Fascin真核表达载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的：构建fascin基因的pcDNA3.1（＋）表达载体pcDNA3.1（＋）-fascin,将其转染肺癌A549细胞,观察其表达,并检测转染前后细胞内F-肌动蛋白（F-actin）的变化。方法：应用RT-PCR从Hela细胞中扩增fascin基因,酶切后和真核表达载体pcDNA3.1（＋）重组,获得重组表达载体pcDNA3.1（＋）-fascin。经酶切、电泳,DNA测序鉴定后,将其及对照空载体转染肺癌A549细胞,采用Western blotting检测fascin在A549细胞中的表达情况;免疫荧光染色后采用激光共聚焦显微镜观察fascin对F-actin的影响。结果：成功克隆fascin基因片段,并将其重组到pcDNA3.1（＋）载体中,经酶切及DNA测序鉴定正确。pcDNA3.1（＋）-fascin转染A549细胞,Western blotting鉴定转染后fascin在A549细胞中高表达。激光共聚焦显示fascin基因能够在A549细胞内促进F-actin形成丝状突出。结论：成功构建了pcDNA3.1（＋）-fascin真核表达载体,并将其转染肺癌A549细胞;激光共聚焦观察显示fascin能够促进A549细胞内F-actin形成丝状突出,可能是促进A549细胞转移的结构基础之一。     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法:应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1(+)载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1(+)-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论:重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

脂质体介导入钠/碘同向转运体基因转染肺癌A549细胞及其蛋白表达

目的:研究人钠/碘同向转运体(NIS)基因转染肺癌细胞及其蛋白表达。方法:将体外培养的肺癌A549细胞分为实验组和对照两组:以脂质体Lipofectamihe2000为载体,分别介导转染重组质粒pcDNA3-hNIS和空质粒pcDNA3。NIS基因重组质粒pcDNA3-hNIS进行扩增、纯化,并经酶切鉴定和DNA测序。采用Western Blot法和免疫组化法分别检测转染肺癌细胞中NIS蛋白表达。结果:酶切鉴定和DNA测序结果表明重组质粒pcDNA3-hNIS中插入的hNIS基因片段大小、方向正确。WesternBlot法和免疫组化染色结果显示实验组有NIS蛋白表达,其阳性率达70.6%且主要分布于细胞膜而对照组无表达。两组比较有显著性差异(P=0.000)。结论:脂质体Lipofectamine 2000介导转染人钠/碘同向转运体基因pcDAN3-hNIS肺癌细胞能够成功地表达NIS蛋白。     

Nucleostemin基因荧光真核表达载体构建及表达特性

目的:构建Nucleostemin(NS)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法: 设计引物在肺癌细胞株(LTEP-a-2)中扩增NS全长cDNA片段,插入pMD-18T 质粒中得pMD-18T-NS载体,并测序;再将pMD-18T-NS质粒经酶切后导入真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP质粒中,构建pcDNA3.1(+)-GFP-NS载体,并检测其真核表达情况.结果: 经RT-PCR扩增得到1 650 bp的全长NS cDNA片段,酶切及测序后鉴定证明pMD-18T-NS构建成功.pcDNA3.1(+)-G-FP-NS载体转染COS-7细胞经蛋白印迹及激光共聚焦显微镜检测显示,该GFP-N-S融合基因在COS-7细胞中获得较好表达.转染后见该基因定位于核仁,细胞逐渐失去黏附贴壁的特性,细胞的增殖受阻;稳定表达(4～20周)后,细胞形态发生改变,体积增大,核增多,细胞成瘤细胞样改变.结论: 成功构建pcDNA3.1(+)-GF-P-NS真核表达载体,并在COS-7细胞中有效表达;NS基因在COS-7发生瘤样改变过程中发挥着重要作用,可能与肿瘤发生密切相关.     

带TAP标签的癌蛋白SET真核载体的构建及其表达

背景与目的: 为研究三氯乙烯诱导的差异蛋白SET在肝细胞L-02中的相互作用,构建带串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1/SET-TAP。 材料与方法: 从L-02肝细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增SET基因,从质粒中扩增得到TAP基因,采用重叠PCR法将基因SET与TAP连接成SET-TAP,双酶切后纯化序列定向克隆至pcDNA3.1/zeo(+)并转化E.coli DH 5α ,取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,重组质粒瞬时转染L-02肝细胞进行表达,Real Time-PCR和Western blotting检测融合蛋白的表达。 结果: 经双酶切和DNA测序鉴定,证实pcDNA3.1/SET-TAP真核表达载体构建成功,将该载体转染L-02细胞后,融合蛋白在肝细胞中获得高效表达。 结论: 该结果为研究SET在三氯乙烯致肝细胞毒性的蛋白质相互作用以及三氯乙烯致机体损伤的机制奠定了基础。     

