载TK基因PEG-PEI Fe3O4纳米磁流体体外肿瘤细胞抑制的研究

目的:研究载TK基因PEG-PEI Fe3O4纳米磁流体体外肿瘤细胞抑制特性.方法:以RT-PCR方法鉴定其在各细胞系中mRNA水平上的表达状况.采用MTT法研究载TK基因纳米颗粒体外抑制肿瘤细胞的生长作用.结果:PEG-PEI Fe3O4纳米磁流体能有效的转染pAFP-TK进入AFP阳性的HepG2细胞,并在细胞内得以正常表达.MTT法显示,AFP阳性的细胞在转染pAFP-TK后对GCV的敏感性大大提高,细胞存活率明显下降.结论:PEG-PEI Fe3O4纳米磁流体能高效转染pAFP-TK质粒进入细胞,并在AFP阳性肝癌细胞中获得特异性表达,加用GCV后,还可高效杀伤AFP阳性肝癌细胞.     

AFP增强子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞杀伤的实验研究

目的探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷（HSV-TK/GCV）自杀基因系统体外靶向杀伤肝癌细胞效应。方法构建人AFP增强子驱动的pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,脂质体转染肝癌细胞,检测TK mRNA和蛋白表达,MTT法检测GCV对肝癌细胞的杀伤作用。结果成功构建pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,在AFP阳性HepG2细胞中检测到TK mRNA和蛋白表达,添加GCV可特异性地杀伤HepG2细胞,而AFP阴性的SMMC7721细胞生长不受影响。结论 AFP增强子驱动的TK/GCV自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞。     

AFP启动子驱动的yCD/TK双自杀基因靶向杀伤肝癌细胞的体内外研究

目的： 研究携带甲胎蛋白（AFP）启动子的酵母菌胞嘧啶脱氨酶/胸苷激酶（yCDglyTK）双自杀基因体内外靶向性杀伤肝癌细胞的效果和机制。方法: 构建携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因表达质粒。通过阳离子脂质体将携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因转染HepG2和SMMC7721细胞,用MTT法测定不同浓度氟胞嘧啶（5-FC）、更昔洛韦（GCV）及联合治疗的杀伤作用,用流式细胞仪检测细胞周期。建立裸鼠肝癌皮下种植瘤模型,观察自杀基因体内杀瘤效果以及细胞凋亡的情况。结果: 成功构建的携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因靶向性地在AFP阳性的HepG2细胞上表达,而AFP阴性的SMMC7721细胞无表达,GCV、5-FC及两者联合可有效抑制HepG2细胞生长,随药物浓度的增高而杀伤作用增强,药物间抑瘤效果比较是GCV＋5-FC＞5-FC＞GCV,而SMMC7721细胞的生长未受影响。体内实验可见GCV、5-FC及两药联合对转染后的HepG2细胞种植瘤有明显的抑制效果,并检测到明显的细胞凋亡,而对SMMC7721细胞种植瘤的生长无影响,种植瘤内极少凋亡细胞。结论: 携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因能有效地靶向性地杀伤AFP阳性的肝癌细胞,细胞凋亡可能是其杀伤的重要机制之一。     

新型自杀基因linamarase/linamarin系统对人肝癌细胞HepG2体外杀伤效应及其旁观者效应的初步观察

目的: 研究新型自杀基因亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙(lis/lin)统对人肝癌细胞HepG2的体外杀伤效应.方法: 应用分子克隆技术构建热带植物木薯的cDNA文库, 并从中扩增出lin基因克隆至pEGFP-N1载体, 构建质粒pEGFP-N1-lis.通过电穿孔法将其转染人肝癌细胞株HepG2, 同时进行G418筛选, 直至出现抗性克隆, 扩大培养, 命名为HepG2/lis, 通过荧光显微镜观察、 RT-PCR、 Western blot鉴定lis基因的表达; 采用MTT法观察不同浓度lin对已转染的HepG2的杀伤作用及旁观者效应.结果: RT-PCR和Western blot证明转染的lis基因能够在HepG2细胞中表达并产生融合蛋白lis-EGFP; 低浓度lin对转染了lis基因的HepG2细胞具有明显的细胞毒效应; 旁观者效应显示仅10%左右的HepG2/lis细胞与90%的HepG2细胞混合培养于lin浓度为500 mg/L的培养基时, 就可显示出明显的旁观者效应.结论: lis/lin自杀基因系统在lin浓度为500 mg/L时对人原发性肝癌细胞HepG2具有明显的杀伤作用和旁观者效应.     

低氧反应元件调控的腺病毒-胸苷激酶对肝癌细胞HepG2的体外杀伤作用

目的： 构建携带受低氧反应元件(HRE)调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的重组腺病毒载体, 探讨该重组腺病毒对体外培养的肝癌细胞HepG2的特异性杀伤活性。方法: 采用AdEasy system 构建携带受HRE调控TK基因表达的腺病毒Ad-HRE-TK, 体外感染肝癌细胞系HepG2后分别在正常和低氧条件下培养。分别采用反转录－聚合酶链式扩增（RT-PCR）及蛋白质印迹（Western blotting）技术检测TK mRNA及蛋白表达情况,并用不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理后以MTT法检测细胞的增殖情况。结果: RT-PCR及Western blotting结果显示,仅转染重组腺病毒Ad-HRE-TK并在低氧条件下培养的HepG2细胞特异性表达TK基因及蛋白。HepG2 细胞感染Ad-HRE-TK后,在低氧培养条件下对GCV 的敏感性明显增加, 在感染复数(MOI)为 100 并用 50 mg/L GCV 处理时, 则有 95% 以上HepG2 细胞被杀死。而正常氧浓度下培养组,未能观察到GCV的杀伤作用。结论:低氧条件下,HRE可特异性地促进HSV-TK 基因的表达,从而诱导GCV的毒性作用。     

