腺病毒介导的野生型p53基因对肺腺癌细胞株生长的抑制…

为研究野生型Ｐ５３基因对肺腺癌细胞株ＧＬＣ－８２细胞生长的作用，确立腺病毒介导的野生型Ｐ５３基因在肿瘤治疗的意义，应用分子克隆技术首先构建了野生型Ｐ５３复制缺陷型腺病毒重组体，应用生化染色方法确定了重组体的转染效率以免疫组化法及ＰＣＲ技术分别确定了腺病毒载体介导的Ｐ５３基因转染ＧＬＣ－８２细胞后，Ｐ５３蛋白和Ｐ５３ｃＤＮＡ的表达情况；最后应用细胞生物学方法检测了Ｐ５３对ＧＬＣ－８２细胞扩增及细胞周     

腺病毒介导的p53基因对喉癌细胞生长的抑制作用

目的探索ｐ５３基因在喉癌基因治疗方面的可行性。方法以人喉癌细胞系Ｈｅｐ－２为实验对象,将载有人野生型ｐ５３ｃＤＮＡ并含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的重组腺病毒（Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３）感染Ｈｅｐ－２细胞及肿瘤组织,体内外实验观察Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３对Ｈｅｐ－２细胞生长的影响。结果当Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３在１００ＭＯＩ效靶比时,全部Ｈｅｐ－２细胞得到转染。感染２天后ｐ５３蛋白表达达到高峰,Ｈｅｐ－２生长受到明显的抑制。Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３感染Ｈｅｐ－２细胞在裸鼠中失去致瘤性。瘤内注射Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３后,荷瘤裸鼠的肿瘤体积明显减小。结论Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３转导野生型ｐ５３基因可能是一种有效的喉癌基因治疗途径。     

野生型p53基因抑制膀胱癌细胞株HTB9生长及其机理的研究

目的：探讨野生型ｐ５３基因抑制膀胱癌生长的作用及其机理,方法：将野生型ｐ５３基是组腺病毒载体转染入膀胱癌细胞ＨＴＢ９,观察细胞生长曲线,细胞周期变化及ＤＮＡ合成情况,应用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｐ２１ｍＲＮＡ水平,应用免疫组化法检测ｐ２１蛋白表达水平。结果：野生型ｐ５３基因导入可抑制ＨＴＢ９细胞生长和ＤＮＡ合成（ＡｄＣＭＶｐ５３）,流式细胞仪显示,ＤＮＡ合成前期或静止静的细胞比例增高,而合成期细胞比例下降,另外,ＡｄＣＭＶｐ５３还提高了ｐ２１的ｍＲＮＡ和蛋白水平,结论：腺病毒载体介导的野生型ｐ５３基因转梁对于膀胱可能是很有前途的基因治疗方法。     

非小细胞肺癌p16基因突变的初步研究

为了解非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ｐ１６基因突变的情况,本研究应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术检测了２４例ＮＳＣＬＣ肿瘤组织中ｐ１６基因外显子２的突变情况,现将结果报告如下。１　材料与方法２４例ＮＳＣＬＣ肿瘤组织及同一病例非肿瘤肺组织均为住院病例手术切除标本,并经病理证实。按常规方法提取ＤＮＡ。ＰＣＲ反应在ＰＥ９６００热循环仪中进行,扩增ｐ１６基因第２外显子,引物序列：　　ＰＳ１：５′－ＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣ－３′ＰＳ２：５′－ＴＣＴＧＡＧＣＴＴＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＣＡＧ－３′循…     

