人肺腺癌细胞系(LAC)中SP细胞亚群的分选及其干细胞特性分析

目的: 分选人肺腺癌细胞系(LAC)中SP细胞(side population cells)亚群并分析其具有的干细胞特性?方法:运用流式细胞荧光激活分选技术(FACS)分选LAC中SP细胞亚群和非SP细胞亚群,利用MTT?体外克隆形成和皮下移植瘤试验分析其体内?外增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期及细胞分化,RT-PCR方法检测其ATP结合盒转运蛋白(ABCG2)基因的表达情况?结果:流式细胞荧光激活分选结果显示:LAC中含有约1.88%的SP细胞亚群?MTT和体外克隆形成试验表明:SP细胞亚群的体外增殖能力显著强于非SP细胞亚群?同时,裸鼠皮下接种SP细胞亚群,其体内成瘤能力也要显著强于非SP细胞亚群?流式细胞仪分析结果表明:SP细胞亚群的G0/G1期比例显著高于非SP细胞(P < 0.05)?细胞分化实验结果表明:两个亚群中SP细胞比率分别为(1.46±0.08)%和(0.12±0.04)%?RT-PCR结果显示:ABCG2基因mRNA在SP细胞亚群中的表达水平是其在非SP细胞亚群中的3.3倍(P < 0.05)?结论:利用LAC中SP细胞亚群具有肺癌干细胞的特性,流式细胞荧光激活分选肺腺癌SP细胞亚群可能是分离肺腺癌干细胞的有效方法?     

神经胶质瘤干细胞样细胞的分离鉴定及其生物学特性初探

目的分选神经胶质瘤C6细胞中的侧群(SP)细胞,探讨其相关生物学特性。方法 Hoechst33342染色流式细胞仪分选SP细胞,另取非侧群(NSP)细胞作为对照。MTT法绘制细胞生长曲线,平板克隆法检测细胞克隆形成能力,无血清悬浮培养观察细胞的球囊形成能力,裸鼠移植瘤实验检测细胞的成瘤能力,流式细胞仪检测细胞CD133的表达。结果神经胶质瘤C6细胞中SP细胞的比例为(4.24±1.36)%。SP细胞的生长速度显著快于NSP细胞(P<0.05)。SP细胞在无血清条件下培养有形成球囊的特性,而NSP细胞无球囊性生长的特性。SP细胞的克隆形成率为(31.24±6.48)%显著高于NSP细胞的(9.63±1.16%)(P<0.01)。103、104、105、106个SP细胞接种裸鼠皮下,成瘤率分别为40.00%、60.00%、80.00%和100.00%,而NSP细胞的成瘤率分别为0、0、60.00%和70.00%,两组之间差异有显著性(P<0.05)。SP细胞CD133表达的量为(61.74±7.32)%显著高于NSP的(1.06±0.81)%(P<0.01)。结论神经胶质瘤中存在SP细胞,SP细胞高表达干细胞标志蛋白CD133,SP细胞分选可以富集神经胶质瘤肿瘤干细胞样细胞。     

分割剂量射线照射富集宫颈癌肿瘤干细胞的研究

【目的】 研究分割剂量射线照射的宫颈癌Hela细胞表达肿瘤干细胞相关蛋白情况及裸鼠体内成瘤能力,探讨经此法富集宫颈癌肿瘤干细胞的可行性。【方法】 Hela细胞分组接受分割剂量分别为2、4、6、8、10及12 Gy的射线照射,总照射剂量24 ~ 42 Gy。流式细胞术检测各照射组及对照组细胞的ABCG2、CD44及CD133表达率;各组细胞接种裸鼠皮下,检测其体内成瘤能力。【结果】 各照射组细胞的ABCG2表达率均明显上调,以Hela-R2组(4 Gy×10次)细胞的表达率最高[(46.89±1.20)%],且随着照射次数的增加而升高(P < 0.05);各组细胞的CD44及CD133表达率变化均无明显趋势;Hela-R2组细胞的裸鼠体内成瘤能力最高,其次为Hela-R5组(10 Gy×3次)。【结论】 分割剂量射线照射可在体外富集宫颈癌肿瘤干细胞,以分割剂量为4 Gy组富集效果最好,诱导Hela细胞株表达ABCG2显著上调,及提高其裸鼠体内成瘤能力。     