P3启动子调控融合基因质粒构建及在肝癌细胞中表达(英文)

目的：构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因（IGF-Ⅱ）P3启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒，观察其在肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中的表达及其作用。方法：应用基因重组技术，构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动EGFP与tk融合表达穿梭质粒载体，脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中，48 h后荧光显微镜下观察荧光表达,RT-PCR法检测tk和EGFP mRNA表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的GCV对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果:酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功；转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光；RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达；GCV对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用。结论:成功构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用，为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定了基础。     

单纯疱疹病毒胸苷激素酶基因在骨肉瘤细胞中的表达和作用

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV－TK）及其底物丙氧乌苷（GCV）的基因治疗系统对骨肉瘤细胞株SAOS－2的杀伤作用。方法：用DOTAP将含有HSV－TK基因的真核表达质粒tgCMV-HyTK导骨肉瘤细胞株SAOS－2;提取阳性转染细胞（SAOS－2TK）的总RNA,用斑点杂交的方法检测HSV－TK基因的表达;用MTT比色法测定SAOS－2TK细胞对GCV的敏感性及“旁观者效应”。结果：SAOS－2TK细胞能产生稳定的TK基因的转录物;SAOS－2TK细胞在GCV的作用下呈现明显的生长抑制效应,且观察到强效的“旁观者效应”。结论：HSV－TK／GCV系统能够选择性杀死骨瘤细胞。     

ODDD乏氧靶向HSV1-TK/GCV系统对体外肝癌细胞的杀伤作用

目的:探讨pEGFP-TK-ODDD基因表达载体乏氧特异性杀伤肝癌细胞的可行性。方法:通过LipofectamineTM2000将重组基因质粒pEGFP-TK-ODDD在肝癌细胞株SMMC7721和HepG2中进行瞬时转染。流式细胞仪分析EGFP的表达强度分析质粒转染效率。MTT法检测GCV作用24小时后转染细胞在不同氧浓度下的生存率。结果:SMMC7721细胞和HepG2细胞质粒转染效率分别为33.23%和36.97%;MTT结果显示,GCV浓度为12.5 mg/L时,缺氧环境下转染pEGFP-TK-ODDD基因表达载体的SMMC7721细胞和HepG2细胞存活率,细胞的生存率分别为81.25%和76.55%,明显低于对正常氧环境中细胞生存率的92.12%和94.36%(P<0.05)。结论:ODDD可以特异的调控HSV1-TK/GCV系统对乏氧肝癌细胞的靶向杀伤作用。     

人着色性干皮病基因D对HepG2细胞Mdm2和Mdm4表达的影响

 目的：探讨人剪切修复基因着色性干皮病基因D（xeroderma pigmentosum D, XPD）对肝癌细胞鼠双微体2（murine double minute 2，Mdm2）和鼠双微体4（murine double minute 4，Mdm4）表达的影响。方法：用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染进入人肝癌细胞株HepG2，实验分为3组：（1）空白对照组；（2）pEGFP-N2组；（3）pEGFP-N2/XPD组。用MTT法观察细胞的增殖活力；用流式细胞术检测细胞周期和凋亡率；用RT-PCR和Western blotting检测XPD、Mdm2、Mdm4和P53表达量的变化。结果：MTT结果显示，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制了肝癌细胞的增殖活力；流式细胞术结果显示，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染引起了G 1期细胞增加，S期减少，凋亡率增加。RT-PCR和Western blotting检测发现，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高，同时使得Mdm2和Mdm4表达降低，P53表达增高。结论：XPD能下调肝癌细胞中Mdm2和Mdm4的表达，上调P53表达，并能抑制肝癌细胞增殖及诱导其凋亡。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷系统对人骨肉瘤细胞杀伤作用的研究

目的:观察单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)基因治疗系统对骨肉瘤细胞株OS732的杀伤作用并研究其作用机制。方法:构建含HyTK基因的逆转录病毒载体DORHyTK,用DOTAP将其转入骨肉瘤细胞株OS732;提取阳性转染细胞(OS732TK)的DNA和总RNA,分别用PCR和斑点杂交的方法检测转染的效果;用MTT比色法测定OS732TK对GCV的敏感性及旁观者效应;Hoeschst332258染色,电镜和流式细胞仪分析HSV-TK/GCV系统对OS732TK细胞杀伤作用的机制。结果:成功构建含HyTK基因的重组逆转录病毒载体DORHyTK。OS732TK细胞整合了TK基因并有稳定的转录产物。5mg/LGCV作用5d即可杀伤所有OS732TK细胞。旁观者效应在高、低两种细胞密度接种条件下均存在,且前者强于后者。Hoeschst332258染色及电镜均显示典型的细胞凋亡特征,但也有少量坏死细胞的存在。流式细胞仪分析的结果说明在GCV作用下,OS732TK细胞阻滞于细胞周期的G₀-G₁期。结论:HSV-TK/GCV基因治疗系统对骨肉瘤细胞株OS732有很强的杀伤作用,且存在明显旁观者效应。此系统导致了OS732细胞周期的紊乱,引起细胞的凋亡和坏死。HSV-TK/GCV基因治疗系统为骨肉瘤的治疗提供新的思路。