VEGFR-3胞外区基因真核表达载体的构建-与鉴定

目的构建VEGFR-3胞外区基因真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,并在体外进行表达和鉴定。方法采用 RT-PCR技术,扩增C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA3.1-VR-3。经限制性酶切鉴定和DNA 序列测定结果证实后,将重组质粒经脂质体法转染COS-7细胞, Western blotting检测其蛋白表达。结果克隆了C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,Western blot 证实目的基因可在COS-7细胞中表达。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验奠定了基础。     

人CC10基因在肺腺癌A549细胞中的表达

目的构建及鉴定人CC10基因真核细胞表达载体。方法采用RT-PCR法,从人肺组织的总RNA中扩增出273bp的人CC10cDNA片段,利用DNA重组技术将其克隆到真核细胞表达载体pcD-NA3.1中,脂质体法转染pcDNA3.1-hCC10到肺腺癌A549细胞,荧光免疫细胞化学法及Westernblot法检测CC10蛋白的表达。结果用酶切重组质粒并行序列鉴定,人CC10基因已经正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,体外染pcDNA3.1-hCC10的肺腺癌A549细胞中CC10蛋白表达明显增高。结论成功构建了CC10基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1-hCC10,并获得表达     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的：构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法：应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1（＋）-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果：重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1（＋）载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1（＋）-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1（＋）-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论：重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

转染BAX基因对A549细胞系的凋亡及化疗敏感度的影响

目的 探讨BAX转染是否增强人肺癌A549细胞对顺铂致凋亡的敏感度。方法 通过CCK8法检测顺铂对A549细胞体外增殖的影响。应用脂质体介导重组真核表达载体BAX-pcDNA3.1和空载体pcDNA3.1质粒转染至人肺癌A549细胞中,G418筛选阳性细胞。RT-PCR法检测BAX在A549细胞中的表达。将不同浓度的顺铂分别作用于A549、A549/BAX和A549/pcDNA3.1细胞72 h,CCK8法测定各组细胞的存活率,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。结果 顺铂能抑制A549细胞体外生长,BAX和顺铂使A549细胞发生G₁/S期细胞阻滞。RT-PCR显示转染BAX基因的A549细胞中BAX表达显著增加,转染BAX基因及加药组细胞凋亡率明显增加。 结论 稳定转染BAX基因明显增强A549细胞对顺铂致凋亡作用的敏感度。     

人基因BAG-1高表达载体的构建及其对肺腺癌细胞放射敏感度的影响

目的通过构建BAG-1高表达载体来研究BAG-1在肺腺癌细胞放射敏感度中的作用。方法提取人肺癌A549细胞中总RNA,通过RT-PCR扩增BAG-1基因,构建pcDNA3.1-BAG-1表达载体,转染肺癌细胞A549,通过Western blot筛选出BAG-1高表达A549细胞株。通过克隆形成实验,研究BAG-1对肺腺癌细胞放射敏感度的影响。结果成功构建pcDNA3.1-BAG-1载体;筛选出BAG-1高表达A549细胞株;BAG-1高表达降低肺腺癌细胞放射敏感度。结论BAG-1高表达参与放射抵抗,有望成为肿瘤治疗的新靶点。     

Effects of BTG2 on proliferation inhibition and anti-invasion in human lung cancer cells

The objective of the study was to investigate the impact of the B cell translocation gene 2 (BTG2) on lung cancer cell growth, proliferation, metastasis, and other biological characteristics and to provide experimental evidence for the biological treatment of human lung cancer. A pcDNA3.1-BTG2 eukaryotic expression vector was constructed and transfected into the human lung cancer cell line A549. The biological changes in the BTG2-expressing cells were analyzed using growth curves, the MTT (tetrazolium) assay, propidium iodide (PI) staining, and the Transwell invasion chamber. Additionally, Western blotting was used to determine the impact of BTG2 on the protein expression of cyclin D1, MMP-1, and MMP-2. Compared to the empty vector-transfected A549 cells or the mock-transfected A549 cells, the pcDNA3.1-BTG2-transfected A549 cells grew significantly slower. No significant differences were detected between the empty vector-transfected group and the mock-transfected A549 cells. The growth curve analysis and the PI staining showed that the pcDNA3.1-BTG2-transfected cells grew significantly slower than the empty vector-transfected A549 cells (P < 0.05). The cell invasion assay results suggested that the invasion rate of the pcDNA3.1-BTG2-transfected A549 cells was significantly slower than the invasion rate of the empty vector-transfected group and the mock-transfected group (P < 0.05). The overexpression of BTG2 may inhibit the protein expression of cyclin D1, MMP-1, and MMP-2 in A549 cells. The overexpression of BTG2 may inhibit the growth, proliferation, and invasiveness of the A549 human lung cancer cell line.     

