猪naive-like诱导性多能干细胞系的建立及红色荧光蛋白标记

目的：建立猪naive-like诱导性多能干(induced pluripotent stem,iPS)细胞系,并对其进行红色荧光标记,为通过示踪猪naive iPS细胞发育和分化的相关研究奠定基础。方法：首先利用核转染技术向巴马小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast,PEF)中转入鼠源OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转录因子表达载体TetO-FUW-OSKM,并同时转入激活表达载体FUW-M2rtTA,采用白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)结合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的培养体系进行培养,通过在培养液中添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX) 进行诱导,建立起猪iPS细胞系,并对细胞系的多能性进行鉴定。在此基础上,向iPS细胞系转入红色荧光蛋白表达载体,对其进行标记,并鉴定被红色荧光标记后的细胞是否仍然具有多能性。结果：所建立的iPS细胞系克隆呈三维立体生长,可以进行单细胞传代培养至30代以上,核型正常,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达多种干细胞多能因子,利用LIF/STAT3信号通路维持其增殖,体外可分化形成表达三胚层相关基因的类胚体,为猪naive-like iPS细胞系。成功对所建立的iPS细胞系进行红色荧光标记,碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色结果显示被红色荧光标记的iPS细胞的多能性依然存在。结论：成功建立了稳定表达红色荧光蛋白的猪naive-like iPS细胞系。     

建立稳定表达猪LIF蛋白的小鼠STO细胞系

目的:在STO小鼠成纤维细胞中表达猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),并尝试使用其作为饲养层培养大鼠诱导多能性干细胞(iPS细胞)?方法:通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体pCAG-pLIF转染至小鼠STO细胞中,获得能够稳定表达猪LIF的转基因STO细胞(STO-pLIF细胞)?通过RT-PCR?qPCR?Western blot等方法检测STO-pLIF细胞中猪LIF基因的表达量,选择高效表达猪LIF的STO-pLIF细胞作为饲养层,培养大鼠iPS细胞?通过生长曲线检测?碱性磷酸酶染色?干细胞多能因子的RT-PCR和免疫荧光染色等方法,检验STO-pLIF细胞饲养层在大鼠iPS细胞培养方面的功能?结果:STO-pLIF细胞中LIF RNA和蛋白表达水平均上调(P < 0.05),而该细胞系作为饲养层所培养的大鼠iPS细胞在形态?多能性因子表达方面更接近于传统培养的大鼠iPS细胞,与无外源添加LIF所培养的大鼠iPS存在差异(P < 0.05)?结论:成功获得了稳定表达猪LIF基因的STO-pLIF细胞,并证明该细胞作为饲养层在大鼠iPS细胞培养中具有一定优势?     

多基因修饰小鼠诱导多潜能干细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的观测胰岛素转录关键调控因子胰腺十二指肠同源框蛋白1(PDX-1)、神经分化因子1(NeuroD1)及肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(MafA)对小鼠诱导多潜能干细胞(iPS细胞)分化为胰岛素分泌细胞的作用。方法筛选鉴定小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程的iPS细胞。以重组腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD1-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP联合感染小鼠iPS细胞,体外培养后以RT-PCR检测胰岛B细胞功能基因表达;免疫荧光检测胰岛素蛋白表达及定位;ELISA检测不同糖浓度(0、5、10、20、30、40mmol/L)下胰岛素的分泌量。结果起源于MEFs的iPS细胞能形成边缘光整的致密克隆,表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织,显示MEFs被成功地重编程为iPS细胞。Ad-PDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP感染的小鼠iPS细胞能分化为胰岛类B细胞,RT-PCR结果显示其胰岛B细胞功能基因的表达与小鼠胰岛B细胞株MIN6相似。免疫荧光检测可见胰岛类B细胞内有胰岛素表达。ELISA检测结果显示胰岛类B细胞对不同浓度葡萄糖有较好的反应性。结论胰岛素转录关键调控因子PDX-1、NeuroD1和MafA三者能协同作用,使小鼠iPS细胞分化为具有显著胰岛素合成和分泌能力的胰岛素分泌细胞。     