人卵巢癌OVCAR3细胞系中侧群细胞的分离及其成瘤性、侵袭性的实验研究

目的  分离卵巢癌细胞系OVCAR3中的侧群(SP)细胞,并观察其成瘤性和侵袭性。 方法  利用流式细胞荧光激活分选法将卵巢癌OVCAR3细胞系分成SP和非侧群(non-SP)细胞两个亚群。对两个亚群细胞分别采用软琼脂克隆形成实验和细胞球形成实验观察其体外成瘤能力;Transwell小室法检测两个亚群细胞的体外侵袭力。  结果  OVCAR3细胞株中外排Hoechst33342的SP细胞占13.1％,加入维拉帕米SP细胞的比例为1.8%。SP细胞的体外克隆形成率为(46.17±23.27)％,non-SP细胞仅为(6.17±3.06)％,SP细胞克隆形成率高于non-SP细胞(P<0.05);细胞球形成实验结果显示,SP细胞能在无血清的培养液中形成细胞球,而non-SP细胞则不能;Transwell侵袭实验结果显示,SP表型细胞穿过Matrigel基底膜的细胞数为(215.9±30.9)个,non-SP表型细胞仅为(60.9±10.5)个。  结论  卵巢癌OVCAR3细胞系中存在外排Hoechst33342荧光染料的SP细胞,其成瘤性、侵袭力均强于non-SP亚群细胞,表明SP表型的肿瘤细胞在卵巢癌的生长、侵袭及转移中具有重要的地位。     

氯胺酮对树突细胞体外分化和成熟的影响

【目的】 观察氯胺酮对树突细胞体外分化和成熟的影响?【方法】 取6 ~ 8周C57BL/6 野生型老鼠(雌雄不限)的骨髓细胞, 在FMS样酪氨酸激酶3(Flt3)配基的作用下诱导分化为树突细胞各种亚型?在培养体系中加入50?100?200 μmol/L的氯胺酮,观察氯胺酮对树突细胞亚型分化比例的影响?同时为了观察氯胺酮对树突细胞成熟的影响, 利用脂多糖刺激树突细胞成熟并检测氯胺酮对树突细胞表面成熟标记分子表达的影响?【结果】 200 μmol/L氯胺酮不明显影响pDc和cDc 的分化比例,在100和200 μmol/L 可以使eCD8+cDc亚群分别降低(20 ± 2.9)%和(25 ± 4.1)%(P < 0.05),而eCD8-cDc亚群则分别升高(25 ± 4.3)%及(39 ± 5.7)%(P < 0.05)?200 μmol/L氯胺酮不影响脂多糖介导的树突细胞成熟分子的表达?【结论】 高浓度的氯胺酮可能通过影响树突细胞亚群分化而影响机体的免疫,但不影响树突细胞体外成熟标志的表达?     

人胃癌细胞系SGC-7901干细胞样细胞的富集与鉴定

【目的】富集/分离人胃癌细胞系SGC-7901干细胞样细胞,并评价其干细胞生物学特性。【方法】分别采用成球条件培养法和流式侧群(SP)细胞分选法分离SGC-7901干细胞样细胞,通过克隆形成实验、体内成瘤实验、化疗耐药实验鉴定SGC-7901细胞球、SP细胞的干细胞特性。【结果】(1)成球条件培养法:在含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、B27、N-2的无血清条件培养基及超低吸附培养板的培养条件下,SGC-7901细胞能够成球悬浮生长,且可连续传代;克隆形成实验结果显示:SGC-7901细胞球克隆数高于SGC-7901细胞;体内成瘤实验显示:裸鼠移植相同数量级的SGC-7901细胞球和SGC-7901细胞,SGC-7901细胞球成瘤率高于SGC-7901细胞;化疗耐药实验结果显示:在相同浓度下,3种化疗药(5-氟尿嘧啶、盐酸多柔比星、顺铂)对SGC-7901细胞球的平均抑制率均低于SGC-7901细胞。(2)侧群分选法:Hoechst33342浓度为2.5μg/mL,SGC-7901细胞SP细胞分选率为4.74%,维拉帕米对照组SP细胞分选率为0.19%,差异显著(P 0.01);克隆形成实验与体内成瘤实验显示:SP与非侧群(non-SP)细胞克隆形成能力与致瘤性无显著性差异(P0.05)。【结论】在超低吸附培养板和无血清条件培养基培养的SGC-7901细胞球具有肿瘤干细胞特性;SGC-7901细胞存在着SP亚群,但其肿瘤干细胞特性不明显。     

