鹿茸精诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的:探讨鹿茸精体外定向诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法:通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外扩增培养。鹿茸精定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。鹿茸精诱导3小时后大部分骨髓间充质干细胞转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论:鹿茸精可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与培养

目的 建立体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.方法 应用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞传代培养.倒置显微镜下观察细胞形态及生长特征,测定细胞生长曲线,通过流式细胞仪检测细胞表面标志物,取第3代细胞分别加入成骨、成脂诱导剂并采用碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力.结果 获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长.传至第3代细胞纯度可达97%以上,其细胞表型CD29、CD44、CD105、CD166呈阳性表达,CD34、CD80、CD86呈阴性表达.经成骨诱导后细胞碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色呈阳性,成脂诱导后细胞油红O染色呈现阳性.结论 应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠bMSCs,培养的细胞扩增迅速、生物学特性稳定,是一种较为理想的体外分离扩增bMSCs的培养体系.     

两种猪自体骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的比较猪应用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合直接贴壁法两种方法分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养效率,为临床应用提供理论依据和实验方法。方法取滇南小型猪的骨髓液用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合贴壁培养法两种方法分离猪骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,绘制其生长曲线,通过显微镜观察培养细胞的生物学形状。结果直接贴壁法收集到的细胞扩增速度较慢,密度梯度离心法收集到的细胞扩增速度较快,细胞培养后成梭形。结论密度梯度离心结合贴壁培养法较单纯的直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高。体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长稳定,增殖力较强。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离和培养方法。方法取SD大鼠骨髓冲洗液,去掉经自然沉淀的血凝块、骨组织、肌肉组织、筋膜组织等沉淀物,离心收集大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,通过显微镜观察大鼠骨髓间充质干细胞的生物学形状。结果原代培养的呈梭形、多边形或星形,这3种细胞中梭形细胞最多,传代后仍具有较强的增殖能力,经过2~3次传代培养,细胞融合生长时,呈放射状或旋涡状生长。结论骨髓间充质干细胞是一种存在于骨髓网状间质的非造血干细胞,在不同的诱导条件下,可向心肌细胞、神经细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等中胚层细胞分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨诱导

目的:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,研究其体外培养的生物特性。方法:获取骨髓间充质干细胞进行培养,倒置相差显微镜观察细胞生长情况,绘制生长曲线,流式细胞仪鉴定细胞表面抗原。在地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸的作用下,进行成骨诱导分化。结果:原代和传代培养的体外培养细胞呈现梭形、多角形外观,具有较强的生长增殖能力;细胞CD29抗原呈阳性表达,CD34呈阴性表达。分化细胞表现成骨细胞特性,茜素红染色有橘红色磷酸盐胞外基质沉积。结论:建立稳定可靠的分离培养大鼠骨髓BM-MSCs方法,分离出的BM-MSCs具有干细胞的生物特性,可用于组织工程中的种子细胞。     

组织工程心脏瓣膜体外构建的初步研究

目的:初步体外构建组织工程人工心脏瓣膜。方法:种子细胞选用胸骨骨髓,抽取后分离出人骨髓间充质干细胞,体外培养,扩增待用。脱细胞瓣膜支架的构建应用破膜剂曲拉通-脱氧胆酸钠对新鲜猪主动脉瓣膜36片(实验组)进行处理48h后,与对照组未经处理的猪主动脉瓣膜(36片)进行对比,在光镜和电镜下观察脱细胞效果。将人骨髓间充质干细胞接种于脱细胞瓣膜支架上静态培养7d,观察细胞-支架复合体生长状况。结果:曲拉通-脱氧胆酸钠法脱细胞彻底,保持原有纤维结构。种植的人骨髓间充质干细胞7d后可生长于瓣膜支架的表面。结论:曲拉通-脱氧胆酸钠法是一种较为理想的猪瓣膜脱细胞方法;人骨髓间充质干细胞能在脱细胞猪瓣膜支架上较好地黏附和生长,从而初步构建组织工程人工心脏瓣膜。     