小鼠牙乳头间充质细胞自发牙向分化及相关基因表达分析

目的观察小鼠牙乳头间充质细胞在血清培养基中的自发牙向分化,并对其特异性牙向和骨向分化的相关转录因子的基因表达进行分析。方法获取孕16.5 d(E16.5 d)胎鼠的原代牙乳头间充质细胞,分别在含血清培养基和添加白血病抑制因子(LIF)的血清培养基中传代培养,观察细胞是否出现成牙本质细胞表型分化,并检测牙向分化表型和维持未分化表型的细胞的特异性转录因子的mRNA表达情况。结果单纯血清培养基培养的牙乳头间充质细胞可在第4代后自发分化为成牙本质细胞表型;而添加106U/L LIF的含血清培养基,可使小鼠牙乳头间充质细胞的未分化表型稳定至第9代。无论细胞是否出现牙向分化,表现成牙间充质细胞特性的Msx1/Msx2、Pax9、Lhx6/Lhx7均有表达;而成牙本质细胞表型分化后尚能检测到DSPP、Sox9、Cbfα1、Osx等启动向矿化组织细胞终末分化的特异性基因表达。结论牙乳头间充质细胞的自发牙向分化模型可作为诱导其他成体间充质干细胞牙向分化时的阳性对照,其基因表达模式可为研究其他成体干细胞牙向分化后在基因水平上的变化提供佐证。     

小鼠牙乳头间充质细胞自发牙向分化及相关基因表达分析

目的观察小鼠牙乳头间充质细胞在血清培养基中的自发牙向分化，并对其特异性牙向和骨向分化的相关转录因子的基因表达进行分析。方法获取孕16．5d（E16．5d）胎鼠的原代牙乳头间充质细胞，分别在含血清培养基和添加自血病抑制因子（LIF）的血清培养基中传代培养，观察细胞是否出现成牙本质细胞表型分化，并检测牙向分化表型和维持未分化表型的细胞的特异性转录因子的mRNA表达情况。结果单纯血清培养基培养的牙乳头间充质细胞可在第4代后自发分化为成牙本质细胞表型；而添加10^6 U／L LIF的含血清培养基，可使小鼠牙乳头间充质细胞的未分化表型稳定至第9代。无论细胞是否出现牙向分化，表现成牙间充质细胞特性的Msx1／Msx2、Pax9、Lhx6／Lhx7均有表达；而成牙本质细胞表型分化后尚能检测到DSPP、Sox9、Cbfα1、Osx等启动向矿化组织细胞终末分化的特异性基因表达。结论牙乳头间充质细胞的自发牙向分化模型可作为诱导其他成体间充质干细胞牙向分化时的阳性对照，其基因表达模式可为研究其他成体干细胞牙向分化后在基因水平上的变化提供佐证。     

诱导性建立多能干细胞系

目的建立多能干细胞系,并鉴定其是否具有正常于细胞的特性。方法将原代皮肤标本用胶原酶消化处理,利用成纤维细胞培养基进行培养,然后感染病毒。对挑选的人成体细胞来源的iPS克隆进行扩大培养,并对克隆进行免疫荧光检测和lit-PCR检测,确定表达的分子标志,采用体外三胚层分化来鉴定其生物学特性。结果所获得的iPS细胞经鉴定具有碱性磷酸酶活性。并表达Nanog、SSEA-4、Sox2、TRA-1-60等干细胞特异标记物,可形成拟胚体并在体内外可以分化为三胚层的细胞类型。结论成功建立了iPS细胞系,为今后的研究提供了良好的细胞模型。     

重编程人皮肤成纤维细胞为iPS细胞的研究

目的探讨高效建立人多能性细胞的方法。方法利用经典的Yamanaka方法及Oct4病毒的重复感染,诱导人皮肤成纤维细胞为诱导的多能性干(iPS)细胞。通过AKP染色及分化能力,验证其多潜能特性。结果通过Oct4病毒的重复感染,将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞;所建立的iPS细胞AKP染色阳性,免疫缺陷裸鼠的皮下获得了含三胚层结构的畸胎瘤。结论通过Oct4病毒的重复感染,成功的将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞。     