放射联合Sorafenib对肝癌细胞的不同时效作用

【目的】 在人肝癌细胞中观察放射联合Sorafenib对细胞生长的作用,并探讨其作用途径?【方法】 选择人肝癌SMMC-7721和BEL-7402细胞株,分为单纯放射组(IR)?放射前30 min联合Sorafenib组(IR + S-pre)和放射24 h后联合Sorafenib组(IR + S-post)?细胞克隆形成实验检测照射后细胞克隆形成率,绘制细胞存活曲线并计算放射增敏比;细胞增殖抑制实验检测6 Gy照射后第1?2?3?4?5?6 d细胞增殖情况;免疫荧光染色观察照射后DNA损伤阳性细胞比例;流式细胞仪检测放射后细胞凋亡比例?【结果】 细胞克隆形成实验结果显示,IR + S-pre放射后细胞克隆形成增加,放射增敏比在SMMC-7721和BEL-7402细胞中分别为0.78和0.88;而IR + S-post放射后细胞克隆形成减少,放射增敏比在SMMC-7721和BEL-7402细胞中分别为1.43和1.23?细胞增殖抑制实验显示IR + S-pre与IR放射后细胞增殖抑制率相似,而IR + S-post放射后细胞增殖抑制率明显提高? Sorafenib在SMMC-7721与BEL-7402中均有诱导细胞凋亡作用?IR + S-pre在放射后24 h细胞凋亡比例明显增高[IR vs IR + S-pre: (6.1 ± 1.0)% vs (18.3 ± 2.0)% (SMMC-7721), (8.2 ± 2.1)% vs (17.0 ± 2.4)%(BEL-7402),P < 0.001]?IR + S-post在放射后48 h细胞凋亡比例明显增高,[IR vs IR + S-post分为(6.9 ± 2.0)% vs (15.9 ± 1.8)%(SMCC-7721), (8.0 ± 1.5)% vs (14.2 ± 2.5)% (BEL-7402),P < 0.05]?放射后30 min,IR + S-pre与IR的DNA受损阳性细胞比例无明显差异?放射后6 h IR + S-pre的DNA受损阳性细胞残留比例明显下降[IR vs IR + S-pre: (59.9 ± 2.4)% vs (23.8 ± 2.9)%(SMMC-7721),(46.4 ± 3.8)% vs (25.0 ± 3.0)%(BEL-7402),P < 0.001]?【结论】 放射联合Sorafenib对肝癌细胞作用具有明显时效性,放射24 h后联合Sorafenib增加放射引起的细胞克隆性生长抑制和增殖抑制,而放射前30 min联合Sorafenib 作用相反     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,检测clusterin(CLU)基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖?迁移和凋亡的影响?【方法】 构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,感染人肾癌786-O细胞株?实验分5组:CLU-RNAi-LV1(KD1)?CLU-RNAi-LV2(KD2)?CLU-RNAi-LV3(KD3)为加入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组,未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组(NC组),肾癌786-O细胞为空白对照组(CON组)?应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别干扰前后CLU mRNA及蛋白表达的变化?用细胞划痕实验?MST-1?流式细胞仪等方法检测CLU沉默后肾癌786-O细胞在增殖?迁移?凋亡等生物学行为的改变?【结果】 成功构建CLU shRNA慢病毒载体clu-RNAi-LV并获得相应慢病毒?Real time-PCR显示不同感染复数CLU-RNAi-LV处理的KD1?KD2?KD3组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调69.4%~96.5%和0?Western blot结果显示KD1?KD2?KD3组CLU蛋白表达水平与CON组相比分别下降35.24%?46.26%和58.91%,KD3能显著抑制786-O细胞中CLU基因的表达?划痕实验显示24 h时 KD3(si-CLU)组细胞迁移相对距离(408.43 ± 25.92)小于NC组(101.35 ± 6.05)和CON组(68.13 ± 6.64,P < 0.05)?WST-1法检测转染后72 h KD3(si-CLU)组细胞生长速度较NC组及CON组明显下降(P < 0.05),各组间差异(P < 0.05),均有统计学意义?流式细胞仪检测KD3(si-CLU)组与NC组?CON组细胞凋亡率分别为(6.23 ± 2.51)%?(1.05 ± 0.30)%和(1.17 ± 0.29)%,KD3(si-CLU)组与NC组?CON组相比凋亡率增加(P < 0.05),差异有统计学意义?肾癌786-O细胞的增殖?迁移受到抑制,而凋亡率增加?【结论】 筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株?CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性CLU基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖?迁移并促进细胞凋亡?     

