螺旋链霉菌U-1941中PKSⅡ型基因在淡青链霉菌tcmK变异株中的克隆(Ⅰ)

利用螺旋霉素产生菌螺旋链霉菌（Streptomyces spiramyceticus U-1941）中发现的PKSⅡ型基因，经测序和同源性比较证明在4174bp片段中含有PKSⅡ型KS（KSα）基因，该基因（pCG4-K，aspA）由1229bp组成编码432个氨基酸，与产二素链霉菌AlpA和淡青链霉菌TcmK同源性分别为74．4％和69．7％。将含aspA基因的重组质粒pCG4在四并菌素（tetracenomycin C）产生菌（S．glaucescens GLA4—26）tcmK基因缺陷型变异株中进行克隆，TLC分析表明转化子的发酵产物比对照株多一个明显的黄色斑点，该物质经分离、提纯后分析确定为一个含苯式结构的小分子化合物AS-5。     

螺旋链霉菌U-1941中PKSII型基因在淡青链霉菌tcmK变株中克隆(Ⅱ)

将螺旋链霉菌产生菌中的PKSII型KS基因克隆至四并菌素产生菌淡青链霉菌tcmK变株。获得基因克隆转化子，经发酵培养后对转化子发酵产物进行了分离纯化。获得纯品（纯度99％）。经高分辨EI质谱、氢谱以及碳谱分析，确证其分子量为177，分子式C10H11NO2。命名为AS-5。化学名为1-羟基-4-（反式-乙酰胺基-乙烯基）苯。该产物在原株发酵液中不存在，初步抗菌活性检测未发现其具有抗菌活性，但小分子的特点有可能使其成为潜在的先导化合物。     

外源基因在链霉菌中的表达

链霉菌是一类好氧、丝状的革兰阳性菌,广泛存在于土壤中.在业已发现的7000多种抗生素中,有60%以上是由链霉菌产生的.此外,它还产生了一些重要的工业用酶,例如纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、木质素酶、木聚糖酶、淀粉酶、胰蛋白酶等.这些酶可以将一些无用的森林、农业废物转化为有用的石油、动物饲料或工业原料,并被应用于一些工业生产过程中(如造纸工业).所以,链霉菌是一个非常重要的工业微生物.链霉菌在其土壤生存环境中,必须大量地分泌各种胞外酶,以便将土壤中的多种有机物质分解成可以被自己吸收利用的小分子营养物质,以利于自己的生存.这说明链霉菌中存在着一种高效分泌蛋白质的机制.近年来,链霉菌作为基因工程的宿主菌已得到了广泛的研究,并建立了卓有成效的导入外源基因的方法.由于链霉菌具有很强的蛋白质分泌能力,它作为蛋白质分泌的宿主菌有着大肠杆菌无可比拟的优点,即可使蛋白质的分离纯化过程较为简化和经济,因此,它引起了人们的兴趣并对此进行了深入的研究.目前,已在与蛋白质的分泌有关的诸方面取得了一些可喜的研究进展.本文将从宿主载体系统、启动子、信号肽、密码便向、终止于、分泌机制及目前已成功地表达分泌的外源蛋白等几个方面加以描述.     

委内瑞拉链霉菌中氯霉素生物合成基因的克隆

目的克隆委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)ISP5230中的氯霉素生物合成基因。方法以pabAB基因片段为探针,通过菌落杂交技术从该菌的基因文库中钓取相关基因。结果得到一7.5kbBamHIBamHI DNA片段,突变株的互补实验表明,该7.5kb DNA片段使氯霉素生物合成阻断变株CML-4恢复了氯霉素的生物合成。从野生菌株的染色体上删除该7.5 kb DNA片段中的一段3.5 kbNcoINcoI DNA片段后,野生菌株丧失了氯霉素的生物合成能力。结论该7.5 kb DNA片段含有氯霉素生物合成所需的基因。     

透明颤菌血红蛋白基因在链霉菌中的克隆和表达

以质粒ｐＩＪ７０２和ｐＩＪ６９９为载体，构建了两个带有透明颤菌（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌａ）血红蛋白（ＶＨｂ）基因（Ｖｇｂ）的大肠杆菌－链霉菌穿梭质粒并转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１、变青链霉菌（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ６４及蒽环类抗生素阿柔比星（阿克拉菌素）产生菌——加利利链霉菌（Ｓ．ｇａｌｉｌａｅｕｓ）ＡＴＣＣ３１１３３，经ＣＯ结合差光谱法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳分析表明Ｖｇｂ在大肠杆菌和链霉菌中得到表达。通过改变培养条件研究溶氧对Ｖｇｂ表达的影响，结果表明在低溶氧的情况下，ＶＨｂ表达量增加。同时发现，在低氧浓度时，ＶＨｂ的表达有利于链霉菌菌体的生长，其菌体生长量高于同样条件下的对照菌株（Ｖｇｂ－）１７％～２９％。     