类胚体中残留细胞分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子的关系

目的 研究小鼠胚胎干细胞体外类胚体分化后残留未分化细胞的分化能力,探讨其分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子（LIF）的关系。方法 小鼠R1胚胎干细胞体外经20 d的类胚体诱导分化后,胰酶消化为单细胞悬液,在不含LIF的DMEM培养液中贴壁培养。扩增后的细胞用流式细胞仪分析未分化及分化表面标志（CD9、SSEA1和Flk-1）的表达情况。分别于再次类胚体诱导分化前后,RT-PCR检测Oct-4、Nanog、Rex1、FGF5、Nestin、Brachyury、Flk-1和GATA6表达。将扩增后的残留细胞注射至裸鼠皮下,检测畸胎瘤形成能力。Oct-4/GFP 转基因小鼠胚胎干细胞在半固体培养基上作单细胞分化,20 d后统计分化残留率。结果 在不含LIF的DMEM培养液中的残留细胞呈克隆样生长,表达未分化胚胎干细胞标志CD9、SSEA1、Oct-4、Nanog和Rex1。残留细胞体外可再次诱导分化,表达3个胚层的分化标志。残留细胞裸鼠皮下注射6周后形成畸胎瘤。单细胞分化实验表明,常规培养的小鼠胚胎干细胞中约14%的细胞具有分化残留能力。结论 残留胚胎干细胞全能性维持不依赖外源性白血病抑制分化因子;常规培养的胚胎干细胞仅部分具有残留能力。     

类胚体中残留细胞分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子的关系

目的 研究小鼠胚胎干细胞体外类胚体分化后残留未分化细胞的分化能力,探讨其分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子(LIF)的关系.方法 小鼠R1胚胎干细胞体外经20 d的类胚体诱导分化后,胰酶消化为单细胞悬液,在不含LIF的DMEM培养液中贴壁培养.扩增后的细胞用流式细胞仪分析未分化及分化表面标志(CD9、 SSEA1和Flk-1)的表达情况.分别于再次类胚体诱导分化前后,RT-PCR检测Oct-4、 Nanog、Rex1、FGF5、Nestin、Brachyury、Flk-1和GATA6表达.将扩增后的残留细胞注射至裸鼠皮下,检测畸胎瘤形成能力.Oct-4/GFP 转基因小鼠胚胎干细胞在半固体培养基上作单细胞分化,20 d后统计分化残留率.结果 在不含LIF的DMEM培养液中的残留细胞呈克隆样生长,表达未分化胚胎干细胞标志CD9、SSEA1、Oct-4、Nanog和Rex1.残留细胞体外可再次诱导分化,表达3个胚层的分化标志.残留细胞裸鼠皮下注射6周后形成畸胎瘤.单细胞分化实验表明,常规培养的小鼠胚胎干细胞中约14%的细胞具有分化残留能力.结论 残留胚胎干细胞全能性维持不依赖外源性白血病抑制分化因子;常规培养的胚胎干细胞仅部分具有残留能力.     

Cdyl基因敲除的小鼠诱导多能干细胞系的建立及鉴定

【目的】 建立Cdyl 基因敲除的小鼠诱导多能干细胞系(iPSC)。【方法】 通过组织块贴壁法培养Cdyl-/-的胚胎成纤维细胞(MEF)。将pMx-Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4和hrGFP五种质粒分别转染Plat-E细胞,收集病毒上清,感染Cdyl-/- MEF获得Cdyl-/- iPSC,并对Cdyl-/- iPS细胞的分子标记及体内外分化能力进行检测。【结果】 取Cdyl-/-胎鼠皮肤,培养得到增殖旺盛的Cdyl-/- MEF。成功包装逆转录病毒并感染Cdyl-/-MEF,得到胚胎干细胞样的Cdyl-/- iPS细胞。该细胞表达AKP、Oct3/4、SSEA-1,在体内外可以分化为三胚层的细胞类型。【结论】 Cdyl-/- iPS细胞具有自我更新和多向分化能力的特性。Cdyl-/- iPS细胞系的建立为研究Cdyl在小鼠早期胚胎发育中的功能提供一个良好的细胞模型。     

Reprogramming of adult human neural stem cells into induced pluripotent stem cells

Background Since an effective method for generating induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human neural stem cells (hNSCs) can offer us a promising tool for studying brain diseases,here we reporte...     

