HCV NS4A与钙离子信号调节亲环素配体相互作用位点的确定

目的 明确丙型肝炎病毒非结构蛋白4A(HCV NS4A)与钙离子信号调节亲环素配体(CAML)相互结合的具体位点.方法 构建CAML不同剪接体及缺失突变体的酵母表达载体,转化入酵母Y187菌株,分别与转化了HCV NS4A的酵母AH109菌株进行配合,在含X-α-gal的酵母四缺培养基上培养观察.结果 转化了CAML不同剪接体及CAML缺失突变体pGADT7/CAML-1-211,pGADT7/CAML-1-57的酵母Y187菌株与转化了HCV NS4A的酵母AH109菌株配合后在四缺培养基上均有菌落生长,并且菌落呈现蓝色.转化了CAML缺失突变体pGADT7/CAML-58-211,pGADT7/CAML-234-296的酵母Y187菌株与转化了HCV NS4A的酵母AH109菌株配合后在四缺培养基上未见菌落生长.结论 HCV NS4A与CAML的相互结合位点位于CAML的N-末端1～57位氨基酸残基,CAML不同剪接体与HCV NS4A均可以相互结合.     

酵母双杂交技术筛选p7TP2蛋白结合肝细胞蛋白的编码基因

目的 筛选HCV p7蛋白反式调节蛋白p7TP2的结合蛋白,探讨HCV的致病机制及新蛋白p7TP2的生物学功能.方法 应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的p7TP2基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化单倍体酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌氨苄青霉素-LB平板上选择并测序,结果在GenBank中进行生物信息学分析.然后将阳性文库质粒与诱饵质粒回交,以证实其相互作用.结果 筛选出与p7TP2结合的蛋白基因10个,其中包括金属硫蛋白2A、载脂蛋白H、蛋白C、果糖二磷酸醛缩酶B、配对免疫球蛋白样2型受体α、CTL1基因类胆碱运输蛋白等已知功能蛋白基因相互作用,回交试验已经证实其相互作用.结论 由本研究结果发现p7TP2蛋白可以结合一系列不同功能的肝细胞蛋白,作为一种新基因,对它的进一步作用机制的研究将为阐明HCV感染及慢性肝炎、肝纤维化和肝癌的病理机制提出新的思路.     

METH1在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的通过观察血管生成抑制因子METH1的cDNA片段在酵母双杂交中的表达及检测其对报告基因有无激活作用,为进一步明确METH1抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法采用酵母双杂交Gal4系统3,经PCR扩增子METH1的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因的激活作用。结果成功获得METH1的cDNA片段,该片段所表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性,且对报告基因无激活作用。结论血管生成抑制因子METH1蛋白活性区在酵母双杂交系统中的表达产物,可作为诱饵蛋白进行相互作用蛋白的筛选研究。     

人分泌的凋亡相关蛋白1基因酵母双杂交诱饵载体的构建及表达鉴定

目的构建人分泌的凋亡相关蛋白1(secreted apoptosis-related protein 1,SARP1)基因酵母双杂交诱饵载体,为鉴定SARP1基因相互作用蛋白、探讨SARP1基因在瘢痕组织中的生物学功能奠定基础。方法根据GenBank中SARP1的mRNA序列,设计分别带有NdeⅠ和SalⅠ酶切位点的上、下游引物,人工合成SARP1基因片段,扩增SARP1基因片段,构建含pGBKT7-SARP1基因的重组质粒,用NdeⅠ和SalⅠ进行双酶切、PCR,凝胶电泳及测序。用醋酸锂法将序列正确的重组质粒pGBKT7-SARP1(卡那霉素抗性筛选)转化入AH109酵母菌株,在缺陷型培养基上观察pGBKT7-SARP1在AH109中的表达情况。结果 SARP1基因扩增后的片段大小符合预期,并成功克隆入pGBKT7载体中;酶切后凝胶电泳及DNA测序显示pGBKT7-SARP1基因重组载体构建正确,对酵母菌株AH109无毒性,且不具自主激活报告基因的效应。结论成功构建了pGBKT7-SARP1基因酵母双杂交诱饵载体。     