白杨素对5- 氟尿嘧啶诱导人肝癌Bel-7402 细胞凋亡的增敏机制研究

目的 探讨白杨素对5- 氟尿嘧啶（5-FU）诱导肝癌Bel-7402 细胞凋亡的增敏作用。方法 白 杨素单独或联合5-FU 作用Bel-7402 细胞,用MTT 法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡与周期分 布变化;Western blotting 检测Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白。结果 50 ～ 250μmol/L 白杨 素作用Bel-7402 细胞48 h 呈浓度依赖性的抑制细胞活力,且100μmol/L 白杨素组细胞存活率为（82.261± 7.793）%。100μmol/L 白杨素单独作用24 h 对Bel-7402 细胞活力和凋亡均无影响（P >0.05）。与空白对照 组比较,100μmol/L 白杨素作用24 h 后,不同浓度5-FU（12.5、25.0 及50.0μg/ml）作用48 h 对Bel-7402 细胞活力的抑制作用增强（P <0.05）;25.0μg/ml 5-FU 诱导Bel-7402 细胞凋亡率增加（P <0.05）;G2/M 期 细胞比例升高（P <0.05）;促凋亡蛋白Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平上调（P <0.05）;抗凋亡 蛋白Bcl-2 表达水平下调（P <0.05）。结论 白杨素增强5-FU 诱导人肝癌Bel-7402 细胞凋亡,其机制可能 与线粒体凋亡通路激活有关。     

人宫颈癌侧群细胞的分选及其生物学特性的研究

目的通过人宫颈癌细胞中侧群细胞的富集、分离和鉴定,确定其肿瘤干细胞特性,探讨以侧群细胞作为宫颈癌干细胞研究切入点的可行性。方法收集40例宫颈癌患者的手术标本,通过原代培养、流式细胞荧光激活分选法将宫颈癌细胞分为侧群(side population,SP)细胞和非侧群细胞(non-side population,NSP)2个亚群,观察2组细胞的增生和分化能力,并进行裸鼠接种以观察其成瘤能力,化疗药物顺铂以不同浓度作用于SP细胞和NSP细胞后计算细胞抑制率,以评价2组细胞对化疗药物的耐受性。结果人宫颈癌细胞中侧群细胞的比例约为2.04%±0.93%,侧群细胞的比例随分化程度的降低而下降(P<0.05)。细胞生长曲线(MTT法)显示,SP细胞的体外增生能力明显强于NSP细胞(P<0.05);行裸鼠接种时,SP细胞表现出较强的致瘤性,只需1×103个即可致瘤,其致瘤能力是NSP细胞的100倍,且成瘤时间显著缩短;化疗药物顺铂以不同浓度分别作用于SP细胞与NSP细胞24h后,SP细胞的抑制率明显低于NSP细胞(P<0.05)。结论人宫颈癌细胞中存在外排Hoechst 33342荧光染料的SP细胞,分化越差的肿瘤细胞其SP细胞比例越低。宫颈癌SP细胞体外增生能力和裸鼠成瘤能力均强于NSP细胞,对化疗药物具有较强的耐受性,具备肿瘤干细胞的特性,可作为宫颈癌干细胞研究的切入点。     

