人精子特异性乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达及其初步应用

目的 构建人精子特异性乳酸脱氢酶(hLDH-CA)的原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达,将重组hLDH-CA应用于抗精子抗体(ASA)的检测.方法 以人睾丸TripIEx cDNA文库为模板,PCR扩增hLDH-CA编码序列.PCR产物经Hind Ⅲ-Xho I酶切后,克隆至表达载体pET-28a(+)中,在E.coli BL21(DE3)中诱导His-Tag融合的重组蛋白表达.用免疫印迹、酶活性测定等方法鉴定表达产物.以纯化的重组hLDH-CA为基质,建立检测ASA的ELISA方法.结果 构建了hLDH-C4原核表达载体pET-28a(+).hLDHC.在IPTG的诱导下,重组菌可高效表达相对分子质量35 000的产物,与预期大小相符.免疫印迹显示,重组蛋白可被抗His-Tag单克隆抗体和兔抗人LDH-C4抗体识别.重组菌在IPTG诱导后,其裂菌液的乳酸脱氢酶活性是诱导前的11.2倍.用基于hLDH-C4抗原的间接ELISA法,在一组不育症患者中检测血清抗hLDH-CA抗体,阳性率达30.51%.结论 成功地克隆了hLDH-C4编码序列,并在E.coli BL21(DE3)中获得高效的表达,重组hLDH-C4在ASA检测中得到初步应用.     

HSP65-PEAⅠ融合蛋白表达纯化及免疫效果研究

目的通过基因工程手段在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白HSP65-PEAⅠ,建立小鼠实验模型,检测其抗体效价水平,初步评价免疫效果。方法扩增HSP65-PEAⅠ片段插入表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化纯化条件,以HSP65-PEAⅠ为免疫原对小鼠进行免疫接种。结果双酶切和测序鉴定结果证实HSP65-PEAⅠ成功克隆入pET-28a载体中,表达的重组蛋白相对分子量约为97 000,主要以包涵体形式表达,纯化后的重组蛋白纯度达90%,浓度为0.498mg/ml。免疫小鼠均在首免1周后采集的血清中检测到特异性抗体,抗体效价水平持续增长且在42天均达到了210。结论成功在E.coli中表达并经过纯化得到重组蛋白HSP65-PEAⅠ,确定了动物免疫程序,为制备抗烧烫伤多器官衰竭疫苗奠定了基础。     

去乙酰化酶SIRT5的原核表达及多克隆抗体的制备

目的克隆小鼠的Sirt5基因,及制备SIRT5多克隆抗体。方法提取小鼠肝细胞总RNA进行RT-PCR,PCR法扩增Sirt5基因,将此基因克隆至pET-28a载体,转化E.coli BL21（DE3）,经异丙-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,利用Ni 2＋-NTA亲和层析柱纯化;纯化的目的蛋白免疫Bal/c小鼠后,收获血清并鉴定。结果成功构建了Sirt5原核表达载体,并能在宿主菌E.coli BL21（DE3）中高效表达;利用纯化的蛋白制备了理想的多克隆抗体。结论利用分子克隆技术,获得了高纯度的SIRT5蛋白并制备了多克隆抗体,为进一步研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白。方法将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2。结果成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21（DE3）plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化。结论成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达。     

NK4蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化与活性研究

目的通过构建NK4基因的重组原核表达载体,规模化制备NK4蛋白。方法将NK4基因插入载体pET-26b(+),构建重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4,并转化E.coli Rosseta(DE3)。IPTG诱导转化菌表达NK4蛋白,然后采用Ni-NTA树脂亲和层析进行纯化。观察复性后NK4蛋白对Hela细胞的生物学性状的影响,评价制备的NK4蛋白的生物活性。结果NK4基因重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4获成功构建。转化pET-26b(+)-NK4的E.coli Rosseta(DE3)以包涵体形式大量表达目的蛋白,占菌体总蛋白的42%。经Ni-NTA树脂亲和层析纯化后NK4蛋白纯度约为95%,并经Western blot证实。NK4蛋白行稀释复性后可抑制Hela细胞的贴壁、迁徙并促进其凋亡。结论成功构建NK4基因的重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4,并可在E.coli Rosseta(DE3)表达。制备的NK4保留了其生物学活性。     