Induced pluripotent stem cells and hepatic differentiation

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are generated by reprogramming somatic cells to a pluripotent state by the introduction of specific factors. They can be generated from cells of different origins, such as fibroblasts, keratinocytes, hepatocytes, and blood. iPSCs are similar to embryonic stem cells (ESCs) in several aspects, such as morphology, expression of pluripotency markers, and the ability to develop teratoma that contains tissue from three germ layers. In addition, iPSCs can undergo tridermal differentiation, including hepatic specific lineages. Considering that iPSCs could be a source of hepatocyte regeneration, iPSC-based therapy has been widely implicated in the treatment of liver disease and hepatic regeneration. In the present review, we discuss the therapeutic potential of iPSCs in hepatic repair and focus on the clinical applications of iPSCs.     

诱导性多潜能干细胞滋养层制备条件的实验研究

目的制备小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblasts,MEFs）滋养层,用于诱导性多潜能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs）的体外培养。方法取13.5～15.5天胎龄的胎鼠,采用组织消化法分离原代培养成纤维细胞,对MEFs的生长形态、生长曲线进行观察。采用10μg/ml丝裂霉素C预处理P2～P3代MEFs 2～3h制备出细胞滋养层,在该滋养层上进行iPSCs培养,观察iPSCs的集落生成情况,并行碱性磷酸酶细胞染色。结果 MEFs经丝裂霉素C预处理后细胞既不增殖,也不会死亡,仍保持分泌多种生长因子的能力。iPSCs在MEFs滋养层上生长良好,类似于胚胎干细胞一样能形成＂鸟巢＂状集落,并可维持iPSCs正常形态,抑制其分化而不影响活力,碱性磷酸酶染色阳性。结论利用诱导性多潜能干细胞滋养层方法制备的细胞滋养层,能有效支持iPSCs的生长,为进一步开展iPSCs的研究提供了理论依据和实验基础。     

小鼠胚芽干细胞的分离与培养

目的：探讨胚芽干细胞的提取、培养和体外扩增的最佳条件;筛选胚芽干细胞在体外培养中的活力最佳时期。方法：分离受精11d小鼠生殖腺嵴,经消化制备成胚芽干细胞悬液,将细胞分别接种于基础培养液、同种胎鼠成纤维细胞条件培养液、添加LIF的基础培养液、有饲养层的培养基和与胎鼠成纤维细胞共培养5种不同的培养体系中,比较观察在5种培养体系中胚芽干细胞的形态学、碱性磷酸酶染色和体外分化情况。结果：①在含15％胎牛血清的DMEM／F12基础培养液中培养时,胚芽干细胞贴壁明显减少,EGC克隆形成很少,传代率很低;②在基础培养液中添加白血病抑制因子（LIF）或同种胎鼠成纤维细胞条件培养液时,细胞生长情况与基础培养液培养相比无明显差异;③有饲养层存在时,4～6d后出现鸟巢状胚芽千细胞集落。传4代后集落逐渐减少、变小。6～7代后集落消失;④与胎鼠成纤维细胞共培养时,2～4d即可见EGC集落形成。传6代后细胞的集落逐渐减少、变小;⑤在与胎鼠成纤维细胞共培养时,第2、3代细胞的生长曲线基本相同,接种24h后细胞呈对数生长。培养液的更新可以显著影响小鼠胚芽干细胞的生长。第5代的细胞增殖速度减慢。结论：与饲养层细胞或腹壁组织成纤维细胞共培养可较好地培养和扩增胚芽干细胞;第3代细胞的活力最好。     

