蛋白酶体β5亚单位过表达对氧化环境下人晶状体上皮细胞的影响

【目的】探讨蛋白酶体筇亚单位（PSMB5）基因过表达对氧化条件下晶状体上皮细胞的影响。【方法】构建重组质粒pcDNA3．1-PSMB5并将其转染人人晶状体上皮细胞株SRAO1／04中，形成稳定表达，同时设pcDNA3．1空载体为对照组。RT—PCR法及Western blot法分别检测PSMB5基因及蛋白的表达情况。H2O2分别作用PSMB5转染细胞及空载体转染细胞，MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】转染后用G418筛选3周后，获得PSMB5转染及空载体转染的G418抗性的细胞克隆。转染PSMB5基因的细胞PSMB5 mRNA表达强度明显增高．而空载体转染细胞与未转染细胞无显著差异：转染PSMB5基因的细胞的PSMB5蛋白表达也显著高于空载体转染细胞。低浓度H2O2作用后，转染PSMB5基因的细胞增殖能力高于空载体转染细胞。【结论】低浓度氧化环境下蛋白酶体历亚单位PSMB5过表达能对人晶状体上皮细胞具有保护作用。     

PCNA与TGF-β1在人胎儿晶状体上皮细胞的表达

目的：观察增殖细胞核抗原（PCNA）及转化生长因子β1（TGF－β1）在人胎儿晶状体上皮细胞的表达。方法：用SP免疫组织化学法对48例人胎儿不同龄晶状体上皮细胞进行PCNA,TGF－β1免疫细胞化学染色,结果：PCNA,TGF－β1在人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞均有表达,免疫阳性细胞随着胎龄的增加而减少。PCNA阳性细胞核为桔黄色或棕黄色,TGF－β1阳性细胞浆为桔黄色或棕黄色的颗粒状或斑块状,经相关分析,TGF－β1与PCNA呈正相关。结论：PCNA,TGF－β1在人胎儿不同胎龄胎晶状体上皮细胞均有表达,TGF－β1促进晶状体上皮细胞的增殖。     

人晶状体上皮细胞BHMT基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)基因过表达慢病毒载体,并检测其在人晶状体上皮细胞中的表达效果。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增制备目的基因片段,构建BHMT慢病毒过表达载体,转染至293T细胞。运用免疫荧光法行病毒滴度检测,并利用荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,运用RT-PCR、Western blot检测鉴定BHMT mRNA蛋白的表达水平。将构建成功的慢病毒载体BHMT-GV358感染人晶状体上皮细胞,观察目的基因表达。结果:重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光,在稳定转染的细胞中BHMT及蛋白的表达水平较未转染细胞显著增高(P<0.05),体外转染人晶状体上皮细胞,荧光显微镜下可见BHMT表达。结论:成功构建过表达BHMT的慢病毒载体,并有效感染人晶状体上皮细胞,为进一步研究BHMT在白内障发生发展中的作用提供生物学基础。     

TGF—β1、EGF在人胎儿晶状体上皮细胞的表达

目的：观察转化生长因子β１（ＴＧＦ－β１）、表皮生长因子（ＥＧＦ）在人胎儿晶状体上皮细胞的表达。方法：用ＳＰ免疫细胞化学法对４８例人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞进行ＴＧＦ－β１、ＥＧＦ免疫细胞化学染色。结果：ＴＧＦ－β１、ＥＧＦ阳性细胞浆为桔黄色或棕黄色的颗粒状或斑块状;并且阳性细胞随着胎龄的增加而减少。经相关分析：ＴＧＦ－β１与ＥＧＦ呈正相关。结论：ＴＧＦ－β１、ＥＧＦ在人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞均有表达,并且随着胎龄的增加而减少;ＴＧＦ－β１与ＥＧＦ具有协同作用,共同促进晶状体上皮细胞的增殖。     

膜联蛋白A5过表达对宫颈癌细胞系SiHa形态的影响

膜联蛋白(ANXA)是一个Ca2+依赖的磷脂结合蛋白家族,结构上,它们都有C端保守的核心区域,N端序列中有磷脂酶A2(PLA2)和蛋白激酶C(PKC)的结合位点.功能上,在Ca2+存在的条件下,它们可与细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)可逆性地结合.PKC是胞外细胞信号转导通路的重要成分,若过度激活会造成细胞增殖失调,佛波脂(PMC)是PKC的激动剂,可持续激活PKC而引起肿瘤的发生.     

