转基因动物与遗传病模型

转基因动物(transgenic animals)是指通过基因转移技术，将外源基因导入受精卵或早期胚胎，使之在动物体内得以表达并能稳定遗传的一类动物。自从1979年Mintz等将SV40病毒DNA导入小鼠胚胎细胞，获得第一个带有人工导入的外源基因的嵌合体小鼠以来，转基因动物技术已渗透到各个研究领域，在人为改造物种或生物性状方面显示了广阔的应用前景，为许多基础理论的研究提供了大量的宝贵资料。     

靶向性非病毒载体GE7系统的构建及对人脑胶质瘤体外转移效率分析

目的：组建表皮生长因子受体介导的靶向性非病毒载体GE7系统，研究GE7系统对U251人恶性胶质瘤细胞株的体外转导效率。方法：应用上海市肿瘤研究所组建的EGF-R配体16肽GE7、流感病毒血凝素N端20肽HA20与多聚赖氨酸P.L.组成非病毒载体基因转移系统，分别与β-gal报道基因、p21WAF-1/CIP1基因组成多肽/DNA载体四元复合物。β-gal报道基因体外转导U251细胞，分析GE7系统体外导入效率。结果：载体DNA复合物组转染后24h即可观察到少量外源基因的表达，72h外源基因表达达到高峰，然后逐渐下降，转染后168h基本消失。单纯质粒DNA组仅见微弱外源基因的转入；对照组未见外源基因的转入。结论：GE7基因转移系统具有较高的基因转移效率和靶向性，为脑胶质瘤基因治疗提供了一种新的途径。     

腺病毒载体及其在肿瘤基因治疗中的应用

近等来，DNA病毒作为有潜在应用价值的基因转移载体倍受关注。其中，腺病毒(Adenovirus，Ad)是研究较彻底、使用最广泛的一种。Ad的优点包括：(1)腺病毒基因组较大(36kb)，插入大片段外源基因的潜力大，理论上．除最末端序列(复制必需)和接近左端的序列(包装必需)外，基因组的绝大部分(约35kb)均能被外源基因取代。目前构建的载体其外源DNA的插入容量可8．3kb；(2)宿主范围广、感染率高，对非增殖细胞也有感染性；(3)理化性质较稳定．通过柱层析或超离心可获得高谪度的病毒载体；     

受体介导的基因转移治疗肿瘤的研究现状

肿瘤基因治疗的实施主要包括以下 3个方面 :( 1)寻找具有治疗意义的目的基因 ;( 2 )建立有效的靶细胞向转移目的基因的载体系统 ;( 3)使目的基因在靶细胞中表达 ,发挥生物学效应达到治疗目的 ,目的基因成功转移入靶细胞是基因治疗最重要的环节。肿瘤基因治疗基因转移方法较多 ,可分为物理、化学和生物 3大类。包括裸露 DNA直接注射、多价阳离子 - DNA复合物转化、电转化、脂质体共转化和病毒方法等。利用细胞表面受体介导的基因转移技术将外源基因特异性导向靶细胞表达是近年来基因治疗研究的热点之一。它是利用细胞表面存在的特异性受体…     

转化、转导、转染和感染的用法

转化(transformation)、转导(transduction)、转染(transfection)和感染(infection)是分子生物学实验中将外源基因导入受体细胞的4种技术,它们词形相近,概念上容易混淆。"转化"是指含外源基因的重组质粒(载体)将外源基因直接导入原核细胞(如细菌);"转导"指通过重组病毒载体将外源基因导入真核细胞或原核细胞;"转染"指重组质粒载体或游离核苷酸在脂质体     

转化、转导、转染和感染的用法

转化(transformation)、转导(transduction)、转染(transfection)和感染(infection)是分子生物学实验中将外源基因导入受体细胞的4种技术,它们词形相近,概念上容易混淆。"转化"是指含外源基因的重组质粒(载体)将外源基因直接导入原核细胞(如细菌);"转导"指通过重组病毒载体将外源基因导入真核细胞或原核细胞;"转染"指重组质粒载体或游离核苷酸在脂质体     