全骨髓法分离培养骨髓间充质干细胞及向神经样细胞分化的研究

目的 目前尚缺乏标准的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离方法 ,实验通过全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经样细胞,以寻找一种简便、实用的分离方法 .方法 取大鼠骨髓.全骨髓培养法结合差速贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增.倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点,免疫组化染色鉴定细胞.用MTT法间接测定不同代数细胞活力.诱导分化.先用碱性成纤维细胞生长冈子(bFGF)预诱导24h,然后加入丁羟基茴香醚诱导(BHA)和二甲基亚砜(DMSO)诱导.观察诱导过程中细胞的形态变化,并用免疫组化染色法鉴定细胞.结果 全骨髓培养法成功分离培养BMSCs,免疫荧光染色示CD90、CD71、CD106表达阳性.CD45阴性.MTT法检测细胞活力示2、4、6代细胞于酶标仪490 nm波长处吸光度值均高于第8、10代细胞.细胞经诱导后,细胞呈神经样细胞形态,并且神经元特异性表面标志β微管蛋白(β-Ⅲ-Tubulin)、巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达阳性.结论 采用全骨髓培养法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞,其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化为神经样细胞.     

骨髓来源成骨细胞复合纳米晶羟基磷灰石胶原材料培养的研究

目的 探讨纳米材料作为组织工程骨基质材料的可行性。方法 分离培养兔骨髓间充质干细胞，诱导为成骨细胞后作为种子细胞，与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养，通过对复合物光镜、免疫组织化学染色及扫描电镜观察，了解细胞在材料中生长情况。结果 兔骨髓间充质干细胞可以诱导为成骨细胞，体外复合培养8天，分布于支架材料上的细胞大量分化增殖、分泌细胞外基质。结论 纳米晶羟基磷灰石胶原材料是一种构建组织工程骨的较好的支架材料。     

川续断皂苷Ⅵ诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的研究

目的探讨川续断皂苷Ⅵ(akebia saponin D)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的影响。方法用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,选择合适的培养基,传代扩增。采用不同浓度的川续断皂苷Ⅵ对大鼠MSCs定向诱导分化,MTT法观察各组对MSCs的增殖作用并绘制细胞生长曲线;观察MSCs诱导分化过程中成骨细胞内碱性磷酸酶(alkaliphosphatase,ALP)活性;采用ELISA法检测MSCs诱导分化过程中骨钙素(Osteo-calcin,OC)的含量;RT-PCR方法检测MSCs诱导分化过程中核心结合因子α-1(Cbfα1)mRNA表达。结果细胞生长曲线显示各组MSCs数量均随时间延长而增加,中、高浓度的川续断皂苷Ⅵ能明显提高MSCs分化为成骨细胞的ALP活性和骨钙素的含量,且使Cbfα1 mRNA的表达升高。结论川续断皂苷Ⅵ具有促进大鼠体外MSCs向成骨细胞增殖和分化的作用,这一作用可能与其升高Cbfα1 mRNA的表达有关。     

骨髓来源成骨细胞体外成骨表达的研究

目的探索在体外诱导兔骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化及成骨表达的特性。方法抽取兔骨髓,通过离心法获取单个核细胞,在体外经条件培养基培养21d,通过倒置显微镜及激光共聚焦显微镜观察成骨细胞的形态学特点;应用MTT法测定成骨细胞活性;并检测成骨细胞分泌碱性磷酸酶活性及形成矿化结节情况。结果体外BMSCs可在成骨条件培养液下诱导培养后可向成骨细胞分化,经倒置显微镜和激光共聚焦显微镜观察证实,诱导后BMSCs由长梭形转变为短胖形的成骨细胞,MTT检测成骨细胞活性良好,分泌碱性磷酸酶并形成矿化结节。结论骨髓基质干细胞在体外可定向诱导为成骨细胞,并具有成骨细胞功能,有希望成为理想的种子细胞应用于临床。     