2-DG对神经干细胞增殖和分化影响的研究

目的 探究2-脱氧-D-葡萄糖(2-Deoxyglucose, 2-DG)对成体神经再生的影响。方法 体外培养大鼠神经干细胞,将其分为正常生长组和诱导静息组,加入2-DG后定时观测细胞增殖情况。利用LIF(leukemia inhibitory factor, LIF)和BMP4(bone morphogenic protein4, BMP4)诱导大鼠神经干细胞定向分化为星形胶质细胞,同时加入2-DG,免疫荧光染色检测分化效率。qRT-PCR进一步检测实验组和对照组中,细胞周期相关基因CDK2和CDK4以及控制神经干细胞命运选择的Hes1基因的mRNA表达水平。结果 Incucyte机器实时监测细胞增殖显示,加入2-DG后,正常生长和静息的神经干细胞增殖均受到抑制。免疫荧光染色显示,加入2-DG后神经干细胞向星型胶质细胞分化的效率显著增高(P＜0.05)。qRT-PCR结果表明,加入2-DG后CDK2和CDK4表达量下降,Hes1表达量显著上升。结论 2-DG抑制神经干细胞增殖,促进其向星形胶质细胞分化。     

大鼠诱导性多能干细胞向神经前体细胞诱导分化研究

目的探讨大鼠来源的诱导性多能干细胞(iPS细胞)向神经前体细胞(NPC)定向诱导分化的方法。方法在大鼠iPS细胞培养到悬浮类胚体阶段加入维甲酸(RA)诱导分化,对分化获得的细胞,分别通过免疫荧光染色和实时定量PCR方法检测NPC标志物、用BrdU免疫荧光染色检测其增殖能力、并通过大鼠视网膜下腔移植对其存活、整合情况及分化能力进行检测。结果经诱导分化获得的细胞能够在贴壁培养条件下形成Rosette结构、表达NPC标志物并且绝大多数呈BrdU阳性,移植到大鼠视网膜下腔后能分化为神经元和胶质细胞。结论大鼠iPS细胞能够通过悬浮EB加RA诱导的方法分化为NPC,有可能作为细胞移植治疗视网膜退行性疾病的供体细胞。     

羊水中多能性干细胞的培养及分化

羊水中存在多能性干细胞,它们不仅阳性表达胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)表面标志物,如SSEA-4,保持未分化状态的转录因子OCT-4,胚胎多能性维持因子Nanog等;而且阳性表达成人干细胞(adult stem cell,ASC)表面标志物CD29和CD44等,在特定的诱导条件下能够分化为代表三胚层生殖层系。     

人胚胎干细胞神经分化的方法探讨

【目的】 利用新建系的人胚胎干细胞株SYSU-7,运用胚体形成的方法,探讨不同的分化条件对胚胎干细胞神经分化的影响。【方法】 首先检测人胚胎干细胞株SYSU-7的Oct4、SSEA4(stage-specific embryonic antigen-4)、TRA-1-60和AKP(Alkaline phosphatase)等胚胎干细胞特异性标志物的表达及体内外三胚层分化的能力;之后,应用含20% Knockout Serum Replacement (KSR)的培养液和神经干细胞培养液(neural progenitor medium, NPM)分别诱导细胞形成悬浮的拟胚体(悬浮时间为4 d或7 d),然后将拟胚体贴壁于多聚鸟氨酸(Polyornithine, PO)和纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN)包被的培养皿中继续培养4 ~ 10 d。在分化的不同时间点利用免疫荧光染色的方法检测胚胎干细胞和神经细胞相关的标志性抗原。【结果】 SYSU-7胚胎干细胞表达未分化细胞特异性标志Oct4、SSEA4,TRA-1-60,AKP染色呈强阳性,在体内外具有向三胚层分化的潜能;在体外诱导其向神经分化,结果发现KSR培养液比神经干细胞培养液更有利于胚胎干细胞的神经分化,悬浮生长7 d的拟胚体贴壁后出现特征性的玫瑰花环样结构(rosette structure)的时间更早。数量更多。【结论】 SYSU-7细胞系具有自我更新及多向分化潜能等胚胎干细胞特性。本实验为研究人胚胎干细胞的神经分化提供了新的细胞模型和研究思路。