金葡菌主动外排蛋白QacAα-螺旋13氨基酸的功能研究

目的 评价金葡菌多药耐药主动外排蛋白QacAα-螺旋13位于细胞膜侧的氨基酸对于底物转运的重要性.方法 用半胱氨酸定点诱变的方法 突变E407,S408,M409,Y410,D411和L412,测序确定突变后,测定最低抑菌浓度(MIC)和进行运输试验比较突变前后细菌转运功能的变化.结果 MIC分析表明突变株FA07,Y410和D411耐药性显著降低,运输实验结果 与MIC结果 一致,提示这3株突变株失去对底物的转运能力.结论 QacA蛋白α-螺旋13上的3个氨基酸可能与底物的结合和转运功能密切相关.     

脑梗死患者血浆胆固醇酯转运蛋白水平及其基因两种主要突变的检测

检测脑梗死患和正常人的胆固醇酯转运蛋白（CETP）基因15外显子D442G突变和14内含子I14A突变的频率。方法 应用聚合酶链反应－限制性内切酶片段长度多态性分析（PCR－RFLP）的方法检测110例脑梗死患和100例健康人胆固醇酯转运蛋白基因D442G突变和I14A突变；用本室建立的酶联免疫测定法（ELISA）测定血浆CETP水平。结果 110例脑梗死患中发现4例D442G杂合子，1例114A杂合子，无纯合子，突变率分别为3．6％、0．9％；100例健康人中发现4例D442G杂合子，1例D442G纯合子，1例I14A杂合子，突变率分别为5％、1％，两组相比较突变频率的差异无统计学意义（P＞0．05）；而脑梗死组TC、CETP水平明显高于正常组（P＜0．05），TG、LDL－C、apoB水平与正常组相比差异性极其显（P＜0．005），HDL－C、apoAI水平则显低于正常组（P＜0．005）。结论 脑梗死患血脂和脂蛋白谱表现较强的动脉粥样硬化性，CETP水平明显升高；CETP基因突变频率与正常组比较无显差异。     

克隆人神经母细胞瘤细胞株鲀毒素抵抗型钠通道的序列分析

目的　为了弄清人神经母细胞瘤(NB 1)细胞上的毒素抵抗型(TTX R)电压依赖性钠通道的编码基因及分子特性。方法　使用逆转录聚合酶链反应方法,对NB 1细胞TTX R钠通道α亚单位进行克隆。结果　该克隆命名为hNbR1,其开放阅读框架(ORF)为2 0 16个氨基酸残基。序列分析显示,hNbR1与心肌Nav1.5 /SCN5A氨基酸相似性达99.1% ,并具有电压依赖性钠通道的结构特点。4个相似的跨膜结构域(DⅠ～DⅣ) ,其中包括6个推定的α螺旋跨膜片段(S1～S6 ) ,每个结构域的电压感受器跨膜片段(S4 )均有正电荷残基;在DⅠ的P 环存在的半胱氨酸残基(C373)提示该通道为TTX R钠通道。DⅠS3～S4一个位于第3号染色体的新的外显子(第6A外显子)编码了该通道α亚单位。另外,一个删除了DⅡ～DⅢ第18外显子的选择性剪切体(hNbR1 2 )被发现。结论Nav1.5 /SCN5A比以往所知具有更加广泛的分布,而且发现一个新的外显子在神经肿瘤组织中编码了这个TTX R钠通道的α亚单位。     