NDRG2对A549肺癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨NDRG2(N-myc downstream regulated gene 2)对于肺癌细胞系增殖的抑制作用。方法:将NDRG2基因转染进肺癌细胞系A549,采用G418筛选出稳定高表达NDRG2的亚克隆细胞系A549/NDRG2-flag并将仅转染载体的A549/pcDNA3.1(+)作为阴性对照。Western blot检测NDRG2在转染细胞中的表达水平。MTT、平板克隆形成试验检测转染前后细胞增殖作用的差异,流式细胞仪检测转染后细胞的周期分布状态。结果:成功构建高表达NDRG2的亚克隆细胞系A549/NDRG2-flag。证实了NDRG2的高表达能够抑制肺癌细胞系的增殖(P<0.01),使肺癌细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期。结论:NDRG2高表达后能够有效抑制肺癌细胞系A549增殖并阻滞细胞周期滞留在G0/G1期。     

人miR-34a真核表达载体的构建及其表达

目的:构建人miR-34a的真核表达载体,并使其在骨肉瘤SOSP-9607细胞中表达.方法:从人骨肉瘤SOSP-9607细胞基因组DNA中用PCR法扩增出miR-34a的前体序列,并引入酶切位点和保护碱基,双酶切后定向插入真核表达载体pcD-NA3.1(+)中,构建miR-34a真核表达载体pcD-NA-miR34a,然后进行菌落PCR、酶切和测序鉴定.同时用构建好的载体pcDNA-miR34a转染骨肉瘤细胞SOSP-9607细胞,筛选miR-34a稳定表达细胞系,用Northern blot及real time RT-RCR法鉴定pcD-NA-miR34a可于真核细胞中过表达miR-34a的生物学特性.结果:成功构建了人miR-34a真核表达载体pcDNA-miR34a.pcDNA-miR34a可于骨肉瘤SOSp-9607细胞中上调miR-34a的表达,获得了miR-34a高表达骨肉瘤细胞系.结论:miR-34a的真核表达载体可在骨肉瘤细胞SOSP-9607细胞中有效表达,为进一步研究miR-34a在骨肉瘤中的功能及基因调控机制奠定了实验基础.     

PEA-15真核表达载体的构建及表达

目的构建PEA-15真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15,并在人类食管癌细胞（EC-109）中表达。探讨PEA-15对EC．109细胞的影响。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测EC-109细胞中的PEA-15基因表达。构建重组真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至EC-109细胞中。采用RT—PCR、Westernblot法检测基因及蛋白表达。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长抑制率。结果RT—PCR显示PEA-15在EC-109细胞中表达。PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果表明真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15构建成功。转染后的细胞中PEA-15表达均增加（t值分别为4．078、5．269,均P〈0．05）。转染质粒72h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组降低[（7．12±0．86）％、（12．55±1．78）％,t=6．163,P〈0．05]。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．I-PEA-15,并在EC-109细胞中进行了表达;转染后对食管癌细胞生长有促进作用,其表达可能促进食管癌的发生。     

PTEN 表达载体的构建及转染食管鳞癌细胞系EC9706

 目的 筛选稳定表达野生型PTEN基因的食管鳞癌细胞株EC9706。方法 提取胎盘总RNA，设计引物，PCR扩增人野生型PTEN基因，经测序鉴定后，连接于pcDNA3．1（＋）真核表达载体，构建pcDNA3．1-PTEN，用脂质体介导的方法将其转染EC9706。而后加抗生素G418筛选稳定表达株，用RT-PCR方法检测稳定表达株PTEN基因的mRNA水平，通过绘制生长曲线观察细胞生长情况。结果 PCR产物的电泳结果显示，在1500bp左右有一明显亮带，测序结果与GenBank上PTEN序列完全一致；稳定表达PTEN基因的细胞株RT-PCR结果显示，PTEN的mRNA水平比对照细胞株相比明显升高；生长曲线结果显示，转染后的细胞生长速度明显减慢。结论 所扩基因为野生型PTEN基因，所构建的载体为野生型PTEN基因真核表达载体，并筛选出PTEN基因稳定表达的食管鳞癌细胞株。