地塞米松对大鼠晶状体上皮细胞TGF-β受体表达的影响

目的 探讨地塞米松对大鼠晶状体上皮细胞TGF-β受体表达的影响及意义。方法 取1月鼠龄SD大鼠,予地塞米松眼膏涂双眼结膜囊,分别于用药1月、3月及6月摘取晶状体作为实验材料,采用晶状体前囊膜铺片方式,应用荧光免疫组化技术进行TGF-βR1和TGF-βR2荧光免疫组化染色,检测其蛋白水平表达的变化;采用剥取晶状体囊膜组织方法,应用RT-PCR技术检测TGF-βR1和TGF-βR2在转录水平表达的变化。取相同数量的正常同龄大鼠作为对照组。结果在蛋白及转录水平,TGF-βR1和TGF-βR2的表达于用药后1、3、6月均较同龄对照组减弱（P〈0．05）;对照组中,TGF-βR1和TGF-βP,2的表达随着年龄的增加也逐渐减弱（P〈0．05）;实验组中,随着用药时间的增加,TGF-βR1和TGF-βR2的表达进一步减弱（P〈0．05）。结论地塞米松可以降低大鼠晶状体上皮细胞中TGF-βR1和TGF-βR2的表达,并随着用药时间的延长,其表达进一步降低,对白内障的形成有一定的影响。     

5-氟尿嘧啶对兔眼晶状体上皮细胞增生的抑制作用

目的进一步探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)对兔眼晶状体上皮细胞的抑制作用。方法将25只家兔随机分成对照组A和实验组B、C、D和E五个组,所有家兔(50只眼)均进行“假性白内障”手术,对照组A不加任何药物。实验组B、C、D和E四个组在手术过程中分别给予浓度为0.25、0.5、1.0和2.0mg/m l的5-FU行后囊膜冲洗,手术后第3、5和7天时分别在实验组B、C、D和E四个组的40只兔眼前房中注入浓度分别为0.25、0.5、1.0和2.0mg/m l的5-FU0.5m l。于术后第60天在裂隙灯显微镜下行晶状体后囊膜混浊(PCO)分级。并于术后第60天分别随机处死每一组的1只家兔进行后囊组织病理学检查。结果术后对照组A和实验组B、C发生PCO的程度相近,而D组和E组发生PCO的程度明显减轻。结论5-FU的浓度达到一定值时,对晶状体上皮细胞增生具有明显的抑制作用。     

羟基喜树碱对培养兔晶状体上皮细胞的影响

目的研究羟基喜树碱(hydroxycamptothecine,HCPT)对培养兔晶状体上皮细胞(rabbitlens epithelial cells,RLECs)形态、增殖的影响及其机制,筛选防治后发性白内障的药物。方法首先进行RLECs体外培养,在第2、3代RLECs中加入HCPT,分别用光学显微镜和透射电镜观察细胞形态的变化。然后,在第2、3代RLECs中加入不同浓度的HCPT,观察HCPT对细胞增殖的影响。结果①HCPT对RLECs的形态具有显著的影响,透射电镜下主要表现为调亡细胞的形态改变。②HCPT能抑制细胞的增殖,其抑制作用随药物浓度增加、作用时间延长而增强。结论①HCPT通过凋亡机制引起体外培养RLECs的调亡。②HCPT能抑制体外培养RLECs的增殖,其抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性。③HCPT可能成为预防后发性白内障的药物。     