雄激素受体相关蛋白267-α酵母双杂交诱饵重组质粒的构建及转化

目的 构建和转化雄激素受体相关蛋白267—α(ARA267—α)的酵母诱饵重组质粒，为通过酵母双杂交研究ARA267—α的功能奠定基础。方法 用PCR扩增ARA267—α全长cDNA中编码PWWP和PHD-SET蛋白结构域的两个基因片段；将基因片段与pGBKT7载体定向重组；用酶切和测序鉴定重组质粒；将核苷酸序列正确的重组质粒转化入AH109酵母菌株。结果 成功构建pGBKT7-PWWP和pGBKT7—PHDSET重组质粒。分别转化有2种重组质粒和pGBKT7空载体的3种AH109酵母都能在SD／-Trp／X—α—gal培养基中长成白色菌落，但都不能在SD／-HiS／-Trp／2．5mmol／L 3-AT／X—α—gal和SD／-Ade／-Trp／X—α—gal培养基中生长，在SD／-Trp液中培养16h后，A600均值分别为0．8、0．9、0．9。这表明重组质粒表达的融合蛋白没有激活HIS3、ADE2和MEL1酵母报告基因表达的活性，也没有酵母毒性作用。结论 构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的cDNA文库筛选。     

METH1在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的通过观察血管生成抑制因子METH1的cDNA片段在酵母双杂交中的表达及检测其对报告基因有无激活作用，为进一步明确METHI抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法采用酵母双杂交Ga14系统3，经PCR扩增子METH1的cDNA片段，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后。再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因的激活作用。结果成功获得METH1的cDNA片段，该片段所表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性，且对报告基因无激活作用。结论血管生成抑制因子METH1蛋白活性区在酵母双杂交系统中的表达产物。可作为诱饵蛋白进行相互作用蛋白的筛选研究。     

新基因AngRem104与Bardet-Biedl综合征2蛋白的相互作用

目的 筛选与新基因AngRem104相互作用的蛋白,并验证AngRem104和Bardet-Biedl综合征2(BBS2)蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用,为进一步研究AngRem104的生理功能奠定基础。方法构建AngRem104的酵母真核表达载体AngRem104-pGBKT7／c-myc,用以转化酵母菌AH109,并与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合,筛选与AngRem104相互作用的蛋白。从中挑选Bardet-Biedl综合征2蛋白进行免疫共沉淀,构建AngRem104-pcDNA3．1／V5-His和BBS2-pCMV／c-myc融合表达载体,共转染HEK293T细胞。分别用小鼠抗人c-mvc单克隆抗体和小鼠抗人V5-HRP抗体进行免疫沉淀和免疫印迹,以验证AngRem104和BBS2蛋白问的相互作用。结果以AngRem104为诱饵蛋白在人肾脏cDNA文库中共筛选到包括BBS2在内的7个与之存在相互作用的蛋白。免疫共沉淀结果显示,AngRem104-V5融合蛋白能够在c-myc抗体的免疫沉淀物中检测出来：在V5抗体的免疫沉淀物中也能检测到BBS2-c-myc融合蛋白。结论AngRem104和BBS2蛋白在哺乳动物细胞中存在某种相互作用,为新基因AngRem104功能探讨和Bardet-Biedl综合征发病机制的研究提供了有价值的线索。     