人α1微球蛋白基因的质粒载体构建和表达

目的构建表达人α1-微球蛋白(α1-microglobulin,1α-MG)的重组质粒并纯化目的蛋白。方法从正常人肝脏中提取cDNA,RT-PCR扩增α1-mg基因,将扩增产物用NdeI/BamHI消化,切下目的基因片断克隆到质粒pET-15b中,构建重组pET-15b,转化入E.coliDH5α中,经酶谱分析和测序,鉴定出正确的重组质粒pET-15b。将重组pET-15b转化入宿主菌E.coliBL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达。提取细菌总蛋白质进行SDS-PAGE分析和蛋白印迹鉴定。利用重组蛋白中的6个组氨酸(His)组成的“标签”进行亲和层析,纯化重组蛋白。结果筛选到携带有α1-mg基因的正确重组质粒pET-15b,重组蛋白在BL21(DE3)pLysS中得到了诱导表达,含量达20mg/L细菌培养液。经一步金属螯合亲和层析纯化后,重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出均一的单一条带。结论重组质粒pET-15b的构建和有活性的酶蛋白的表达成功说明,PCR扩增获得的α1-mg基因具有完整的阅读框架,亲和层析纯化后可得到活性和纯度均较高的目的蛋白,为研制国产免疫比浊法试剂盒打下基础。     

鼠疫耶尔森菌caf1M基因的克隆表达及其产物免疫学评价

目的 原核表达有免疫学活性的重组caf1M蛋白(rCaf1M),并以此建立检测鼠疫抗体的辅助诊断方法。 方法 将去掉信号肽编码序列的caf1M基因片段与载体pGEX4t-1通过NcoⅠ和XhoⅠ双酶切位点进行连接,构建重组质粒caf1M-pGEX4t-1;将caf1M-pGEX4t-1转化入E.coli BL21(DE3)中诱导表达;表达产物rCaf1M经亲和层析进行纯化;以纯化rCaf1M及天然F1抗原喷制鼠疫抗体双检测NC膜,并以浙江各6份F1抗体阳性及阴性人血清标本进行应用评价。 结果 含有重组质粒caf1M-pGEX4t-1的BL21,经诱导产生了分子量约为55103的rCaf1M融合蛋白;rCaf1M融合蛋白与鼠疫菌免疫血清有较好反应;在浙江人血清标本的检测中,rCaf1M与F1抗体阳性者有明显反应,与F1抗体阴性者无反应。 结论 本研究制备的rCaf1M,与鼠疫菌免疫血清具有良好的免疫反应性,该rCaf1M可用于鼠疫辅助免疫学检测。     

EGFL7原核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建类表皮生长因子域7（EGFL7）原核表达载体,并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。【方法】以人肝癌细胞系 HepG2总RNA为模板,PCR扩增 EGFL7基因,克隆至原核表达载体pET‐21a（＋）中,转化大肠杆菌 BL21（DE3）,IPTG 诱导表达。 His‐tag 磁珠纯化重组蛋白 EGFL7,SDS‐PAGE 鉴定。【结果】克隆目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pET21a（＋）‐TRX‐EGFL7经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子量为80 kD ,与预期相符。【结论】成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化了EGFL7重组蛋白,为后续研究奠定了基础。     