ABL激酶区突变的检测与伊马替尼耐药

目的研究慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者ABL酪氨酸激酶区突变及伊马替尼耐药。方法用巢式RT-PCR对35例CML患者骨髓液BCR-ABL mRNA内ABL激酶区序列进行逆转录、扩增,测序和同源性比较分析ABL激酶区突变,并分析其伊马替尼耐药。结果 35例患者检出突变16例,阳性率45.71%。CML慢性期、加速期、急变期患者突变率分别为47.83%(11/23)、50%(1/2)和40%(4/10),其差异无显著性(P=0.858);16例突变患者中,共检出26种点突变,包括Y253H、T315I、F317L、M351T、L387F、A380D、H396R、G398R、D455G、E459K和1例185 bp碱基缺失突变等。其中A269V、D274G、S286G、V299M、C305Y、R307W、G312R、I314V、L324Q、K356E、D381G、K403E、K419E、L471P、A474T和S485P突变暂未见文献报道,可能为新的突变。在这些新发现的突变中,D274G、S286G、C305Y和K356E等突变可能与伊马替尼(imatinib,IM)治疗抗性有关。结论约半数患者存在ABL激酶区突变,突变位点广泛,性质多样,既存在单一位点突变,也可多位点同时存在,突变的发生与年龄、性别无关,部分突变与伊马替尼耐药有关。ABL基因激酶区突变检测有助于酪氨酸激酶抑制剂疗效的评估、治疗方案的调整。     

ATP敏感性钾通道参与兔脊髓缺血预处理的保护作用

目的　探讨ATP敏感性钾通道是否参与兔脊髓缺血预处理的保护作用。方法　 2 7只♂新西兰大白兔随机分成3组 (n =9) :即缺血组 (IC组 )、缺血预处理组 (IPC组 )及格列本脲 (glibenclamide ,ATP敏感性钾通道阻断剂 ) +缺血预处理组 (G +I组 )。IC组夹闭兔腹主动脉肾下段 2 0min ,复制兔脊髓缺血模型 ;IPC组预先使脊髓缺血 6min ,3 0min后再次阻闭兔腹主动脉肾下段 2 0min ;G +I组在缺血预处理前 2 0min静脉给予格列本脲 2mg·kg- 1,其他处理同IPC组。再灌注后 8、12、2 4和 48h分别对动物神经功能评分 ;再灌注 48h后 ,处死动物取脊髓 (L5～ 7) ,制作标本行组织病理学观察。结果　IPC组神经功能评分各时间点均高于IC组及G +I组 (P <0 0 5) ;与IC组及G +I组相比 ,IPC组脊髓前角正常神经细胞数明显增多 (P <0 0 1) ;IC组与G +I组在各时间点的神经功能评分及脊髓前角正常神经细胞数差异都无显著性 (P >0 0 5)。结论　兔脊髓缺血预处理的保护作用与ATP敏感性钾通道密切相关。     

位点饱和突变揭示青霉素酰化酶αR145和αF146亚基在β-内酰胺类抗生素合成中的重要性Jager SAW等

大肠杆菌表达的重组青霉素酰化酶能催化青霉素和头孢菌素类的衍生母核加上一个乙酰基，工业上常利用这一催化反应来生产β-内酰胺类抗生素。通过分析青霉素酰化酶的晶体结构发现，当大的配基结合到活性中心时，αR145-αF146位点发生换位。经过定点饱和突变得到38个突变体，其中不少于33个突变体的催化效率有所提高。部分突变体在低底物浓度下的最高催化效率较对照提高了1．5倍，且催化过程中合成对水解反应的比例提高了5～15倍。在高底物浓度条件下，αR145G、αR145S、αR145L三个突变子较野生青霉素酰化酶的合成效率更高。     

α_1-肾上腺素受体结构改变影响其生物学活性及生理功能的研究进展

α_1-肾上腺素受体(α_1-ARs)属于G蛋白偶联受体,包含α_1A、α_1B、α_(1D)3种亚型。α_1-ARs结构改变可导致其生理功能的改变。该文总结了α_1-ARs羧基端截短、二聚化、别构效应和点突变的结构改变,导致其内吞、磷酸化、脱敏以及对激动剂的亲和力等生理功能的变化。     

蛋白激酶G在大鼠钙化血管中的作用

目的探讨钙化血管中蛋白激酶G（PKG Iα蛋白）的作用。方法采用华法令和维生素D3建立大鼠主动脉钙化模型。4周龄SD雄性大鼠36只，随机分为对照组、钙化组和环孢霉素A组，每组12只。VonKossa染色及电镜观察血管形态改变，应用免疫组化法测定PKGIa蛋白及CaNB1蛋白，比色法测定碱性磷酸酶活性。结果钙化组PKG Iα蛋白表达明显减少（P〈0．01）。结论PKG Iα可能参与血管钙化的调节过程。     