诱导后上清液在BMSCs向神经元样细胞分化中的作用

目的:研究体外使用SHH、Ra、Fn组成的诱导体系诱导骨髓间充质细胞后的上清液对BMSCs向神经细胞分化的作用。方法:从健康志愿者髂骨处抽取骨髓4mL,体外分离、培养、扩增后用400ng/LSHH、0.5μmolRa和5μmolFn组成的诱导体系进行诱导,取诱导后12,24h的诱导液上清分别作用于BMSCs。7d后使用倒置显微镜和免疫组织化学方法观察诱导前后细胞的变化。结果:诱导7d之后各组均有部分细胞胞体收缩、伸长突起,表现为神经细胞的形态。12h组同SHH+Ra+Fn组NSE、MAP-2阳性细胞比例差异无显著(P>0.05)。12h组分化率高于24h组(P<0.05)。结论:12h后诱导液上清可以有效地诱导BMSCs向神经细胞分化。     

全反式维甲酸联合细胞因子诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的作用

目的 探索全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)在诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞过程中的作用.方法 应用Ficoll分离骨髓中单核细胞,贴壁培养,观测形态并用流式细胞仪检测其细胞表面标志;用含ATRA、bFGF、EGF的条件培养基对培养的细胞向神经细胞诱导分化;采用免疫荧光染色法对分化的细胞进行鉴定.结果 分离培养的贴壁细胞具有典型的BMSCs形态和细胞表面标志,诱导后细胞表达神经元和星形胶质细胞标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP) .结论 ATRA联合细胞因子具有诱导BMSCs在体外分化为神经元样细胞的能力.     

骨髓间充质干细胞异体移植对大鼠肝细胞增殖影响的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的机制。方法全骨髓贴壁法培养扩增原代SD大鼠骨髓干细胞,传代培养,形态学、生长曲线及免疫表型鉴定骨髓间充质干细胞,移植治疗D-氨基半乳糖联合脂多糖致肝衰竭大鼠,观察干预治疗后1d、3d、5d、7d肝组织病理学改变、肝组织PCNA蛋白、CyclinDlmRNA表达量。结果原代培养大鼠骨髓间充质干细胞传代后,形态较均一,为梭形或纺锤形,高表达CD90（94．3％）,CD29（99．4％）,不表达CD11b／c（5．7％）,CD45（3．2％）。骨髓间充质干细胞移植减轻肝脏组织病理损伤（P〈0．05）。BMSCs治疗组PCNA的蛋白表达高于对照组（P〈0．01）。干预后不同时间点治疗组细胞周期蛋白D1的mRNA表达高于对照组（1．182±0．248VS0．468±0．053、0．858±0．114vs0．218±0．178）,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论骨髓间充质干细胞移植减轻肝脏病理损伤,上调细胞周期蛋白DlmRNA的表达,促进肝再生,对急性肝衰竭有治疗作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

目的研究体外大鼠骨髓间充质干细胞的生长特性。方法在无菌条件下,取大鼠骨髓,采用密度离心法和全骨髓贴壁法联合培养并结合传代获取、纯化细胞,倒置显微镜观察其形态,流式细胞术检测其表面抗原CD29、CD90及CD34的表达。CCK-8法测定第1、3代细胞的增殖情况,并绘制其生长曲线。结果经全骨髓贴壁法和密度梯度离心联合培养,所得到的原代细胞形态呈椭圆形、圆形、三角形,接近融合状态时可呈现均一的长梭形,排列规则。传至第8代时,细胞的增殖能力减弱,其形态宽大畸形,呈树枝状。经流式细胞仪检测,所分离的细胞CD29的表达率为94.97%,CD90的表达率为88.50%,CD34的表达率为2.23%。CCK-8法显示第3代细胞有较强的增殖能力。结论体外培养的大鼠BMSCs是骨组织工程的优良种子细胞。     

骨髓间充质干细胞旁分泌HGF体外调控肝星状细胞

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）与肝星状细胞（HSCs）体外共培养体系中,BMSCs旁分泌肝细 胞生长因子（HGF）对 HSCs 增殖、凋亡、活化的影响。方法 全骨髓贴壁法分离、培养、纯化大鼠 BMSCs,另培养 HSCs。6 孔板半透膜建立上下两层细胞非直接接触共培养体系,实验设 H 组（HSCs 单独培养）、H-H 组（HSCs 与 HSCs共培养）、M-H组（BMSCs与HSCs共培养）、M-H-C组（BMSCs与HSCs共培养并加c-met抑制剂）,各组细胞培 养48 h后,流式细胞仪鉴定BMSCs,检测HSCs凋亡率,MTT法检测HSCs的增殖,免疫荧光共聚焦定量检测HSCs中 α-肌动蛋白（α-SMA）的表达量,ELISA法检测共培养体系上清液中HGF的浓度。结果 MSCs高表达阳性表面分子 CD29、CD90,低表达造血细胞表面标记CD45;BMSCs能明显抑制HSCs的增殖、活化并促进其凋亡,且M-H组上清液 中HGF的浓度明显高于其他组。结论 BMSCs与HSCs共培养过程中,BMSCs通过旁分泌HGF促进HSCs的凋亡,抑 制HSCs的增殖、活化。     