电磁脉冲对猴晶状体上皮细胞CyclinE表达的影响

目的 观察电磁脉冲(EMP)对猴晶状体上皮细胞Cyclin E表达水平的影响。方法 6×10~4 V/m场强的EMP辐射恒河猴30次,应用免疫组化、原位杂交和图像分析技术对晶状体上皮细胞Cyclin E蛋白及mRNA表达水平进行检测。结果 高场强EMP辐射干扰晶状体上皮细胞的正常增殖,照后30d,Cyclin E蛋白表达降低,其对细胞周期调控作用减弱。辐射损伤经修复后,照后136d和265d,Cyclin E蛋白表达水平升高,正性调控作用加强,晶状体上皮细胞增生活跃。蛋白与mRNA表达同步且一致。结论 EMP辐射影响细胞周期进程,上皮细胞增殖异常可能是导致白内障的重要原因。     

转化生长因子β2对人晶状体上皮细胞间质转分化的影响

目的:探讨转化生长因子β2(TGF-β2)对培养的人晶状体上皮细胞(HLECs)增殖及诱导HLECs间质转分化的影响。方法:体外培养HLECs,培养基加入不同质量浓度TGF-β2进行干预,采用MTT法测定TGF-β2对细胞增殖的影响;细胞免疫化学染色方法检测100ng/LTGF-β2作用后E-钙黏素(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和F-肌动蛋白(F-actin)的表达;RT-PCR方法检测E-cadherin、α-SMAmRNA的表达。结果:经TGF-β2处理后的HLECs增殖受到抑制;TGF-β2减弱HLECsE-cadherin的表达,相对表达量为(10.674±3.233),较对照组的(23.352±4.192)减弱(t=4.232,P=0.013)。TGF-β2增加HLECsα-SMA和F-actin的表达,相对表达量分别为(17.613±4.272)、(15.857±4.121),较对照组的0、(4.272±1.538)增强(Z=12.537,P<0.001;t=7.186,P=0.004)。RT-PCR结果显示,TGF-β2组HLECsE-cadherinmRNA的相对表达量为(0.321±0.081),较对照组的(0.983±0.248)减弱(t=3.491,P=0.008);TGF-β2组细胞α-SMAmRNA相对表达量为(0.632±0.158),较对照组的(0.097±0.028)增强(t=5.365,P=0.005)。结论:TGF-β2可以抑制HLECs的增殖,诱导HLECs间质转分化,可能参与后囊膜混浊的形成。     

MTT法和XTT-PMS法测定5-FU对牛晶状体上皮细胞的抑制作用

目的探讨MTT法和XTT-PMS法在测定5-氟尿嘧啶(5-FU)对牛晶状体上皮细胞抑制作用的差异。方法分别应用MTT比色法和XTT-PMS比色法比较不同浓度的5-FU对2~4代的晶状体上皮细胞的抑制作用。结果各质量浓度组吸光度(A)与对照组比较,差异有统计学意义,P<0.01。结论MTT比色法、XTT-PMS比色法均能准确的测定细胞的增殖反应,并且XTT-PMS比色法灵敏度更高,操作更简便。     

MTF法和XTF-PMS法测定5-FU对牛晶状体上皮细胞的抑制作用

目的 探讨MTT法和XTT—PMS法在测定5-氟尿嘧啶（5-FU）对牛晶状体上皮细胞抑制作用的差异。方法 分别应用MTT比色法和XTT—PMS比色法比较不同浓度的5-FU对2～4代的晶状体上皮细胞的抑制作用。结果 各质量浓度组吸光度（A）与对照组比较，差异有统计学意义，P〈0．01。结论 MTT比色法、XTT—PMS比色法均能准确的测定细胞的增殖反应，并且XTT—PMS比色法灵敏度更高，操作更简便。     