北里链霉菌(Streptomyces kitasatoensis 2488)启动子和柱晶白霉素抗性基因的克隆

用启动子探针质粒pIJ486作载体,变青链霉菌TK24作受体,克隆来自北里链霉菌SK2488的启动子和柱晶白霉素抗性基因,得到三个转化子其中转化子变青链霉菌TK24(pRL1)中重组质粒插入片段约为10kb,其外源启动活性和柱晶白霉素抗性较低;转化子变青链霉菌TK24(pRL2)中重组质粒插入片段较小,但具有高活性的外源启动子,并有较高的柱晶白霉素抗性;转化子变青链霉菌TK24(pRLX)中未分离得到重组质粒,但它同样具有区别于受体的对新霉素和柱晶白霉素的抗性,而且它在R_2YE平板上能抑制其它转化子生长,其发酵液经薄层层分析发现有不同于供体和受体的新斑点,发酵液经高压液相分析发现有一个吸收峰。但三个转化株发酵液均无抗菌活性,将重组质粒pRL1和pRL2再转化变青链霉菌TK24,抗性稳定。     

头状链霉菌中丝裂霉素C抗性基因mcrAB的克隆及其作用研究

丝裂霉素 C属于苯醌类抗肿瘤抗生素 ,在生物体内作为前药 ,经酶催化还原后可阻碍 DNA的复制。我们从头状链霉菌中克隆出丝裂霉素 C抗性基因 mcr AB,测序结果与另一丝裂霉素产生菌—淡紫灰链霉菌的 mcr AB基因序列进行了比较 ,结果表明此序列是高度保守的。同时还构建了带有 mcr AB基因的质粒载体 p YG2 0 6 ,将 p YG2 0 6用原生质体转化法导入变青链霉菌 TK6 4 ,并在此菌中表达 ,大大提高了该菌对丝裂霉素 C的抗性。进一步研究表明 :在有氧条件下 ,mcr AB基因表达的蛋白可抑制菌体对丝裂霉素 C的转化作用。     

在克拉维酸及头霉素C生物合成中的棒状链霉菌变株的分离与生化特性

由棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus)所产生的有效的β-内酰爱酶抑制剂克拉维酸的生物合成，曾经借助于把带标记的前体加至发酵中进行研究，表明β－内酰胺环的3个碳原子（C－5，C－6与C－7），（C3单元）是从丙三醇经由β-羟基丙酸中间体产生的，而克拉维酸的另外5个碳原子（C－2，C－3，C－8，C－9与C－10）（C5单元）则依次由源自精氨酸的鸟氨酸所产生。     

Cloning, expression and functional identification of a type III polyketide synthase gene from Huperzia serrata

A cDNA encoding novel type III polyketide synthase (PKS) was cloned and sequenced from young leaves of Chinese club moss Huperzia serrata (Thunb.) Trev. by RT-PCR using degenerated primers based on the conserved sequences of known CHSs, and named as H. serrata PKS2. The terminal sequences of cDNA were obtained by the 3'- and 5'-RACE method. The full-length cDNA of H. serrata PKS2 contained a 1212 bp open reading frame encoding a 46.4 kDa protein with 404 amino acids. The deduced amino acid sequence of H. serrata PKS2 showed 50%-66% identities to those of other chalcone synthase super family enzymes of plant origin. The recombinant H. serrata PKS2 was functionally expressed in Escherichia coli with an additional hexahistidine tag at the N-terminus and showed unusually versatile catalytic potency to produce various aromatic tetraketides, including chalcones, benzophenones, phloroglucinols, and acridones. In particular, the enzyme accepted bulky starter substrates N-methylanthraniloyl-CoA, and carried out three condensations with malonyl-CoA to produce 1, 3-dihydroxy-N-methylacridone. Interestingly, H. serrata PKS2 lacks most of the consensus active site sequences with acridone synthase from Ruta graveolens (Rutaceae).     

Discovery of angucyclinone polyketides from marine actinomycetes with a genomic DNA-based PCR assay targeting type II polyketide synthase

Angucyclinones are aromatic polyketides produced by type II polyketide synthases (PKS) and are mainly found in terrestrial actinomycetes. To discover more angucyclinones from marine actinomycetes, a genomic DNA-based PCR assay targeting type II polyketide synthases was performed. Among the 167 marine actinomycetes strains screened, twelve strains were identified as the “positive” strains possessing type II PKS-encoding genes based on the sequencing of PCR products. One of the 12 “positive” strains, Streptomyces sp. PKU-MA00218 was selected for the large-scale fermentation based on the HPLC and TLC analysis. Four angucyclinones, 6-deoxy-8-O-methylrabelomycin (1), 8-O-methylrabelomycin (2), 8-O-methyltetrangulol (3), C-ring cleavage product of angucyclinone C (4), were isolated and their structures were elucidated based on spectroscopic analyses. The isolation of angucyclinones 1–4 highlights the power of genome mining technologies based on biosynthetic knowledge in natural products discovery.     