mTOR信号通路在神经胶质瘤干细胞样细胞中激活的意义研究

目的 分选神经胶质瘤C6细胞中的侧群(SP)细胞,探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白对神经胶质瘤SP细胞的影响.方法 Hoechst33342染色流式细胞仪分选SP细胞,另取非侧群(NSP)细胞作为对照.荧光定量-PCR和Western blot分别检测mTOR基因和蛋白的表达.化学合成的双链SiRNA沉默mTOR基因的表达.结果 SP和NSP细胞中mTOR基因的2-△Ct值分别为(0.623±0.087)和(0.289±0.046),两者之间差异有显著性(P＜0.01),mTOR蛋白的表达在SP细胞也显著高于NSP细胞.化学合成的靶向SiRNA可以显著下调mTOR的表达(P＜0.01).SiRNA下调mTOR表达后,SP细胞在C6细胞中的比例从5.67±1.46％减少到1.33±0.26％(P ＜0.01).结论 神经胶质瘤SP细胞高表达mTOR,下调mTOR的表达可以减少SP细胞的比例.     

人肺腺癌A549细胞系SP细胞亚群的分选及初步探讨

目的：探讨一种简单有效的分离肺癌干细胞的方法。方法：用免疫组化方法检测人肺腺癌A549细胞系中ABCG2蛋白的表达情况;用流式细胞学方法分选A549细胞系中side population cells（SP细胞）及非SP细胞亚群,并对该两亚群细胞的分化功能进行检测;用RT—PCR方法检测两亚群细胞ABCG2的表达。结果：免疫组化方法检测A549细胞系中ABCG2蛋白的阳性表达率为2％。流式方法成功分选得到SP细胞及非SP细胞亚群,其中SP细胞含量约为A549活细胞总量的1．09％,经拮抗剂Verapamil处理后下降为0．20％,两亚群细胞经培养后重新上机检测,发现SP细胞亚群可产生SP细胞及非SP两种细胞,而非SP细胞只能产生非SP细胞。SP细胞表达ABCG2,非SP细胞则不表达。结论：人肺腺癌A549细胞系SP亚群细胞富集了肺癌干细胞。通过流式细胞仪分选肺腺癌SP细胞亚群是分离肺腺癌干细胞的有效方法。     

人膀胱癌细胞系SW780中侧群细胞的功能鉴定

目的 使用DCV荧光染料从SW780人膀胱癌细胞系中分离侧群细胞（SP细胞）,并观察该侧群细胞是否具有肿瘤干细胞样生物学特征. 方法 SW780细胞体外培养,用DCV荧光染料分析SP细胞比率.分选SP与NSP细胞群落后体外培养扩增.软琼脂克隆集落生成实验比较SP细胞与NSP细胞的体外单克隆生长能力.采用RT-PCR法比较ABCG2、MDR1、Oct-4及Bmi-1等基因表达差异. 结果 SW780细胞的SP比率为1.6％.经体外培养后SP细胞可以产生SP细胞与NSP细胞,NSP细胞只能产生NSP细胞.SP细胞体外单克隆生长率显著大于NSP细胞（P＜0.01）.半定量RT-PCR结果表明SP细胞的ABCG2、MDR1、Oct-4及Bmi-1基因表达显著高于NSP细胞. 结论 流式细胞仪激发DCV荧光染料可从人膀胱癌SW780细胞系中分离出侧群细胞,该侧群细胞具有肿瘤干细胞样生物学特征.     