结直肠癌前哨淋巴结转移相关蛋白的蛋白组学研究

目的 筛选前哨淋巴结(SLN)中与结直肠癌早期转移相关的蛋白质.方法 术中取43名结直肠癌早期患者的SLN及对应的正常淋巴结(NLN).提取SLN和NLN两组总蛋白后行双向凝胶电泳和质谱法对差异蛋白进行筛选和鉴定.用蛋白质印迹法和免疫组织化学法对其中的转移相关蛋白行进一步研究.结果 两组间检测出40种差异表达的蛋白质,SLN中表达升高且与转移相关的蛋白分别为核不均一核糖核蛋白A1( hnRNP A1)、埃兹蛋白(Fzrin)、微管蛋白β-2C (tubulin β-2C)和膜联蛋白A1(Annexin A1).蛋白定量结果显示两组间4种蛋白表达差异有统计学意义(P＜0.05).结论 结直肠癌SLN与NLN蛋白表达存在差异.筛选出的4种转移相关蛋白可能成为结直肠癌早期淋巴转移的标志物.     

脓毒症骨骼肌蛋白降解与泛素-蛋白酶体途径

脓毒症是严重创伤、烧伤及大手术后患者常见的严重并发症 ,进一步发展可导致脓毒性休克和多器官功能障碍综合征 (ＭＯＤＳ)等 ,是临床危重病患者的主要死亡原因。严重脓毒症时的代谢具有“自噬性”和强制性的特点 ,因为这种强烈的促进体内蛋白分解 ,抑制糖和脂类利用的高代谢反应 ,可使机体在短期内迅速陷入营养不良。由于骨骼肌细胞占机体细胞总重的 4 0 % 50 % ,骨骼肌的高分解代谢除导致肌肉的消耗和乏力外 ,对机体的整体代谢水平产生深远的影响 ,因此对脓毒症时骨骼肌蛋白分解途径的研究近来备受关注。在分解代谢性疾病状态下 ,骨骼肌蛋…     

新生儿糖、脂代谢的研究进展

根据新生儿的特殊性,重点阐述了解新生儿糖、脂类、胆红素的代谢特点.     

大鼠Aggrecanse-1，2特异性shRNA慢病毒表达载体的构建及测序

目的：利用RNA干扰技术，以大鼠aggrecanse-1，2基因为靶基因，设计aggrecanse-1，2基因特异性的小干扰RNA（siRNA），构建其短发夹RNA（shRNA）重组慢病毒表达载体，并进行测序鉴定。方法：根据Tuschl原则设计并合成大鼠aggrecanse-1，2基因特异性的DNA寡核苷酸，连接到经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切线性化的pKCSHR-GFP质粒上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落、扩增后提取质粒，进行DNA测序鉴定。结果：将合成的8对大鼠aggrecanse-1，2基因特异性DNA寡核苷酸序列退火后，分别克隆到线性化的pKCSHR-GFP载体质粒上。在氨苄青霉素培养基条件下，筛选出相应的阳性菌落，经DNA测序鉴定确定为设计的序列。结论：成功构建了8对大鼠aggrecanse-1，2基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体，可进一步用于干扰aggrecanse-1，2基因的mRNA转录，从而为制备aggrecanse-1，2基因表达受抑制的大鼠软骨细胞奠定基础。     

人Smad4克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的：克隆人抑癌基因Homo sapiens SMAD family member 4（NM_005359 1659 bp）mRNA构建人Smad4的真核表达载体。方法：从膀胱癌患者膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到Smad4基因开放阅读框架eDNA序列,并将其定向克隆到真核表达载体pcDNA3．0,构建含目的基因的pCDNA3．0-Smad4重组质粒。结果：经基因序列测定、PCR和酶切分析,证实插入载体pCDNA3．0的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列。结论：重组质粒pCDNA3．0 Smad4构建成功,为该基因的蛋白表达及其相关功能研究奠定了基础。     

DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒转染对人膀胱癌细胞DNMTs表达的影响及其生物学效应