血管紧张素转换酶基因多态性与原发性高血压血栓前状态的关系

目的　探讨血管紧张素转换酶 (ACE)基因I/D多态性与原发性高血压 (EH)及高血压血栓前状态 (PTS)的关系。方法　PCR检测 6 1例原发性高血压病人和正常对照组 2 8例的ACE基因I/D多态性 ;发色底物法测t PA、PAI 1活性 ,酶联免疫吸附双抗夹心法 (ELISA)测vWF含量。结果　高血压组DD基因型频率显著高于对照组 (P <0 0 5 ) ,但D等位基因频率分布在高血压组和正常组之间差异无显著意义 (P >0 0 5 )。高血压组t PA活性降低 ,PAI 1活性、vWF含量升高 (P均 <0 0 0 1)。高血压组DD型t P活性明显低于ID、II型 (P <0 0 0 1) ,而ID、II型之间差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ,DD型PAI 1活性明显高于ID、II型(P <0 0 0 1) ,而ID、II型之间差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ,vWF在DD、ID、II型三者之间差异无显著意义 (P>0 0 5 )。结论　DD型是原发性高血压发病的危险因素。原发性高血压存在血栓前状态。t PA、PAI 1的变化与血管紧张素转换酶基因I/D多态性有关 ,DD基因型可引起血栓前状态。     

多巴胺D2受体三维结构预测及与激动剂配体相互作用的研究

以细菌视紫红质(bacteriorhodopsin)的三维晶体结构为模板,预测了多巴胺D2受体跨膜区的7个α螺旋肽段的三维结构。根据定点突变实验数据以及预测的受体三维结构,确定了激动剂配体结合腔由Asp86,Ser141,Ser144等12个氨基酸残基组成。为了校正和检验所得的模型,分别以一组刚性、一组柔性的激动剂与受体对接(DOCK),分析-logIC₅₀和结合能Eb相关性,较好的结果说明该模型是可靠的。     

携带突变型人IκBαDN cDNA重组嵌合腺病毒Ad5F35的制备与表达

目的 制备携带突变型人核转录因子κB抑制蛋白α(IκBα)cDNA的重组5型和35型嵌合腺病毒(Ad5F35),并分析其表达.方法 应用DNA重组技术,从含有突变型人IκBα(IκBαDN)cDNA的重组逆转录病毒载体pCLX-IκBαDN克隆IκBαDN cDNA到pDC316载体以构建pDC-IκBαDN并随即制备携带IκBαDN cDNA的重组嵌合腺病毒Ad5F35.转染HL-60细胞后,通过实时定量PCR分析IκBα的表达.结果 通过DNA重组技术,将IκBαDN cDNA成功克隆到pDC316载体.DNA序列测定显示,重组pDC-IκBαDN载体内携带有无其它突变并具有正确阅读框架的人IκBαDN cDNA.转染HL-60细胞48h后,HL-60细胞IκBα mRNA表达增加.结论 成功制备到含有人IκBαDN cDNA的重组嵌合腺病毒Ad5F35,并能够在HL-60细胞有效表达IκBα.     

多巴胺D2胺体三维结构预测及与激动剂配体相互作用的研究

以细菌视紫红质（bacteriorhodopsin）的三维晶体结构为模板，预测了多巴胺D2受体跨膜区的七个α螺旋肽段的三维结构。根据定点突变实验数据以及预测的受体三维结构，确定了激动剂配体结合胺由Asp86,Ser141,Ser144等十十个氨基酸残基组成。为了校正和检验所得的模型，分别以一组刚性、一组柔性的激动剂与受体对接（DOCK），分析－logIC50和结合能Eb相关性，较好的结果说明该模型是可靠的。     

基于结构的香农熵及其在金属β-内酰胺酶结构分析中的应用研究

目的:探讨金属β-内酰胺酶残基在结构上的变化程度。方法:对各亚类MBLs结构进行叠合,计算残基间RMSD值,根据RMSD值差异引入基于结构的香农熵,并将基于结构的香农熵映射到1DD6结构上。结果:结构上的变化主要集中在活性位点附近靠外的区域,而活性位点内部则相对变化较小。结论:在活性位点附近loop区残基结构在不同MBLs中变化较大,是决定各亚类MBLs水解活性和特异性的主要因素。这一发现对于指导计算机辅助MBLs抑制剂的设计有着重要的指导作用。     

