慢病毒介导RNA干扰Clusterin基因表达载体的构建及其在肾癌786-O与ACHN细胞系中的表达

目的:应用慢病毒介导的RNA干扰技术,建立Clusterin(CLU)基因稳定干扰的人肾癌细胞系,为CLU基因的功能研究奠定基础.方法:以人CLU mRNA编码序列作为干扰靶点,与pGCSIL-GFP载体连接真核表达载体.另外构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒.利用包装细胞293T获得重组慢病毒,分别感染人肾癌786-O细胞株及ACHN细胞株.应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别CLU表达的变化.结果:成功构建CLU shRNA慢病毒载体CLU-RNAi-LV并获得相应的慢病毒,病毒悬液滴度＞4×1011TU/L.Real Time-PCR、Western blot结果显示干扰组CLU mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低.结论:慢病毒介导的CLU基因干扰能稳定有效地表达于肾癌细胞,筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株.     

shRNA 沉默YAP基因对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨慢病毒干扰载体沉默Yes-相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法：用细胞免疫荧光法检测肾癌786-O细胞中YAP蛋白表达情况;构建针对YAP基因的shRNA慢病毒干扰载体转染786-O细胞。RT-PCR和Western blot分别检测干扰786-O细胞前后 YAP mRNA及蛋白的表达情况;CCK-8（cell counting kit-8）法检测沉默YAP后细胞增殖的改变;流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡和周期的变化。结果：786-O细胞中YAP蛋白表达于细胞浆和细胞核;shRNA-YAP慢病毒干扰载体转染4 d后,可明显下调786-O细胞YAP mRNA及蛋白表达水平（P=0.000）,并且明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡（P=0.000）;细胞周期紊乱,G1 期细胞明显增加,S期细胞明显降低（P=0.000）。结论：YAP-shRNA慢病毒干扰载体能有效抑制YAP基因在786-O细胞中表达,进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。     

靶向Cdc6 RNAi抑制舌癌CAL-27细胞的增殖

 【目的】 应用RNA干扰技术,靶向抑制舌癌细胞中Cdc6的表达,观察舌癌细胞增殖、凋亡等改变,初步探讨下调Cdc6表达抑制舌癌细胞增殖的分子机制。【方法】 实验分4组:空白对照组CON,阴性对照组NC,实验组KD1和KD2。应用前期构建的Cdc6的慢病毒载体,转染舌癌CAL-27细胞,通过Real time RT-PCR和Western blot法检测Cdc6 mRNA及蛋白的表达;以MTT法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线;利用流式细胞仪观察细胞凋亡。【结果】 慢病毒载体转染CAL-27细胞后,Real time RT-PCR和Western blot实验结果显示:舌癌CAL-27细胞中Cdc6的表达明显被抑制,相对NC组,KD1、KD2组对Cdc6基因敲减效率分别为55.60%和64.38%。蛋白表达分别降低44.44%和66.67%;细胞生长曲线表明,细胞生长明显减缓,KD1和KD2组细胞生长抑制率分别为33.68%和35.79%;流式细胞仪检测细胞周期显示:KD1组、KD2组两组细胞凋亡率较NC组均有显著上升,分别为57.55%和83.81%。【结论】 靶向Cdc6慢病毒载体RNA干扰能有效抑制舌癌CAL-27细胞的DNA复制,阻止舌癌细胞的增殖。     