医学论文中转化、转导、转染和感染的辨析

转化、转导、转染和感染是分子生物学实验中基因转移相关的名词,在医学论文中经常使用。它们词形相近、词意容易混淆,医学论文中时常用错。“转化”指通过含外源基因的重组质粒载体将外源基因直接导入原核细胞（如细菌）;“转导”指通过重组病毒载体将外源基因导入真核细胞或原核细胞;“转染”指重组质粒载体或游离核苷酸在脂质体等介导下进入真核细胞;“感染”在基因转移实验中强调重组病毒载体入侵受体细胞的过程。在使用这4个名词时,应仔细分析基因转移实验的4要素——转移物、载体、介导方法、受体细胞类型,而正确区分载体和受体细胞类型是辨析的关键点。当载体是重组质粒时,如受体细胞是原核细胞应使用“转化”,如受体细胞是真核细胞则使用“转染”;当载体是重组病毒时,如强调转移物进入受体细胞应使用“转导”,如强调重组病毒我体进入受体细胞的过程则使用“感染”。     

人类基因治疗的现状及伦理争议

目前基因治疗的策略包括基因替代、基因修正、基因增强、基因抑制和基因失活。基因转移的方法有物理、化学和生物3大类。其中生物转移在人类细胞中应用最为广泛。生物法主要是指病毒介导的基因转移,是通过病毒为载体,将外源基因通过重组技术与病毒重组,然后去感染受体细胞。研究最为系统深入的、应用最多、最成功的是逆转录病毒,用于人体细胞实验的逆转录病毒以慢病毒为佳。     

人β-珠蛋白基因在Friend细胞中的整合、定位及β-地贫基因治疗体外细胞模型的细胞遗传学(简报)

外源基因在受体细胞中的整合和定位,是影响体细胞基因治疗最终结果的重要环节。本实验以逆转录病毒为载体将人正常β-珠蛋白基因转移到小鼠红白血病细胞(MEL,即Friend细胞)中,探索外源基因在靶细胞中的整合、定位及其规律和不同传代对整合稳定性的影响。取外源基因转移后并经G_(418)筛选所获得的阳性克隆群体细胞进行有无G_(418)维持水平选择及不同传代数目培养,以MEL细胞为阴性对照,重组病毒(N_2HNβ)为阳性对照,提取基因组DNA。Southern     

二氢叶酸还原酶扩增系统--一种高效稳定的哺乳动物细胞表达系统

基因工程的表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。哺乳动物细胞的表达系统能识别和除去外源基因中的内含子，剪接加工成熟的mRNA，易被重组的DNA质粒转染，具有遗传的稳定性和可重复性，并且蛋白产品提纯工艺简单、成本低，应用前景广泛。稳定表达是指导入基因已被整合入受体细胞的基因组中，从而能长期进行表达，对这     

弓形虫p30基因在真核系统中的表达

采用聚乙二醇（PEG）沉淀法纯化克隆刚地弓形虫（Toxplasmagondii）p30基因的转移载体质粒pSXIVVI+X3－p30DNA；将pSXIVVI＋X3－p30DNA与粉纹夜蛾核型多角体缺陷型病毒TnNPV－SVI－GDNA共转染草地夜蛾（Sfg）细胞，构建出既能形成多角体又能表达外源基因的重组病毒TnNPV－p30。经空斑纯化挑选出6株单克隆重组病毒，感染细胞裂解液在相对分子质量约为34000～35000位置出现一条表达带；其含量占细胞总蛋白的5.13％～5．62％，株间差异不明显；用抗弓形虫多克隆抗血清进行Western－Blot呈一特异反应条带。感染后72h蛋白表达量最高，可达7．18％；96小时次之，为5．91％。     