重组腺病毒介导反义c-myc基因对人肝癌细胞系的治疗作用

目的：探讨重组腺病毒介导反义ｃ－ｍｙｃ基因（Ａｄ－ＡＳｍｙｃ）治疗人肝癌细胞的作用。方法：观察Ａｄ－ＡＳｍｙｃ对人肝癌细胞系的转导效率,通过细胞生长曲线、克隆形成实验、ＤＮＡ片段化分析、ＲＴ－ＰＣＲ、裸鼠皮下移植瘤治疗实验,分析Ａｄ－ＡＳｍｙｃ对人肝癌细胞系Ｂｅｌ－７４０２、ＱＳＧ－７７０１、ＳＭＭＣ－７７２１和ＨＣＣ－９２０４细胞生长和ｃ－ｍｙｃ基因表达及裸鼠肿瘤生长的抑制作用。结果：Ａｄ－ＡＳｍｙｃ可高效转导人肝癌细胞系,抑制细胞生长;转染细胞克隆形成能力降低,克隆成活率为对照组的５３．９％～６９．１％,ｃ－ｍｙｃ基因表达下降;Ａｄ－ＡＳｍｙｃ处理肝癌细胞,ＤＮＡ凝胶电泳出现明显的梯形条带,瘤内注射Ａｄ－ＡＳｍｙｃ可抑制裸鼠皮下移植瘤生长。结论：重组腺病毒介导的反义ｃ－ｍｙｃ基因转移,有可能成为肝癌基因治疗     

腺病毒介导野生型p53基因对人白血病细胞系HL-60、K_(562)生长的抑制作用

目的探索肿瘤抑制基因ｐ５３对人白血病细胞系的生长抑制作用和促凋亡作用。方法选用含野生型ｐ５３基因的重组腺病毒载体,体外感染人白血病细胞系ＨＬ－６０、Ｋ５６２。通过细胞生长曲线,ＤＮＡ检测及流式细胞仪分析检测转染细胞的增殖受抑制和细胞凋亡的发生。结果ＰＣＲ检测转染后ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞ｐ５３ｃＤＮＡ表达。转染后Ａｄ／ｐ５３病毒对ＨＬ－６０细胞和Ｋ５６２细胞的生长有抑制作用。随着Ａｄ／ｐ５３病毒浓度加大,ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞的ＯＤ值越低即生长抑制程度越大。经Ａｄ／ｐ５３病毒转染的ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞均有明显的细胞凋亡峰出现,对照细胞则无。细胞周期分析无明显异常发现。结论重组腺病毒载体介导的野生型ｐ５３基因在体外对人白血病细胞系ＨＬ－６０和Ｋ５６２的生长有抑制作用,能导致细胞凋亡的发生。     

3H—TdR法检测LAK细胞活性的建立及人肺腺癌细胞株（GLC—82）对LAK细胞的…

用３Ｈ－ＴｄＲ释放法检测了个旧人肺腺癌细胞株（ＧＬＣ－８２），小鼠肥大细胞瘤（Ｐ８１５）及人红白血病细胞株（Ｋ５６２）对自然杀伤细胞（ＮＫ细胞），洒巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）的敏感性。结果表明：用３Ｈ－ＴｄＲ释放法检测ＮＫ、ＬＡＫ细胞活性具有灵敏、准确、重复性好的优点，适用于国内一般实验室开展；ＧＬＣ－８２细胞对ＮＫ细胞不敏感，而对ＬＡＫ细胞敏感，提示人肺腺癌用ＬＡＫ细胞治疗可能有效，ＧＬ     

p53,p16基因蛋白在在非小细胞胞肺癌中的表达及意义

应用ＬＳＡＢ免疫组化方法检测了１１７例非小细胞肺癌组织中ｐ５３、ｐ１６基因蛋白的表达。结果显示：ｐ５３、ｐ１６蛋白在肺癌中的阳性表达率分别为４９．５％,４５．３％;在不同组织学类型中,２种蛋白阳性表达率均无显著性差异;ｐ５３蛋白表达与肺腺癌淋巴结转移有显著相关性。ｐ５３蛋白阳性表达的淋巴转移能力强（Ｐ〈０．０５）;ｐ５３、ｐ１６蛋白表达与患者预后有关;ｐ５３蛋白阳性表达及ｐ１６蛋白阴性表达者预后差     

全反式维甲酸激活的人肺腺癌细胞基因的筛选

筛选人肺腺癌细胞中全反式维甲酸（ａｌｌｔｒａｎｓ－ｒｅｔｉｎｏｃｉａｃｉｄ，ＡＴＲＡ）激活表达的基因。方法以我室构建的ＡＴＲＡ诱导前后人肺腺癌细胞系ＧＬＣ－８２的ｃＤＮＡ文库Ｌｉｂ．ＧＬＣ－８２，Ｌｉｂ，ＧＬＣ－８２．ＲＡ１，Ｌｉｂ，ＧＬＣ－８２．ｒａ４ＦＪＴＦ     