siRNA沉默PTP4A1表达对人舌鳞癌细胞系TCA8113体内外生物学行为的影响

目的 探讨特异性沉默人舌鳞癌细胞系TCA8113中PTP4A1基因的表达,并研究沉默该基因表达后对TCA8113细胞体内外生物学行为的影响.方法 采用siRNA的慢病毒载体siRNA-PTP4A1作为阳性干扰组(KD),空病毒载体作为阴性对照组(NC),未作任何处理的TCA8113细胞作为空白对照组(CON).Real-time PCR和Westem blot检测PTP4A1基因的干扰效果,MTT法检测3组细胞的增殖能力,流式细胞技术分析3组细胞凋亡和细胞周期情况,平板克隆形成实验检测体外克隆形成能力,Western blot分别检测3组细胞抑制凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax的表达情况,3组细胞分别裸鼠成瘤后观察移植瘤的生长情况.结果 siRNA-PTPA1转染TCA8113细胞成功,Real-time PCR和Western blot 检测PTP4A1基因的抑制率达到55％和60％以上(P ＜0.05);MTT结果显示KD组细胞增殖能力小于NC、CON组;细胞凋亡率也明显增加,KD组早期凋亡为(17.48 ±0.70)％,而NC、CON组的早期细胞凋亡率为(7.34±0.70)％和(4.86±0.25)％ (P ＜0.01);KD组细胞周期阻滞在G1/G0和S期(P＜0.05);Western blot结果显示Bcl-2蛋白表达降低(P＜0.01),Bax蛋白表达增高(P＜0.01);KD组体外克隆形成数小于NC、CON组(P＜0.01);KD组裸鼠移植瘤的生长速度缓慢,质量和体积均小于NC、CON组(P＜0.0l).结论 siRNA PTP4A1在体内外均能有效抑制舌鳞癌TCA8113细胞的恶性生物学行为,PTP4A1基因可能与舌鳞癌的发生、发展相关.     

uPAR在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的功能及机制

【目的】 采用RNA干扰(RNAi)技术阻断类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)基因的表达,探讨uPAR基因沉默后对RA-FLS功能产生的影响及有关机制?【方法】 收集行关节置换术或滑膜清理术的RA患者的滑膜组织,组织块法培养RA-FLS?通过阳离子脂质体转染的方法,转染体外合成的特异性uPAR-siRNA;利用荧光定量PCR法和Western blotting法检测uPAR沉默效果;CCK8法检测细胞增殖抑制率;流式细胞技术检测细胞周期改变;Transwell趋化小室测定细胞的迁移能力;Western blotting技术分析沉默uPAR基因对RA-FLS中PI3K/AKT通路的影响?【结果】 uPAR-siRNA能有效阻断RA-FLS中uPAR基因在mRNA和蛋白水平上的表达?沉默uPAR基因后,细胞48?72?96 h增殖抑制率分别为(17.51 ± 2.27)%?(28.62 ± 4.82)%?(22.91 ± 5.78)%,显著高于对照组(P < 0.05);uPAR-siRNA干扰后,被阻滞于G0/G1期的细胞增加,而S和G2/M期的细胞减少;Transwell趋化小室结果显示:与对照组相比,特异性干扰组的RA-FLS迁移细胞数(35 ± 11)相比空白对照组(138 ± 21)和NC-siRNA组(136 ± 19)明显减少(P < 0.05);转染后的RA-FLS相对于对照组,PI3K?AKT?GSK3β的磷酸化水平显著降低(P < 0.05)?【结论】 uPAR在RA-FLS的增殖?周期及迁移中起重要作用,这可能与其对PI3KAKT通路的激活有关?     

3-methyladenine抑制自噬诱导胰腺癌细胞SW1990失巢凋亡

【目的】 探讨3-methyladenine(3-MA)对人胰腺癌SW1990细胞增殖?迁移及失巢凋亡的影响作用及其机制?【方法】 以胰腺癌细胞SW1990及永生化胰腺导管上皮细胞H6C7为研究对象,设3-MA处理组及PBS对照组,采用软琼脂克隆培养法及Poly-HEMA悬浮培养法筛选抵抗失巢凋亡的细胞?Annexin V-FITC/PI双染和TUNEL试剂盒法检测细胞凋亡;免疫荧光法及透射电镜检测细胞自噬;CCK-8法检测细胞增殖; Transwell小室检测细胞迁移能力?【结果】永生化胰腺导管上皮细胞H6C7处理组及对照组均无集落形成,胰腺癌细胞SW1990处理组形成(2.3 ± 2.63)个集落,对照组形成(9 ± 3)个,与H6C7 相比,SW1990具有较强的抵抗失巢凋亡的能力 (P < 0.05)?3-MA可抑制胰腺癌SW1990细胞自噬(P < 0.05)并抑制其增殖及迁移能力(P < 0.01)且诱导失巢凋亡(P < 0.01)?【结论】 3-MA可诱导胰腺癌细胞SW1990失巢凋亡,其机制可能与细胞自噬受抑有关?     