核基质结合区修饰的附着体载体介导的EGFP基因体外表达

目的 建立一个非病毒介导外源基因高效转移和稳定表达体系.方法 采用EB病毒(EBV)来源的附着体质粒载体,并结合顺式作用元件IFN-MAR构建重组质粒pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR.采用荧光显微镜观察并摄片,FACS及逆转录-聚合酶链反应检测EGFP表达阳性的COS-7细胞比例、荧光表达强度及EGFP基因的转录.通过Southern印迹和质粒还原实验分析质粒DNA在细胞中存在的形式.结果 本实验构建的重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR在转染进入COS-7细胞后以染色体外附着体的形式存在.由于EBVR的存在,可以在体外获得EGFP较长时间的稳定表达.IFN-MAR替代OriP后,仍可在体外获得EGFP的稳定表达.结论 MAR修饰的EBV附着体载体可以在体外获得外源基因高效稳定的表达.     

核基质结合区修饰的附着体载体介导的EGFP基因体外表达

目的建立一个非病毒介导外源基因高效转移和稳定表达体系。方法采用EB病毒(EBV)来源的附着体质粒载体,并结合顺式作用元件IFN-MAR构建重组质粒pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR。采用荧光显微镜观察并摄片,FACS及逆转录-聚合酶链反应检测EGFP表达阳性的COS-7细胞比例、荧光表达强度及EGFP基因的转录。通过Southern印迹和质粒还原实验分析质粒DNA在细胞中存在的形式。结果本实验构建的重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR在转染进入COS-7细胞后以染色体外附着体的形式存在。由于EBVR的存在,可以在体外获得EGFP较长时间的稳定表达。IFN-MAR替代O riP后,仍可在体外获得EGFP的稳定表达。结论MAR修饰的EBV附着体载体可以在体外获得外源基因高效稳定的表达。     

壳聚糖-碳纳米粒的制备及其体外性质的研究

目的 制备壳聚糖-碳纳米颗粒并研究其理化性质和体外活性。方法 首先，用溶胶法制备出分散性良好的碳纳米粉末，再通过正负电荷相互吸引制备出壳聚糖-碳纳米颗粒；其次，用绿色荧光蛋白（PEGFP-C1）质粒DNA作报告基因，以静电吸附的方式将PEGFP-C1质粒DNA与壳聚糖-碳纳米颗粒结合形成载基因纳米粒；再次，用扫描电镜观察其形态特征，激光粒度分析仪测定其粒度分布及表面电位（Zeta电位），MTT试验检测壳聚糖-碳纳米载体对HepG2细胞和COS7细胞的毒性作用，凝胶阻滞实验确定该基因载体的DNA携带率，DNase Ⅰ保护实验研究其对所携带基因的保护作用，体外纳米粒导入实验定性评价纳米粒进入在体外进入细胞的活性，并用荧光显微镜观察导入效果。结果 壳聚糖-碳纳米粒表面携带正电荷，聚合指数〈0．3；与DNA结合后效率较高，且可保护DNA免受DNase Ⅰ的降解；经FITC标记后能够成功地进入到COS7细胞和HepG2细胞。结论 壳聚糖-碳纳米颗粒能进入到细胞内部，且导入效率较高，可以用作基因递送的非病毒载体系统，值得进一步研究。     

基因工程在医学上应用

基因工程是指不同生物体的脱氧核糖核酸在体外经过酶切和连接，构成重组脱氧核糖核酸分子，然后转入受体细胞，使外源基因在受体细胞中表达。人类按照这个原理，根据需要，人为地转移和重组遗传基因。基因重组是由一个脱氧核糖核酸片段掺入到另一脱氧核糖核酸分子中，这种外源基因与生物染色体的整合，使此时的外源基     