PP242对人晶状体上皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达的影响

目的探讨PP242对人晶状体上皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达的影响。方法采用不同浓度PP242处理培养传代的永生系人晶状体上皮细胞系SRA01/04。采用MTT法检测处理24、48 h后的细胞生长抑制率,采用实时定量RT-PCR和免疫印迹法检测不同浓度PP242处理48 h后Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平的变化情况。结果 100、250、500、750、1 000、1 500 nmol/L PP242对人晶状体上皮细胞SRA01/04作用24、48 h后,细胞生长抑制率24 h组分别为7.55%、9.43%、16.98%、22.64%、26.42%、30.19%,48 h组分别为11.11%、23.81%、36.51%、42.86%、49.21%、63.49%,与对照组(0 nmol/L)比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。免疫印迹法检测结果显示:在相同作用时间内,随着PP242药物浓度的增加,Bcl-2蛋白的表达水平逐步下降,与对照组(0 nmol/L)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。实时定量RT-PCR检测结果显示:在相同作用时间内,随着PP242药物浓度的增加,Bcl-2 mRNA表达水平亦逐步下降;m RNA相对表达量分别为0.723±0.039,0.517±0.028,0.353±0.052,0.167±0.046,与对照组(0 nmol/L)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PP242能够抑制体外培养的人晶状体上皮细胞的生长,呈浓度和时间依赖性。人晶状体上皮细胞中存在Bcl-2的表达,PP242可下调其表达。     

金雀异黄素对氧化损伤的人晶状体上皮细胞凋亡的防护作用

目的：探讨金雀异黄素（Gen）对氧化损伤的人晶状体上皮细胞（HLEC）凋亡有无抑制作用。方法：本研究在终浓度3×10^-4mol/L H2O2培养液中复制HLEC凋亡模型,并以雌二醇（E2）作为阳性对照,采用流式细胞仪（FCM）检测HLEC凋亡率和线粒体膜电位（ΔΨM）的变化。结果：FCM结果显示：H2O2组HLEC凋亡率显著高于空白对照组;E2和Gen组凋亡率均低于H2O2组（P〈0.01）。H2O2组线粒体膜电位比对照组显著下降;E2组和Gen组的线粒体膜电位均比H2O2组升高（P〈0.01）。结论：Gen可减轻实验性氧化损伤的HLEC凋亡程度。     

Hsa-miRNA-9-5p过表达慢病毒载体的构建

目的深讨Has-miRNA-9-5p过表达慢病毒载体的构建。方法采用相关基因shRNA序列设计、病毒载体松建与鉴定以及病毒包装滴度鉴定、表达检测。结果成功构建慢病毒载体Has-miRNA-9-5p过表达系统。结论为miRNA-9-5p的功能研究奠定基础。     

过表达NPM1对胰腺癌细胞增殖、凋亡影响的研究*

目的：探讨NPM1过表达对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响。方法：对人胰腺癌细胞株AsPc-1,BxPc-3,PANC-1,CFPAC-1及人正常胰腺细胞株HPDE6CT作传代培养,检测其中NPM1表达。选择表达较低的细胞行NPM1过表达质粒转染,并设立空白质粒转染对照组。48小时后,采用RT-PCR及Western检测NPM1表达水平变化,并行MTT及流式细胞技术检测细胞增殖、凋亡情况。结果：（1）NPM1在BxPc-3细胞系中表达最低;（2）NPM1过表达组与空白质粒组相比,NPM1的mRNA表达量及蛋白表达量明显增多,差异显著（P<0.05）;（3）NPM1过表达组相比空白质粒组,细胞增殖增加,早期凋亡细胞明显减少（P<0.05）。结论：NPM1的过表达可促进胰腺癌细胞增殖,减少凋亡。     

失巢凋亡过程中整合蛋白α5β1过表达对人肝癌细胞Survivin表达的影响

目的：探讨整合蛋白α5β1过表达引起肝癌细胞凋亡的机理。方法：利用poly—hema使细胞非贴壁生长12h、18h、24h，诱导失巢凋亡。通过Westerm迹法检测Survivin表达量。结果：随着poly—hema诱导时间的增加，α5β1—7721和β1—7721细胞凋亡和死亡率也随之增加，而Survivin表达量则减少，β1—7721细胞的减少程度显著大于α5β1—7721，在18h时减少了55％。结论：Survivin在β1—7721细胞的凋亡过程中所起的作用大于α5β1—7721细胞。     