外源性p16基因对wtp53型人肺腺癌细胞生长的影响

目的 探讨Ｐ１６对人肺腺癌的作用及Ｐ１６基因治疗肺癌的可能性。方法 运用分子克隆技术构建重组人Ｐ１６基因表达载,以电穿孔法将Ｐ１６基因导入到该基因缺失的ｗｔｐ５３型的人肺腺癌Ａ５４９和Ｈ４６０细胞中,得到稳定表达Ｐ１６的人肺腺癌细胞。详细研究Ｐ１６基因对ｗｔｐ５３型人肺腺癌细胞周期的影响和细胞增殖的作用。结果 导入Ｐ１６基因能使人Ａ５４９和Ｈ４６０细胞生长速度较对照细胞明显减慢,细胞周期阻滞在Ｇ１     

Ad-p53与Ad-p16联合对人肺腺癌GLC-82细胞作用的体外实验研究 *

探讨腺病毒介导的p53与p16基因的联合对人肺腺病GLC-82疗效提高的可能性。方法：将分别携有p53基因、p16基因重组腺病毒(Ad-p53与Ad-p16)联合使用,通过细胞生长和存活实验、克隆形成实验、流式细胞分析、TUNEL检测、RT-PCR分析、免疫组织化学实验,观察其对人肺腺癌GLC-82细胞的作用。结果：在总感染强度相同的前提下,Ad-p53与Ad-p16联合导入GLC-82细胞,对细胞生长存活及克隆形成能力的抑制、以及所造成的凋亡效果比施用单种基因的效果强,表明p53基因与p16基因在体外疗效上互为协同。结论： Ad-p53与Ad-p16联合,可以提高对人肺腺癌GLC-82细胞的疗效。     

复制缺陷型腺病毒Ad-p14ARF治疗肝细胞癌的实验研究及作用机制的探讨

Objective： To study the therapeutic effect and mechanisms of recombinant adenovirus Ad-p14ARF in hepatocellular carcinoma cell lines. Methods： Morphology and trypan blue assay were adopted to evaluate the proliferation of different liver cancer cells after Ad-p14ARF infection. Cell apoptosis was confirmed by detecting phosphatidylserine （PS） externalization with Annexin V/PI double staining. Western blotting assay analyzed the expression of related proteins. Subcutaneous tumor model of BEL7402 was established to evaluate the therapeutic ability of Ad-p14ARF. Results： Ad-p14ARF suppressed cell growth, proliferation and promoted cell apoptosis of cancer cell lines with different genetic background. Ad-p14ARF inhibited growth of liver cancer cells （HepG2, BEL7402） in a dose-dependent manner. Ad-p14ARF leaded to overexpression of Bax and p21, which were the downstream regulating genes of p53. Ad-p14ARF suppressed tumor growth significantly in the experimental therapy in nude mice bearing subcutaneous tumor of BEL7402. Conclusion： P14ARF gene is a powerful tumor suppressor gene to be used in cancer gene therapy. It may play an important role in gene therapy against the malignancies in the future.     

转染 p53基因对肺腺癌细胞株裸鼠 移植瘤生长的影响

目的：探讨转染野生型 p53（ wt-p53）和突变型 p53（ mt-p53）基因对人肺腺癌细胞株 GLC-82裸鼠移植瘤生长的影响。方法：采用脂质体介导法,分别将 wt-p53和 mt-p53基因导入人肺腺癌细胞株 GLC-82,在裸鼠体内、体外实验中检测转导细胞的生长状况和裸鼠致瘤性。结果：转染 mt-p53 基因的细胞株 G418筛选的细胞集落数、 3H-TDR掺入实验、软琼脂平皿细胞集落数,以及裸鼠瘤组织重量和体积均高于对照组（ P<0.01）,而转染 wt p53基因的细胞株均显著低于对照组（ P< 0.01）,表明导入 wt p53基因的细胞株瘤细胞生长速度明显低于对照组细胞株和导入 mt p53基因的细胞株,即导入 mt p53基因的细胞株瘤细胞生长速度最快,而导入 wt p53基因的细胞株瘤细胞生长速度最慢。结论： wt p53基因能有效抑制人肺腺癌细胞生长; mt p53基因则可以明显地促进瘤细胞生长。     