目的：探讨DNMT1、DNMT3b基因在膀胱癌发生发展中的作用。方法：①将DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒分别单独和共同转入人膀胱癌细胞系Nu87;②半定量RT—PCR和WesternBlot分别检测DNMT1和DNMT3b基因mRNA和蛋白水平的变化;③用MTT法观察各组细胞生长曲线,流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果：单独和共同转染DNMT1（或DNMT3b）mRNA、蛋白表达量明显下降,能影响BIU一87的生长曲线,使细胞增殖减慢,并使细胞周期阻滞于G1期,明显提高细胞调亡率;转染空质粒和单独转染DNMT3bsiRNA重组质粒对BIU-87细胞的生长和增殖无明显影响。结论：联合转染DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒,可同时下调DNMT1和DNMT3b在BIU87细胞中的表达,并能在体外抑制BIU-87细胞生长,促进细胞凋亡发生,其效果优于单独转染的重组质粒。单独转染DNMT3bsiRNA重组质粒对BIU-87细胞的生长和增殖无明显影响。     

应用酵母双杂交系统筛选小鼠PIAS2相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交技术,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选与PIAS2(protein inhibitor of activatedSTAT2,PIAS2)相互作用的未知蛋白。通过对其相互作用蛋白的筛选和研究,探讨PIAS2在精子发生中的作用机制,为临床男性不育症的治疗和诊断提供理论基础。方法:以pGBKT7-PIAS2为诱饵质粒,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选出与pGBKT7-PIAS2相互作用的阳性克隆,对验证后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,进一步采用直接酵母双杂交进行相互作用的验证。结果:经过筛选、测序、同源性分析及直接酵母双杂交验证,发现了与PIAS2相互作用的8个候选蛋白:Cyfip2、Psmb3、Nme1、nischarin、Nsun5、Ints10、Gnb2l1及Ndufaf3。结论:应用酵母双杂交系统,共筛选得到了8个不同的基因,其编码蛋白与PIAS2相互作用,可能与男性生殖调控相关。对上述蛋白与PIAS2的相互作用研究有助于揭示PIAS2的作用机制。     

腹腔镜胃旁路术后患者血浆胆汁酸的变化及其对糖脂代谢的影响

目的:探讨腹腔镜胃旁路术后血浆胆汁酸浓度的变化及其对血脂、血糖的影响。方法:选择41例行腹腔镜胃旁路术的2型糖尿病合并肥胖患者作为研究对象,对比分析术前及术后1年BMI、糖脂代谢参数、血浆胆汁酸浓度。结果:与术前相比,术后BMI、糖脂代谢参数、血浆胆汁酸浓度有显著改变。相关性分析得出,术后胆汁酸的变化与糖脂代谢参数的变化显著相关。结论:腹腔镜胃旁路术后患者糖脂代谢的改善可能与血浆胆汁酸浓度升高有关。     

人睾丸酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

目的:构建应用于酵母双杂交系统的人睾丸组织cDNA文库。方法:从正常人睾丸组织总RNA中纯化出mRNA,以SMARTШTM和CDSШ为引物,合成两端具有同源臂的双链cDNA,后者与线性质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母细胞Y187,两者在酵母细胞中同源重组成环形的cDNA文库质粒,收集在营养缺陷培养板上筛选出的所有克隆,即为人睾丸酵母双杂交cDNA文库。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人睾丸cDNA文库,共获得2×106个转化子,插入的双链cDNA片段的长度在0.3～4.0 kb之间。结论:利用ClontechSMART技术,成功构建了应用于酵母双杂交的人睾丸组织cDNA文库,为探讨人精子发生的分子机制奠定了基础。     

丙型肝炎病毒NS3-4A蛋白酶靶向抗病毒治疗及耐药研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）基因组的高度变异性使得HCV感染易呈慢性化,并极大地增加了肝硬化和肝癌的发病风险.效仿HIV蛋白酶抑制剂临床应用中取得的巨大成功,NS34A丝氨酸蛋白酶成为抗HCV感染小分子药物研发的重要靶点.此文围绕HCV NS3-4A蛋白酶抑制剂研发的最新进展、抗病毒活性、药代动力学特性、不良反应及抗药性突变进行了综述.