氯胺酮对大鼠缺血/再灌注心肌NF-κB和肿瘤坏死因子的影响

为观察氯胺酮对缺血 /再灌注心肌 NF-κB和血清肿瘤坏死因子 (TNF-α)的影响 ,将健康 SD大鼠 2 4只随机分为心包打开假手术组 (A组 )、缺血 /再灌注对照 (I/ R)组 (B组 )、5 mg· kg- 1氯胺酮 (KTM) + I/ R组 (C组 )和 10 mg·kg- 1 KTM+ I/ R组 (D组 )。在缺血 3 0 min,再灌 12 0 min后 ,取心肌组织用 Western-blot法分别检测其中胞核 NF-κB含量。在再灌 3 0 min和 12 0 min两个时间点分别取颈静脉血清做 TNF-α的 ELISA检测。结果显示 ,B、C、D组胞核 NF-κB含量均高于 A组 ,升高程度呈下降趋势 (P<0 .0 1) ,且两个时间点血清 TNF-α浓度也高于 A组 ,升高程度也呈下降趋势 (P<0 .0 1或 P<0 .0 5 )     

CVLM咪唑啉-I和α_2-肾上腺素受体共同参与可乐定的降压效应

目的　探讨大鼠尾端延髓腹外侧区 (CVLM)咪唑啉 I受体 (I1R)和α2 肾上腺素受体 (α2 AR)在介导可乐定中枢降压机制中的作用。方法　在氨基甲酸乙酯麻醉SD大鼠中 ,观察CVLM内局部给予I1R和α2 AR阻断剂后对基础血压(BP)、心率 (HR)以及外周给予可乐定导致降压效应的变化。结果　双侧CVLM分别微量注射选择性α2 AR阻断剂育亨宾 (单侧剂量 5 0 0 pmol·L-1,10 0nl,n =8)或I1R和α2 AR混合性阻断剂idazoxan(单侧剂量 2nmol·L-1,10 0nl,n =10 )后不仅明显降低BP和HR(P <0 0 1) ,而且能明显减弱静脉给予可乐定 (5 μg·kg-1)导致的降压效应 (P <0 0 1) ,此外 ,idazoxan对可乐定降压效应的减弱作用高于育亨宾 (P <0 0 1)。结论　CVLM内I1R和α2 AR共同参与维持紧张性心血管活动和介导可乐定的降压效应     

丝氨酸331是蛋白激酶C诱导血栓素α受体磷酰化

目的：检测人类血栓素α受体（TPα）C端丝氨酸／苏氨酸残基的各种丙氨酸诱变体作为PKC底物的能力,以确定被PKC磷酰化和脱敏的特异的丝氨酸／苏氨酸残基。方法：为了易于鉴定被磷酰化的细胞内区段,使用甘胱甘肽S－转移酶（GST）－细胞内区段融合蛋白作纯作的PKC底物,然后突变磷酰化蛋白的cDNA,以找出TPα被PKC磷酰化的主要部位,并将有组氨酸尾野生型或诱变型血栓素受体α稳定地转移到人类胚胎肾（EK）293细胞,以研究该受体的磷酰化和脱敏。结果：仅C－端能充当纯化PKC底物。丝氨酸－331 （mP4)被显示强的磷酰化,丝氨酸－324（mP1)则轻微磷酰化,丝氨酸－329（mP3)则微弱磷酰化,而其它丝氨酸／苏氨酸残基没被发现磷酰化。佛波醇－12－肉豆蔻酸酯－13－乙酸盐（PMA）诱导表达野生型TPα的HEK 293细胞磷酰化。然而不能显示触发表达丝氨酸331丙氨酸诱变受体的HEK 293受体磷酰化。用PMA预处理表达野生型受体的HEK 293细胞能抑制I－BOP诱导Ca^2 释放。然而用PMA预处理表达诱变受体的细胞不能中止I－BOP抑制Ca^2 释放。结论：丝氨酸331是TPα磷酰化和脱敏的主要和关键部位。     

