毒感染可加重皮肤癌的恶性度，综述了皮肤恶性肿瘤与人乳头瘤病毒感染的相关性。     

人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达

目的：构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法：利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段．测序后插入HSP70基因的5’端,构建HPV6E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX—E7-HSP70：在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化。结果：成功地构建了pGEX—E7-HSP70原核表达质粒：在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论：成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础。     

Rb基因与HPV相关肿瘤

视网膜母细胞瘤基因与细胞周期调控密切相关 ,是一种重要的抑癌基因。视网膜母细胞瘤基因结构异常在人乳头瘤病毒相关肿瘤中少见。人乳头瘤病毒早期蛋白 7与视网膜母细胞瘤蛋白结合 ,转录因子游离 ,导致视网膜母细胞瘤蛋白功能性失活。人乳头瘤病毒早期蛋白 7降解视网膜母细胞瘤蛋白能力与恶性肿瘤发生密切相关 ,其机制有待进一步阐明。     

人乳头瘤病毒感染与机体固有免疫反应

人乳头瘤病毒可引起多种疾病,如寻常疣、扁平疣、尖锐湿疣、鲍恩样丘疹病、宫颈癌等.人乳头瘤病毒可以有效地逃逸固有免疫识别,其可能原因包括嗜上皮性、非溶解性复制、高免疫原性的衣壳蛋白在免疫活跃的复层鳞状上皮基底层呈低水平表达等.人乳头瘤病毒的致癌性以及所致疾病的临床高发病率受到人们的广泛关注.机体对抗人乳头瘤病毒的固有免疫已成为研究热点.概述多种皮肤免疫细胞,如角质形成细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞、浆细胞样树突细胞、自然杀伤细胞和恒定型自然杀伤T细胞对人乳头瘤病毒固有免疫反应的相关研究.     

人乳头瘤病毒11型E6的原核表达

目的　构建、克隆人乳头瘤病毒 11型 (HPV11)E6蛋白基因 ,并进行表达、纯化和鉴定。方法　用PCR法 ,从尖锐湿疣 (CA)标本中扩增出HPV 11型E6蛋白基因 ,与 pET3 2a载体连接成重组表达质粒pET3 2a/E6;重组质粒转入BL2 1大肠杆菌 ,经诱导表达硫氧还蛋白E6融合蛋白 (Trx E6) ;该蛋白经 3SNTAResin纯化柱纯化 ,SDS PAGE和WesternBlotting检测鉴定。 结果　经酶切及序列分析鉴定 ,重组质粒 pET3 2a/E6成功构建 ,诱导后高表达Trx E6融合蛋白 ,WesternBlotting鉴定证实表达蛋白分子量为 3 60 0 0D的Trx E6融合蛋白。结论　获得高表达、高纯度的HPV11E6蛋白 ,为该蛋白的功能及免疫学分析及CA的疫苗研究打下了基础。     

人乳头瘤病毒致皮肤肿瘤机制的研究进展

人乳头瘤病毒 (HPV)是一种环状双链DNA病毒,具有噬上皮特性,分为高危型和低危型两类,分别能导致上皮细胞的良性增生与恶变,E5、E6、E7蛋白,L1/L2衣壳蛋白参与高危型HPV引起上皮细胞恶性肿瘤的机制。E6蛋白可抑制PDZ蛋白、Daxx蛋白等抑癌蛋白的作用,激活端粒酶导致细胞永生化,E7蛋白主要通过引起多条信号通路紊乱、介导免疫逃逸、影响多种原癌基因的mi-RNA转录诱导上皮细胞恶变。而E5蛋白、L1/L2衣壳蛋白主要作用是增强E6与E7蛋白的致癌性。本文对人乳头瘤病毒致皮肤肿瘤机制研究进展进行综述。     

人乳头瘤病毒6b型早期蛋白E6和E7基因的克隆及表达

目的:从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒6b型(HPV-6b)早期蛋白E6、E7基因,并进行序列分析比对及原核表达,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法:用PCR法,从CA标本中扩增HPV-6的E6、E7基因,构建pUCHPV-6E6、pUCHPV-6E7两个重组体,酶切鉴定及测序分析比对。经双酶切与表达载体pGEX-5X-1定向连接,构建pGEX-5X-l重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导GST融合蛋白表达及Westernblot鉴定。结果:克隆出HPV-6b早期蛋白E6、E7基因,成功构建pUCmHPV-6bE6、pUCmHPV-6bE7重组质粒,克隆获得HPV-6bE6、E7基因与GenBank标准株序列完全相同,经双酶切定向克隆,成功构建重组表达质粒pGEX-5X-lHPV-6bE6和pGEX-5X-lHPV-6bE7,转入BL21大肠杆菌,高效表达GST融合蛋白。结论:本研究克隆出的HPV-6bE6、E7基因与标准株相同,HPV-6bE6、E7GST融合蛋白获得高效表达,为HPV-6bE6、E7基因表达产物的纯化、体外活性以及E6、E7为靶位的基因疫苗研究奠定基础。     

HPV16 E6E7疫苗的构建及其免疫学活性实验研究

目的:评价从宫颈癌组织感染的人乳头瘤病毒中构建的HPV16 E6E7疫苗的免疫活性.方法:以宫颈癌组织DNA为模板,运用 PCR方法扩增HPV16 E6E7 DNA片段,将其插入真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA-E6E7基因疫苗株.酶切电泳验证重组质粒.将重组pcDNA-E6E7质粒肌注免疫BaLB/c小鼠后IFA法检测其体液免疫反应,ELISA法检测其细胞免疫功能.结果:pcDNA-E6E7疫苗经肌注方式免疫BaLB/c小鼠,可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应.结论:构建的pcDNA-E6E7基因疫苗株能诱导小鼠的免疫反应.     

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因腺病毒载体,并在真核细胞表达。方法用PCR法,扩增出HPV11E7基因,定向克隆至pENTR-TOPO载体形成重组质粒TOPO-E7。TOPO-E7与腺病毒载体pAD/CMV/V5-DESTTM重组反应,E7基因被重组到腺病毒载体上。该载体经PacI酶切,脂质体法转染人胚肾293A细胞,获得重组腺病毒载体pAD-E7。pAD-E7转染人HaCaT细胞,激光共聚焦显微镜分析E7蛋白表达情况。结果经酶切及序列分析鉴定,重组质粒TOPO-E7成功构建。重组子pAD-E7转染293A细胞后,获得滴度为1.4×107pfu/mL的重组腺病毒载体。该载体转染HaCaT细胞,48h后激光共聚焦显微镜下可见细胞内E7蛋白表达。结论重组腺病毒载体能有效介导HPV11E7基因在真核细胞的表达。     

HPV E7基因在细胞周期中的作用

人乳头瘤病毒(HPV)E7基因是目前公认的癌基因之一,其作用机制包括参与免疫逃逸、降低基因稳定性、DNA损伤、抑制凋亡和干扰细胞周期等,其中干扰细胞周期是E7重要的致细胞增殖机制。E7可以与视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)家族和袋状蛋白(E2F)家族、细胞周期相关蛋白等多种细胞周期调控因子相互作用,从而引起细胞周期的失控,导致上皮细胞的过度增殖,甚至恶变。