脂多糖对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的观察不同浓度脂多糖(LPS)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响,并探讨其可能的机制。方法应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠BMSCs,采用免疫细胞化学法鉴定其表面标志。将BMSCs分为对照组及不同浓度LPS干预组,采用噻唑蓝(MTT)比色法观察其增殖情况。结果采用全骨髓贴壁法获取的BMSCs形态呈长梭形,呈集落样生长,免疫细胞化学鉴定,CD44阳性,CD34、CD45阴性。MTT检测结果显示,与对照组(0.190±0.037)相比,0.01、0.1及1μg/mlLPS干预组吸光度(A)值均增高,其中0.01μg/mlLPS干预组(0.253±0.030)增高明显,差异有统计学意义(P<0.05)。而10、100μg/mlLPS干预组A值则较对照组下降,其中10μg/mlLPS干预组(0.159±0.042)明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论低浓度LPS可以提高BMSCs的增殖能力,但随着LPS浓度的增大,BMSCs增殖能力反而下降。     

大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的体外诱导动态观察

目的 动态观察体外定向诱导大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)分化为神经细胞的时程变化。方法 采用Percoll-Paque液(1．073g／ml)分离BMSCs体外扩增培养后，加入丁羟茴醚 二甲基亚砜诱导其分化为神经细胞，分别于1、2、3、4h后光镜下观察形态变化及通过免疫组化和免疫荧光染色测定特异性神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数。结果 BMSCs在加入诱导剂后1h出现胞体收缩，突起伸出，有不同程度NSE、NF、GFAP表达，3h后汰高峰。结论 丁羟茼醚 二甲基亚砜在一定时间内是一种较好的体外诱导剂。     

C57BL6小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养鉴定

目的建立一种简单实用的小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法,为BMSCs的进一步研究和应用提供实验材料和依据。方法采用直接贴壁法和分阶段更换培养基的方法分离纯化BMSCs,显微镜下观察其形态,应用流式细胞技术鉴定细胞表面标记。结果显微镜下BMSCs贴壁生长后呈梭形,形态均一,经流式细胞仪检测第2代BMSCs高表达CD34、Sca-1,不表达CD45。结论本实验方法能简单高效的获得高纯度BMSCs,且细胞生物学特性稳定,适用于对BMSCs的进一步研究和应用。     

骨髓间充质干细胞对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症的保护作用

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对硫代乙酰胺(TAA)所致急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症(IETM)的保护作用。方法取雄性Wistar大鼠的骨髓贴壁培养获得BMSCs,取30只雌性Wistar大鼠随机分为正常组、TAA模型组和BMSCs治疗组,每组10只。TAA300mg/kg灌胃建立急性肝衰竭模型,24h后重复灌胃,正常组给予磷酸盐缓冲液(PBS)2ml灌胃,第2次灌胃后将BMSCs经尾静脉注射到BMSCs治疗组中,正常组和TAA模型组给予等量PBS注射。BMSCs治疗72h后处死。腹主动脉采血,检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)以及血浆内毒素含量,取部分肝组织及回肠作常规病理切片检查。结果与正常组比较,TAA模型组大鼠血清ALT,AST活性以及血浆内毒素水平均显著上升(P<0.05),BMSCs治疗组大鼠血清ALT,AST活性以及血浆内毒素水平与模型组相比均显著降低(P<0.05)。肝脏病理切片显示BMSCs能够明显减轻TAA对肝组织的炎症性破坏。结论 BMSCs尾静脉移植对TAA引起的急性肝衰竭大鼠IETM有一定的保护作用。