腺病毒重组人白细胞介素24对肾癌细胞株786-O 细胞生长和凋亡的影响

目的探讨腺病毒重组人白细胞介素24(IL-24)对肾癌细胞株786-O细胞的生长和凋亡的影响。方法将培养的肾癌细胞株786-O细胞随机分为空白对照组、阴性对照组(转染腺病毒重组人IL-24对照组)及实验组(转染腺病毒重组人IL-24组)。取对数生长期肾癌细胞株786-O,构建腺病毒重组人IL-24及对照并转染至肾癌细胞株786-O实验组细胞及阴性对照组细胞。使用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测肾癌细胞株786-O生长能力;采用流式细胞术检测肾癌细胞株786-O凋亡情况;应用Western Blot检测肾癌细胞株786-O中MMP-9蛋白的表达水平。结果实验组肾癌细胞株786-O细胞增殖能力低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组肾癌细胞株786-O细胞表面磷脂酰丝氨酸表达水平高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组肾癌细胞株786-O细胞中MMP-9蛋白表达水平低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与阴性对照组肾癌细胞株786-O细胞增殖能力、细胞膜表面磷脂酰丝氨酸表达水平、MMP-9蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论转染腺病毒重组人IL-24可抑制肾癌细胞株786-O细胞的生长并诱导细胞凋亡,腺病毒重组人IL-24可能通过下调MMP-9诱导肾癌细胞株786-O细胞的凋亡。     

siRNA干扰BIRC6对肾癌786-O细胞凋亡和自噬的影响

目的 研究杆状病毒IAP重复序列蛋白6（BIRC6）在肾癌组织中的表达,并探讨BIRC6沉默对786-O细胞凋亡和自噬的影响。方法 收集2016年2月~2018年12月梅州市人民医院肾癌手术切除标本20例,通过免疫组化检测BIRC6蛋白在肾癌组织中的表达水平。将肾癌786-O细胞分为两组,对照siRNA组和BIRC6 siRNA组;通过lipofectamine 2000将BIRC6小干扰RNA（BIRC6-siRNA）及其对照siRNA（con-siRNA）转染到肾癌786-O细胞,Western blot检测转染后BIRC6蛋白表达水平,CCK8和流式细胞术分别检测BIRC6-siRNA和5-FU人肾癌786-O细胞活力和凋亡的影响,Western blot检测细胞自噬相关蛋白Beclin和LC3A/B的表达水平。结果 免疫组化结果显示BIRC6蛋白在肾癌组织中的表达显着高于正常肾组织,转染BIRC6-siRNA后786-O细胞的BIRC6蛋白表达水平显著降低。12.5、25、50、100和200 μg/mL的5-FU诱导786-O细胞后,BIRC6-siRNA组细胞增殖抑制率显著高于con-siRNA组,差异具有统计学意义（P<0.01）;流式检测结果显示,BIRC6-siRNA组肾癌786-O细胞凋亡率显著高于con-siRNA组,差异具有统计学意义（P<0.01）;BIRC6-siRNA组肾癌786-O细胞Beclin和LC3A/B蛋白表达显著低于con-siRNA组。结论 siRNA干扰BIRC6能够抑制肾癌786-O细胞自噬,促进5-FU诱导的细胞凋亡,促进肾癌786-O细胞对5-FU的敏感性。     

慢病毒介导shRNA特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1基因表达抑制舌癌细胞迁移侵袭能力