转染野生型p53基因对人肺腺癌细胞作用的研究

目的研究外源性野生型p53基因对人肺腺癌细胞系GLC-82的生物学作用.方法将含有野生型p53基因的pDOR-neo逆转录病毒载体,通过Lipofectin转染GLC-82细胞,采用流式细胞分析、电镜下观察、3H-TdR掺入试验、软琼脂培养集落形成率测试及裸小鼠成瘤性实验,观察野生型p53基因对GLC-82细胞的生物学效应.结果电镜下观察可见,转染野生型p53基因可使GLC-82细胞出现一些病理现象,如细胞质中有明显的空泡及线粒体肿胀;流式细胞仪分析结果显示,野生型p53基因可阻止GLC-82细胞周期停止于G1-S区域;3H-TdR掺入试验结果提示野生型p53基因能够抑制GLC-82细胞的DNA合成,软琼脂培养集落形成率减少及裸小鼠成瘤减慢.结论转染野生型p53基因可抑制GLC-82细胞恶性增殖.     

高能电磁脉冲诱导肺癌细胞株GLC-82凋亡的研究

背景与目的:电磁脉冲(electromagneticpulse,EMP)辐射已用于饮食行业的灭菌,且较2450MHz连续微波辐射消毒更加有效。本研究探讨高能电磁脉冲对肺癌细胞GLC-82凋亡的影响,以发现治疗肿瘤的新手段。方法:以场强为6×104V/m的EMP2min内辐照5次,然后采用细胞计数、MTT、流式细胞术及SP免疫组化法检测bcl-2和p53蛋白的表达,并对表达强度用CMIAS-Ⅱ图像分析仪在放大400倍条件下进行分析,通过上述方法观察EMP对肺癌细胞GLC-82的损伤作用,所有数据经SPSS8.0软件进行分析。结果:EMP可明显抑制肺癌细胞GLC-82的增殖与活力。照射后细胞的MTT光吸收值(A570)与对照组相比,在辐照后0h,1h和6h明显降低。流式细胞术证明,GLC-82细胞在辐照后6h发生明显的凋亡,凋亡率达13.38%。免疫组化的图像分析表明,照射后GLC-82细胞有不同程度的bcl-2蛋白表达的下调及p53蛋白表达的上调。结论:EMP可诱导肺癌细胞GLC-82的凋亡。bcl-2及p53蛋白参与了GLC-82细胞的凋亡过程。     

Introduction of mutant p53 into a wild-type p53-expressing glioma cell line confers sensitivity to Ad-p53-induced apoptosis

Transient expression of the tumor suppressor gene p53 via adenoviral-mediated gene transfer induces apoptosis in glioma cells expressing mutant p53, while causing cell cycle arrest in cells with wild-type p53. To determine whether a change in p53 status of a wild-type p53-expressing cell line such as U-87 MG would alter its apoptotic resistant phenotype in response to Ad-p53 infection, we generated cell lines U-87-175.4 and U-87-175.13 via retroviral-mediated gene transfer of the p53 (175H) mutant into the U-87 MG parental line. Control cell lines U-87-Lux.6 and U-87-Lux.8 were also generated and express the reporter gene luciferase. Both U-87-175.4 and U-87-175.13, but not control cell lines, exhibited morphology characteristic of apoptosis after Ad-p53 infection. Furthermore, expression of other p53 mutants (248W, 273H) in U-87 MG also sensitized cells to Ad-p53-induced apoptosis. Apoptosis was confirmed by TUNEL and cell cycle analysis. Several p53 response genes were examined in cells infected with Ad-p53, and among these, BCL2, p21WAF1/CIP1, CPP32/caspase 3, and PARP showed differences in expression between U87-175 and U87-Lux cell lines. Taken together, our data demonstrate that the introduction of p53 mutants in U-87 MG promotes an apoptotic response in association with adenoviral-mediated wild-type p53 gene transfer. These results underscore the importance of glioma p53 genotype for predicting tumor response to p53-based gene therapy.     