Streptomyces sp.4353中3-氨基-5-羟基-苯甲酸（AHBA）合酶基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的 克隆Streptomyces sp.4353中的3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)合酶基因,并将其在大肠埃希菌中表达.方法参与AHBA生物合成的5个基因,即氨基奎尼酸脱水酶基因、氨基奎尼酸/莽草酸脱氢酶基因、AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因通常连锁,形成一个AHBA生物合成基因簇.本文通过分析、比较已知AHBA生物合成基因簇的基因组织结构特点和序列保守性,设计引物,以Streptomyces sp.4353的总DNA为模板,在已知737bp AHBA合酶基因部分序列的基础上,通过PCR扩增其上、下游DNA序列,克隆至pMD18-T载体上,测序、拼接并进行生物信息学分析.以pET24a(+)为表达载体,对克隆得到的AHBA合酶基因在大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL中进行表达和SDS-PAGE检测.结果从Streptomyces sp.4353中得到了一段2872bp大小的DNA片段(NCBI GenBank接受号EU734184),其中含有AHBA生物合成基因簇中的AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因(部分);AHBA合酶基因在大肠埃希菌中得到了成功表达,在SDS-PAGE上可见到清晰的、与预计大小(42.7ku)一致的蛋白表达特异条带.结论 Streptomyces sp.4353中的AHBA合酶基因的克隆以及在大肠埃希菌中的表达为进一步研究该基因的功能奠定了基础.本研究克隆得到的2872bp DNA片段还有可能用于AHBA的杂合/异源生物合成,以及安莎类抗生素的组合生物合成.     

Cloning and expression of the FR901379 acylase gene from Streptomyces sp. no. 6907

FR901379 acylase, an enzyme that catalyzes the hydrolysis of the palmitoyl moiety of the antifungal lipopeptide FR901379, was purified from the culture broth of Streptomyces sp. no. 6907 (FERM BP-5809), revealing the 80?kDa, two-subunit heterodimeric protein characteristic of the β-lactam acylase family. Using oligodeoxyribonucleotide primers constructed on the basis of the N-terminal amino acid sequence of each purified subunit, the gene was identified from a cosmid library of Streptomyces sp. no. 6907 DNA. The deduced 775 amino acid sequence corresponded to a single polypeptide chain containing two subunits, and it shared 41.7% identity with aculeacin A acylase from Actinoplanes utahensis NRRL12052. FR901379 acylase activity was found to be 250-fold higher in the recombinant Streptomyces lividans 1326 carrying the cloned gene than in the original Streptomyces sp. no. 6907 strain.     

Diversity of polyketide synthases found in the Aspergillus and Streptomyces genomes

Natural products produced by biological organisms have played an important role in human health. The genomes of several Aspergillus species and several Streptomyces species have recently been sequenced. Interestingly the genomes revealed a large range of secondary metabolite genes, for many of which the products are currently unknown, suggesting that there is a wealth of secondary metabolites yet to be discovered. This brief review will discuss the current knowledge in polyketides produced by the various different classes of polyketide synthases (PKSs) present in the Aspergillus and Streptomyces genomes.     

薏苡3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆和生物信息学分析

3-酮酯酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase,KCS)基因是调控长链脂肪酸生物合成过程中的关键基因,在薏苡的生长发育过程中起着重要的调控作用.本文以薏苡(Coixlacryma-jobiL.)作为实验材料,根据转录组测序数据,从薏苡的cDNA中克隆出KCS基因,并对其进行生物信息学分析.结果表...     

透明颤菌血红蛋白基因的克隆及其在林可链霉菌中的表达

目的通过将透明颤菌血红蛋白基因vgb克隆到林可链霉菌染色体黑色素生物合成基因m elC位点,使m elC基因被破坏失活,vgb基因实现表达同时提高林可霉素产量。方法构建大肠杆菌-链霉菌重组质粒pYHT04,通过接合转移实验将重叠延伸PCR得到的具有红霉素抗性基因启动子的透明颤菌血红蛋白基因,以双交换的方式整合进林可链霉菌黑色素生物合成基因m elC中。采用不同装瓶量摇瓶发酵,HPLC检测发酵液中林可霉素含量。结果重组菌株颜色变浅,CO结合差光谱显示在420 nm处有明显吸收峰,随着装瓶量的增加重组菌株发酵液中林可霉素效价与对照菌株相比降低幅度较小。结论重组菌株m elC基因失活不能继续合成黑色素,vgb基因得到表达并表现出生物学功能,限氧条件下重组菌株发酵液中林可霉素效价高于对照菌株,有希望应用于工业发酵生产。