1-(2,6-二甲氧基)-2-(3,4-二甲基苯乙氨基)丙烷盐酸盐(DDPH)拮抗α1肾上腺素受体的特性

目的　研究DDPH对α1 肾上腺素受体 (α1 AR)及其亚型的拮抗作用。方法　放射配体结合实验和离体血管收缩功能实验。结果　DDPH对12 5I BE2 2 5 4与大鼠脑皮质和脾脏α1 AR结合呈竞争性拮抗作用。pKI 值在两者间无显著性差别 ,Hill系数均接近于 1 0。在分别稳定表达α1A,α1B或α1D AR的克隆HEK2 93细胞中 ,其拮抗的pKI 值α1A和α1D比α1B AR高约 2倍 ,Hill系数均接近于 1 0。并拮抗去甲肾上腺素 (NE)介导大鼠主动脉 ,肾动脉和脾脏收缩的 pA2 值 ,在三者间无显著差别 ,斜率接近 1 0。结论　DDPH对α1 AR有竞争性拮抗作用 ,但其作用对α1 AR亚型无选择性。     

KCNQ钾通道研究进展

KCNQ钾通道是钾通道超家族的一个重要分支,按其结构特性主要分为5大类:KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4、KCNQ5。它们不仅参与机体许多重要生理功能的调节,而且在一些疾病中还具有重要作用。KCNQ1是心肌I_(LS)电流的α亚单位,KCNQ1突变可导致长QT综合征(LQT综合征),KCNQ2/3、KCNQ3/5异源多聚体是M电流的分子基础,KCNQ2/3突变可诱发癫痫,KCNQ4编码的通道蛋白是外耳毛细胞I_(K.N)电流的分子基础,KCNQ4突变可导致先天性耳聋。     

上海郊区老年痴呆症病人α-雌激素受体及芳香烃受体基因多态性

目的：探索上海地区农民人群中α-雌激素受体基因(ER-α)及芳香烃受体基因(Ahr)不同基因形态和老年痴呆症高发风险的可能联系．方法：分别以PCR—RFLP和AS—PCR方法分析一组老年痴呆症患者(n=52)ER-α基因及Ahr基因的多态位点，同一地区的健康人群(n=125)为对照．结果：Alzheimer症病人ER-α基因两个位点突变形态频率显著高于对照人群(Pvu Ⅱ位点：P=0．023，OR=2．94，95％CI 1．13—7．71；Xba I位点：P=0．046，0R=2．28，95％ CI 1．003—5．17)．Ahr G1721A位点基因型频率在病人组和对照组间无显著差异．结论：ER-α基因多态性可能与Alzheimer症易感性个体差异有关，本工作不支持Ahr基因多态性与老年痴呆症高发风险间的可能关联．     

褪黑素对肝癌细胞系HepG2的增殖抑制作用及其与G蛋白-cAMP信号途径的关系

目的研究褪黑素(melatonin,MT)对肝癌细胞系HepG2细胞的增殖抑制作用以及其对G蛋白-cAMP通路的影响。方法采用MTT法检测MT对HepG2细胞生长的影响,放免法检测细胞内cAMP水平,Westernblot法检测抑制型G蛋白α1(Gαi1)、抑制型G蛋白α2(Gαi2)、抑制型G蛋白α3(Gαi3)、刺激型G蛋白(Gαs)表达水平。结果MTT检测结果表明,MT在10-8～10-5mol.L-1的浓度范围内,72h共培养后,可有效抑制HepG2细胞增殖,且呈一定的时间浓度依赖关系。为进一步研究MT细胞增殖抑制作用与G蛋白-cAMP信号通路的关系,检测浓度为10-5mol.L-1的MT作用HepG2细胞后0、15、30、45、60、90、120min后Gαi1、Gαi2、Gαi3和Gαs和细胞内cAMP水平变化,结果发现MT作用HepG2细胞30min后可明显下调Gαi1、Gαi2、Gαi3的表达水平,但对Gαs表达无明显影响,同时发现MT处理后cAMP水平有下降的趋势,但是没有统计学意义。结论MT呈时间浓度依赖性的抑制体外培养的HepG2细胞生长,其机制可能与影响G蛋白-cAMP信号通路有关。