目的：探讨特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1（phosphatase of regenerating liver cell-1,PRL-1）基因表达对舌癌细胞迁移、侵袭能力的影响。方法：设计、合成5条针对PRL-1基因的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）干扰序列,构建于慢病毒载体质粒中,PCR电泳及基因测序验证。转染293T细胞,Western blot筛选最佳干扰序列,包装产生慢病毒。转染TCA8113细胞,筛选、建立稳定转染细胞株;real-time PCR检测PRL-1基因沉默效率;划痕实验和Transwell实验分别比较慢病毒转染细胞（KD组）、空病毒转染细胞（NC组）及TCA8113细胞（CON组）迁移、侵袭能力变化。结果：PCR电泳及基因测序证实5条shRNA序列定向插入慢病毒载体质粒中。Western blot筛选出PRL-1-shRNA-1基因沉默效率最高,包装获得慢病毒滴度为 7×108 TU/ml。通过转染、筛选,建立了TCA8113细胞稳定转染细胞株;real-time PCR测得PRL-1基因mRNA表达明显下降（F=809.120,P=0.000）;PRL-1基因沉默后细胞迁移能力降低,穿过人工基底膜的细胞数KD组（25.5±0.4）明显少于NC组（81.5±2.0）和CON组（88.5±2.3）（F=1 092.970,P=0.000）。结论：沉默PRL-1基因表达能有效抑制舌癌细胞迁移、侵袭能力。     

重组腺病毒Ad-PTEN对肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察携带野生型PTEN基因的重组腺病毒Ad-PTEN介导786-O细胞中PTEN的表达,以探讨其对癌细胞增殖和迁移的抑制以及诱导细胞凋亡的作用。方法:将构建的重组腺病毒Ad-PTEN体外感染786-O细胞,荧光显微镜下观察感染效率;免疫印迹检测细胞中PTEN的表达;MTT实验观察其对细胞增殖的影响作用;细胞划痕实验观察其对细胞迁移的抑制;PI染色观察其对细胞凋亡的诱导作用。结果:以MOI为100的病毒量感染细胞后48 h,感染效率达到100%;感染病毒后,细胞可检测到PTEN蛋白的表达,细胞的增殖和迁移均受到抑制,细胞被诱导出现凋亡。结论:重组腺病毒Ad-PTEN可高效介导786-O细胞表达PTEN,并产生抑制细胞增殖和迁移以及诱导细胞凋亡作用,为肾癌的基因治疗提供理论基础。     

姜黄素对肾癌786-O细胞增殖及凋亡的实验研究

目的观察姜黄素对肾癌786-O细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP蛋白)表达水平以及细胞凋亡的影响,研究姜黄素对肾癌细胞的生长抑制作用并探讨其分子机制,进一步揭示姜黄素对肾癌的治疗作用。方法不同浓度姜黄素作用人肾癌786-O细胞24、48、72 h后,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测姜黄素对人肾癌786-O细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测姜黄素诱导细胞的凋亡率;免疫细胞化学检测姜黄素对786-O细胞HIF-1α和XIAP表达的影响。结果姜黄素对人肾癌786-O细胞有明显的抑制作用,可引起细胞凋亡,并且存在剂量和时间依赖;不同浓度姜黄素作用细胞48 h后,HIF-1α和XIAP蛋白表达量下降。结论姜黄素通过下调HIF-1α和XIAP的表达抑制人肾癌786-O细胞的增殖,诱导人肾癌786-O细胞的凋亡。     

PDE5基因沉默对肾透明细胞癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨PDE5基因对肾透明细胞癌细胞株786-O细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计、合成PDE5 siRNA序列,按照HiPerFect转染试剂盒操作手册转染786-O细胞.采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)和Western blot法检测转染后PDE5 基因的表达,通过WST-1法检测细胞增殖情况,caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性.结果 与空白对照组和阴性对照组相比较,PDE5 siRNA转染组的mRNA及蛋白表达水平显著降低,786-O细胞增殖能力明显受到抑制,caspase-3活性明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论 siRNA干扰PDE5基因表达可抑制肾透明细胞癌细胞株786-O细胞的增殖并促进凋亡.     

应用RNAi技术沉默survivin基因对肾癌786-O细胞的影响

目的 运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特异性阻断肾癌786-O细胞系中survivin基凶的表达,并研究survivin沉默后对786-O细胞的影响.方法 用真核转录载体pcDNA~(TM)6.2-GW/EmGFPmiR构建针对survivin基因的干扰载体,用脂质体法转染肾癌786-O细胞,通过RT-PCR、免疫组化分别检测survivin基因的mRNA和蛋白水平的表达,MTT法检测细胞生长的影响.结果 干扰载体有效地阻断了786-O细胞中survivin基因在mRNA与蛋白水平上的表达,细胞活性受到抑制.结论 RNAi技术沉默survivin基因可以下调肾癌786-O细胞survivin基因的表达,抑制细胞的活性.     