CD40配体对转CD40 cDNA的人肺癌细胞功能调节的研究

目的 研究CD40配体(CD40L,CD154)对CD40阴性肺癌细胞系转染CD40 cDNA后(即CD40高表达细胞系)的调节作用,评价CD40作为治疗靶抗原的潜能。方法 通过流式细胞术筛选CD40阴性细胞系,即GLC-82细胞。以3D5细胞为模板,以pCDNA3为载体,通过基因克隆技术制备CD40 cDNA并转染到GLC-82细胞中,建立CD40高表达细胞系,即GLC-82／CD40。在细胞培养液中加入0．1μg／ml CD40L,通过流式细胞术和MTT试验检测CD40L对细胞表型、细胞生长、细胞周期及凋亡的影响。结果 Western蛋白印迹检测、限制性酶切电泳、DNA测序和流式细胞仪测定均证明了CD40 cDNA转染成功,转染后细胞的CD40表达率高达95．9％。CD40L与CD40作用后,使GLC-82／CD40细胞系上MHC-1、ICAM-1和Fas分子的表达增强,EGFR表达减弱。细胞生长受到抑制,第5天受抑最明显,受抑率为30％,但无周期特异性变化。CD40L停用48h后,各种指标的变化有所恢复。CD40L对原有高表达CD40的Calu-3肺癌细胞上述指标的影响较GLC-82／CD40更明显,而对不表达CD40的GLC82细胞无明显影响。所有肺癌细胞系均未出现细胞凋亡。结论 CD40L对转染CD40 cDNA后CD40高表达肺癌细胞系具有免疫导向治疗的潜能。     

Synergistic growth inhibition by combination of adenovirus mediated p53 transfer and cisplatin in ovarian cancer cell lines

Objective

This study was to investigate the synergistic growth inhibitory effect by combination of adenovirus mediated p53 gene transfer and cisplatin in ovarian cancer cell lines with different p53 gene mutation patterns.

Methods

Three ovarian cancer cell lines, p53 deleted SKOV3, p53 mutated OVCAR-3, and PA-1 with wild-type p53 were transduced with human adenovirus vectors carrying p53 gene (Ad-p53) and treated with a sublethal concentration of cisplatin before and after Ad-p53. The cell number was counted daily for 5 days after Ad-p53 transduction. Western blotting was used to identify p53 and p21 protein expressions, and flow cytometric analysis was performed to investigate any change of DNA ploidy after Ad-p53 transfer.

Results

Ad-p53 transduced cells successfully expressed p53 and p21 proteins after 48 hours of Ad-p53 transduction. Synergistic growth inhibition by combination of Ad-p53 and cisplatin was detected only in SKOV3 and OVCAR-3 cells, but not in PA-1 cells. In p53 deleted SKOV3 cells, cisplatin treatment after Ad-p53 showed higher growth inhibition than the treatment before Ad-p53 transduction, and reverse relationship was observed in p53 mutated OVCAR-3 cells. In SKOV3 cells, the fraction of cells at G2/M phase increased after cisplatin treatment, however, it decreased dramatically with Ad-p53 transduction.

Conclusion

The synergistic growth inhibition by combination of Ad-p53 and cisplatin may depend on the p53 status and the temporal sequence of cisplatin treatment, suggesting judicious selective application of this strategy in clinical trials.     

Ad-p53诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡作用

目的：观察重组人p53腺病毒（ p53-expressing adenovirus,Ad-p53）对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞生长、细胞周期、凋亡和p53表达的影响。方法：流式细胞仪检测Ad-p53作用于MDA-MB-231细胞72h后细胞凋亡率和细胞周期变化,Western blot法检测MDA-MB-231细胞p53蛋白表达。结果：经Ad-p53处理72h后倒置显微镜下MDA-MB-231细胞形态发生明显的变化。流式细胞术检测结果显示, Ad-p53作用MDA-MB-231后其细胞凋亡率与对照组相比明显增加,G0/G1期细胞比例逐渐升高,S期、G2/M期细胞比例相应减少（ P＜0.05）。Western blot证实了外源野生型p53基因能在MDA-MB-231细胞表达增加。结论：Ad-p53可以抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的生长,促进其凋亡,其机制可能是通过阻滞细胞周期以及野生型p53蛋白表达增加实现的。