重组人骨形态发生蛋白2在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

背景:骨形态发生蛋白是一类调节骨组织发育的生长因子,其中骨形态发生蛋白2诱骨活性最强,在骨组织工程研究中需要大量的骨形态发生蛋白2.目的:克隆表达骨形态发生蛋白2基因,并进行蛋白表达及蛋白纯化定量.设计、时间及地点:单一样奉观察,于2008-05/07在宝牛物工程(大连)有限公司开放实验室完成.材料:表达载体pET28a Vector及相应的宿主细胞E.coil BL21(DE3)购于Novagen公司;分子伴侣质粒pTF16、pGr07、PKJE7购于宝生物工程(大连)有限公司.方法:利用基因重组技术,优化片人工合成骨形态发生蛋白2基因,亚克隆至含T7启动子的原核表达载体pET28a中,构建表达载体pET-BMP.将重组质粒pET-BMP与3种含分子伴侣质粒共转入宿主菌E.coil BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达.菌体经超声波破碎,镍柱亲和层析纯化并定量.主要观察指标:①3种表达质粒的表达及町溶性检测及表达上清的westem blotting检测.②pET-BMPg的纯化.结果:在表达宿主菌中,骨形态发生蛋白 2基因获得了高效表达,其中一组为可溶性表达,表达产物经亲和层析纯化后,可溶性表达量达12.18 mg/L培养基.结论:人骨形态发生蛋白2基凼能在PET表达系统中得到高效可溶性表达.     

重组人胱抑素C在大肠杆菌中的表达及纯化

目的研究构建人胱抑素C(Cys C)的重组表达质粒及其在大肠杆菌中的表达和纯化。方法采用反转录-聚合酶链反应从人肝组织中获取Cys C cDNA,并将其插入到pET-28a(+)质粒中,重组质粒pET-28a-CysC转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达可溶性CysC。重组CysC采用Ni2+-NTA系统进行层析纯化。结果核酸序列测定与预期一致,CysC表达水平达到146mg/L,约占菌体总可溶性蛋白的13.5%,表达产物用SDS-PAGE鉴定,其相对分子质量为13.3×103,经纯化后蛋白纯度达90%。结论成功构建Cys C原核表达系统和蛋白纯化,为制备抗体以及研制Cys C免疫纳米微球测定试剂奠定了基础。     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感，不同性别孤独感发生率无差异性，不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）；随年级增加，孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970，P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题，老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童，以减少其孤独感的发生。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

Determination of loss of quality of life

Physiatrists are a valuable resource in legal settings, where assessment of functional capacity to perform work and of future medical needs must be determined. Physiatrists help determine what future medical care is needed to restore and maintain an individual at the maximum level of life function. This article focuses on the use of a quality of life (QOL) rehabilitation model, rather than a medical model, for enhancing functional performance, modifying environments, and facilitating patient coping. We discuss use of the QOL model to describe and influence a patient's physical, psychological, cognitive, vocational/economic, and social/leisure domains.     

护士选择性应用静脉留置针现状分析

[目的]了解护士选择性应用留置针的现状以及主要影响因素,为指导临床留置针合理应用提供理论依据。[方法]采用自设问卷对138名护士留置针选择性使用情况及其影响因素进行调查。[结果]约1／4的护士并不知道应选择性使用留置针,近60％的护士在实际工作中选择留置针的意识较差;护士选择性应用留置针的决策受多因素影响;不同科室、职称及是否具有带教资格选择性应用留置针的影响因素不尽相同;绝大部分护士希望参加选择性应用留置针相关内容的培训。[结论]临床护士操作前考虑留置针选择的意识有待加强。建议实施有针对性的培训以提高护士选择性应用留置针的能力。     

血液透析患者家庭护理提供者的生活质量调查

目的:了解江汉油田血液透析(血液透析)患者家庭护理提供者(护理者)的生活质量。方法:对60例血液透析患者的家庭护理提供者进行一般情况和生活质量综合评定问卷(QOLI-74)调查,并进行相关性和多因素回归分析。结果:家庭护理提供者各维度的主观生活满意度与其客观指标相关,但也与其需求、年龄、文化程度、与患者的关系有关。结论:客观状态是影响主观生活满意度的重要因素,同时应考虑护理者的需求、年龄、文化程度、与患者的关系对护理者主观生活满意度的影响。