NOD/SCID小鼠中A431 侧群与非侧群细胞成瘤组织中EMT相关分子的表达

目的旨在分离A431中侧群（SP）细胞及非侧群（NSP）细胞亚群,比较二者在小鼠皮下成瘤能力差异及组织中上皮间质转
化（EMT）相关分子表达。方法培养A431细胞经荧光染料Hoeehst33342染色后,流式细胞仪分选出SP细胞和NSP细胞,接
种到NOD/SCID 小鼠皮下,观察各自成瘤能力,取瘤体组织免疫组织化学染色检测EMT相关分子E-Cadherin、β-catenin、
Vimentin、AXL和Erbb3的表达。结果A431细胞系中成功分选出SP细胞,小鼠皮下成瘤迅速。在SP细胞小鼠成瘤组织周围
细胞中,E-Cadherin、Erbb3表达降低,β-catenin、Vimentin、AXL表达增高。结论A431细胞中含有SP细胞亚群,该亚群细胞具
有较强的肿瘤形成能力,且显示较强的EMT特性。
     

应用SELDI-TOF-MS技术筛选人肝癌细胞多药耐药相关差异表达蛋白

【目的】通过SELDI-TOF-MS技术筛选体外培养人肝癌细胞多药耐药相关差异表达蛋白。【方法】采用体外培养人肝癌细胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶细胞Bel-FU,MTT法检测Bel-FU的多药耐药性;SELDI-TOF-MS技术结合CM-10芯片检测Bel-7402与Bel-FU蛋白质指纹图谱。【结果】细胞Bel-FU对于5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、长春新碱、阿霉素、柔红霉素的耐药指数分别为:89.6倍、3.9倍、37.2倍、16.5倍、3.7倍。在质荷比(M/Z)2 000～50 000的范围内,Bel-FU与Bel-7402间共检测到8个差异蛋白(P<0.05),其中上调蛋白有3个,下调蛋白有5个。【结论】SELDI-TOF-MS技术为筛选肝癌MDR蛋白标志物提供了一个简便、有效的方法。     

人肺腺癌细胞系SPCA1边缘细胞亚群的初步分析

目的检测和分选人肺腺癌细胞系SPCA1中的边缘细胞,并对其表面标志进行初步分析。方法用流式细胞仪检测和分选SPCA1中的边缘细胞和主群细胞,并用细胞免疫化学和激光共聚焦检测ABCG2和CD133在SPCA1中的表达。结果边缘细胞亚群占SPCA1细胞的0.7%,维拉帕米阻断后减少至0.0%。细胞免疫化学结果显示ABCG2和CD133在SPCA1的边缘细胞中高表达,而在未分选的SPCA1细胞和主群细胞中则低表达。结论人肺腺癌细胞系SPCA1中存在边缘细胞,提示肺癌干细胞的存在。     

3-methyladenine抑制自噬诱导胰腺癌细胞SW1990失巢凋亡

【目的】 探讨3-methyladenine(3-MA)对人胰腺癌SW1990细胞增殖?迁移及失巢凋亡的影响作用及其机制?【方法】 以胰腺癌细胞SW1990及永生化胰腺导管上皮细胞H6C7为研究对象,设3-MA处理组及PBS对照组,采用软琼脂克隆培养法及Poly-HEMA悬浮培养法筛选抵抗失巢凋亡的细胞?Annexin V-FITC/PI双染和TUNEL试剂盒法检测细胞凋亡;免疫荧光法及透射电镜检测细胞自噬;CCK-8法检测细胞增殖; Transwell小室检测细胞迁移能力?【结果】永生化胰腺导管上皮细胞H6C7处理组及对照组均无集落形成,胰腺癌细胞SW1990处理组形成(2.3 ± 2.63)个集落,对照组形成(9 ± 3)个,与H6C7 相比,SW1990具有较强的抵抗失巢凋亡的能力 (P < 0.05)?3-MA可抑制胰腺癌SW1990细胞自噬(P < 0.05)并抑制其增殖及迁移能力(P < 0.01)且诱导失巢凋亡(P < 0.01)?【结论】 3-MA可诱导胰腺癌细胞SW1990失巢凋亡,其机制可能与细胞自噬受抑有关?