过表达 mimecan对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的作用初探

目的 应用反转录病毒载体技术构建稳定过表达mimecan的人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）,并观察过表达mime-can后HUVEC增殖及凋亡的变化.方法 应用反转录病毒载体构建稳定过表达mimecan的HUVEC细胞株,real-time PCR和Western blot法检测mRNA和蛋白水平的表达.应用CCK-8方法检测过表达mimecan后HUVEC增殖的变化,应用Annexin V-PE染色观察过表达mimecan后HUVEC凋亡的变化.结果 构建了稳定过表达mimecan的HUVEC细胞株.过表达mimecan后,HUVEC增殖能力降低,凋亡率增加.结论 过表达mimecan抑制HUVEC的增殖,促进其凋亡.     

CDK2-AP1基因过表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖及周期的影响

目的:通过过表达手段上调细胞周期调节蛋白依赖性激酶2- 关联蛋白1(CDK2-AP1) 基因在乳腺癌细胞MCF-7 中的表达, 并观察其对MCF-7 细胞生长和细胞周期调控的作用。方法:将CDK2-AP1 基因的编码框构建于慢病毒表达载体, 导入MCF-7 细胞, 应用实时定量PCR 和Western 印迹验证CDK2-AP1 基因mRNA 和蛋白的表达效率。利用M 法绘制生长曲线、克隆形成实验观察CDK2-AP1 基因过表达后MCF-7 细胞生长的变化, PI 染色流式细胞仪检测MCF-7 细胞周期的改变。通过Western 印迹检测CDK2-AP1 过表达后, 细胞周期相关蛋白(CDK2, CDK4, P16^Ink4A, P21^Cip1/Waf1) 的表达。结果:过表达CDK2-AP1 基因的慢病毒感染MCF-7 细胞可上调其mRNA 表达6.94 倍, 蛋白表达也十分显著地增高, 两者相一致。生长曲线显示MCF-7 细胞过表达CDK2-AP1 基因后, 增殖能力显著降低(P<0.05);克隆形成实验表明, 其形成的克隆数目同样显著减少(P<0.05);流式细胞仪检测证实MCF-7 细胞过表达CDK2-AP1 能够使细胞周期出现G₁期阻滞, 并且出现凋亡峰;CDK2-AP1 基因表达上调导致P21^Cip1/Waf1和P16^Ink4A蛋白表达上调, CDK2 和CDK4 蛋白表达下调。结论:CDK2-AP1 基因具有抑癌基因的功能, 在乳腺癌MCF-7 细胞过表达该基因能够抑制细胞的生长和克隆形成能力, 并且使细胞阻滞于G₁期。     

去整合素kistrin对晶状体摘除术后兔晶状体上皮细胞MMP-2蛋白表达的影响

目的研究去整合素kistrin对晶状体摘除术后兔晶状体上皮细胞(LECs)中基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达的影响。方法对40只新西兰大白兔右眼行透明晶状体摘除术(ECLE),术毕随机分为实验组及对照组,实验组囊袋内注入0.2 mL浓度为80 ng/mL的kistrin,对照组注入等量林格液,随机取10只左眼为空白组。分别于术后14 d(实验组A组、对照组B组)及3个月(实验组C组、对照组D组)取后囊膜,以肺癌组织为阳性对照组。应用Western blotting检测兔后囊膜组织及肺癌组织中的蛋白表达量。结果空白组后囊膜MMP-2无蛋白表达,A、B、C、D组均有蛋白表达。B组MMP-2的相对灰度值为0.769±0.011,A组为0.378±0.019;D组为1.015±0.020,C组为0.361±0.013,低于D组(P=0.000);D组相对灰度值较B组升高(P=0.000);A组、C组相对灰度值差异无统计学意义(P=0.217)。结论整合素kistrin可能在晶状体摘除术后MMP-2的表达中发挥重要的作用,这可能与Ⅳ型胶原的分泌减少密切相关。