反义硫代寡核苷酸对786-O细胞survivin基因的表达及生长抑制作用

目的研究survivin反义寡核苷酸对肾透明细胞癌786O细胞表达survivin蛋白、细胞凋亡、增殖的影响。方法设计并合成特异性靶向survivin的反义寡核苷酸(ASODN)。肾透明细胞癌细胞株786O分为6组:空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组、200、400和600nmol/LASODN转染组。作用24h后收获各组细胞。倒置显微镜及透射电子显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测各组细胞survivin表达情况和流式细胞术检测各组细胞周期变化和凋亡指数,MTT法检测survivin反义寡核苷酸对各组细胞的生长抑制率。结果电镜下可以见到典型凋亡样改变,而各对照组细胞生长良好;各ASODN转染组细胞survivin表达有不同程度减弱;各ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P<0.05),以600nmol/LASODN转染组最为明显(P<0.05),而各对照组间差异无显著性(P>0.05)。结论不同浓度survivinASODN转染后能下调survivin蛋白表达,诱导肾透明细胞癌786O细胞凋亡,抑制786O细胞增殖。     

番茄红素体外抗肿瘤作用实验研究

目的:研究番茄红素体外抑制肿瘤的可能机制。方法 :采用体外细胞培养技术观察番茄红素对人宫颈癌细胞 (Hela)、人肝癌细胞 (QGY- 770 3,Q3)、人肾癌细胞 (786 - O) 3种细胞系细胞凋亡及突变型 p5 3蛋白表达的影响。 结果 :吖啶橙荧光染色后未发现 3种癌细胞 (Hela、Q3、786 - O)有典型凋亡现象 ,Hoechst332 5 8荧光染色后在所试 2种癌细胞 (Hela、786 - O)中无典型凋亡现象。利用 DNA琼脂糖凝胶电泳技术检测细胞凋亡未见 3种 DNA移动呈“梯形”条带。受试物对 Hela、786 - O2种细胞突变型 p5 3蛋白表达的检测与未加受试物的空白对照相比未显示出明显变化。 结论 :番茄红素在体外对所试 3种癌细胞的抑制生长作用可能与促细胞凋亡无关 ,该作用也不是通过抑制突变型 p5 3蛋白表达途径实现的。     

肝癌细胞株Bel-7402中侧群细胞的分离和致瘤能力

【目的】 分选肝癌Bel-7402细胞中的侧群(SP)细胞并分析其生物学特性?【方法】 采用流式细胞荧光激活分选(FACS)技术将Bel-7402细胞分为SP细胞和非侧群(NSP) 细胞2亚群?实验分组:SP组与NSP组?细胞生长曲线法和平板克隆法比较SP细胞和NSP细胞的增殖能力和克隆形成能力;RT-PCR法检测SP细胞和NSP细胞的CD133?三磷酸腺苷结合盒转动蛋白G2(ABCG2)表达;流式细胞术分析细胞凋亡率;无血清培养法检测SP细胞及NSP细胞成球率;非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内成瘤实验比较SP细胞和NSP细胞的致瘤性?【结果】 Bel-7402细胞中分选出的SP细胞比例为(2.4 ± 0.0)%?生长曲线表明SP细胞的增殖速度快于NSP细胞(P < 0.05)?SP?NSP细胞的克隆形成率分别为(20.5 ± 2.6)%?(5.1 ± 0.9)%,两者差异明显(P < 0.05)?SP细胞ABCG2 mRNA和CD133 mRNA平均表达水平分别是NSP细胞的3.03倍(P < 0.01)和1.98倍(P < 0.01)?SP细胞凋亡率为(0.89 ± 0.23)%,低于NSP细胞 (P < 0.05)?在无血清培养基中,SP细胞成球率为(14.1 ± 1.9)%,高于NSP细胞(P < 0.05)?1 × 103?104?105数量的SP细胞形成皮下移植瘤(P > 0.05,P < 0.05,P < 0.05),而1 × 105 NSP细胞则还不能成瘤?【结论】 肝癌 Bel-7402细胞中的SP细胞可能富集了肝癌干细胞?