转基因DT40细胞导入早期鸡胚后的分布及绿色荧光蛋白表达的研究

目的 为了研究经过基因修饰的体细胞导入到禽类胚胎以后,供体细胞及外源基因是否能在受体胚胎中成活并且外源基因是否可以长期表达.方法 筛选得到稳定整合绿色荧光蛋白基因的鸡DT40细胞作为外源蛋白的运载工具,通过血管微注射的方法将其导入到于38.5℃温度条件下孵化65～70 h的鸡胚中,并将操作后的鸡胚在原孵化条件下继续孵化.在孵化的不同时期取移植了DT40细胞的嵌合体胚胎在荧光显微镜下观察荧光细胞的存活与分布情况.并通过PCR以及免疫组织化学方法检测供体细胞在受体中的位置以及绿色荧光蛋白的表达情况.结果 荧光标记的DT40细胞可以存活于受体不同的组织器官中,包括:脑、心脏、肝脏等.导入胚胎的整合外源基因的DT40细胞可以存活到胚胎出雏之前,并且外源基因能够正常表达.结论 可以通过此方法将外源基因导入到受体中,并使目的 蛋白在受体胚胎中持续表达,为胚胎期导入外源蛋白诱导免疫耐受的研究以及将转基因细胞移植到动物体内生产目的 蛋白的研究提供科学依据和技术平台.     

基因治疗文献的定量研究及发展趋势预测

基因治疗(Gene Therapy)一般是指将正常的外源基因导入生物体靶细胞内以弥补致病基因缺陷的功能,主要有基因导入疗法(包括磷酸钙法、DNA微注射法、重组DNA病毒载体和重组RNA病毒载体四个不同发展阶段)、基因操纵疗法(包括抑制基因疗法、选择性基因激活),用于治疗遗传病、肿瘤、传染病和心血管疾病、糖尿病等。随着分子生物学及临床医学研究的深入发展,基因治疗日     

克隆化基因的真核细胞转染

真核转染技术是将克隆化的外源基因通过某种特定的手段导入真核细胞的一种方法。可以用来导入高效表达的蛋白 ,研究其结构或生化特性 ,也可以用于研究基因表达调控的机制等。目前真核转染技术已经用于基因的结构与功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等方面的研究。根据研究目的不同 ,基因转染有瞬时转染和稳定转染两种。瞬时转染是在转染后不对转移进去的目的基因进行筛选 ,被转染的群体细胞瞬时表达效率取决于细胞摄入转染DNA的数量、基因的拷贝数和每一基因的表达水平。稳定转染是在转染后进行选择 ,分离出外源基因稳定整…     

稳定表达外源野生型p53基因人胆囊癌细胞系的建立和鉴定

目的：建立稳定表达外源野生型p53（wtp53）基因的人胆囊癌细胞系。方法：在脂质体lipofectamine^TM 2000介导下，将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53导入胆囊癌细胞系GBC—SD中。经G418筛选抗性克隆，扩大培养，建立转染克隆细胞系。用聚合酶链反应（PCR）证实外源野生型p53基因的整合，用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白印迹法分析目的基因及其蛋白表达。结果：野生型p53基因成功地导入胆囊癌细胞系GBC—SD，转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。结论：GBC—SD胆囊癌细胞株能稳定表达外源野生型p53基因。     

腺病毒载体及其应用

随着疾病分子水平机理研究的不断深入,基因治疗已成为很多疾病防治及医学研究工作新的切入点。理想的基因治疗方案需具备有效性与安全性,因此安全有效的基因转导载体及技术是决定基因治疗成败的关键。在众多的基因转导载体中,重组腺病毒载体能利用病毒自身感染宿主细胞的特点,简便有效地将目的基因导入靶细胞,并使其有效表达。而且腺病毒为DNA病毒,极少发生插入突变,载体操作方便、宿主广泛、容易增殖,并具有携带外源基因容量大,可表达接近翻译后成熟水平蛋白质等特点,已被广泛用于多种疾病的基因治疗。本文拟就腺病毒载体的构建,载体效能…