肝脏Kupffer细胞摄取清除腺病毒载体的机制

腺病毒载体因其具有广泛趋向性、高效率表达目的基因等优点而成为表达和传递治疗基因的主要候选者.但是,由于它可以快速的经循环系统到达网状内皮系统(特别是Kupffer细胞)被摄取和清除,只有少数碎片能到达靶器官,因此这也成为了腺病毒作为载体应用于基因治疗的最主要障碍.该文综述了Kupffer细胞摄取、清除腺病毒这一过程可能存在的机制,为实现腺病毒裁体转基因持久表达提供临床参考.     

含血小板生成素基因的重组腺病毒Ad/Tpo的构建及表达

基因治疗常用的病毒载体是腺病毒和逆转录病毒,腺病毒以其特有的优点,在临床和实验室基因治疗研究中得以广泛的应用。我们通过血小板生成素(Ｔｐｏ)重组腺病毒穿梭质粒的构建,并大量提取腺病毒基因组ＤＮＡｐＢＨＧ11,将其二者共转染293细胞,从而包装含ＴｐｏｃＤＮＡ并能表达Ｔｐｏ的重组腺病毒。材料和方法1　材料　腺病毒载体ｐＣＭＶｓｐ1Ａ质粒为6.4ｋｂ,含氨苄青霉　　基金项目:国家“九五”科技攻关项目(969060119)　　作者单位:100044　北京医科大学人民医院血液病研究所素抗性基因,腺病毒基因组质粒ｐＢＨＧ11,34ｋｂ(Ｍｉｃｒｏｂ…     

角质细胞生长因子受体腺病毒表达载体在脂多糖所致肺泡上皮细胞损伤修复中的应用

目的观察KGFR腺病毒表达载体在脂多糖（LPS）致A549细胞损伤模型中转基因表达KGFR的情况及其促使A549细胞对抗LPS损伤的效果，为基因治疗急性肺损伤探索有效途径。方法KGFR腺病毒表达载体感染LPS致伤前后的A549细胞，通过形态学观察转基因作用对LPS致伤前后A549细胞的影响，并运用westem blot检测KGFR腺病毒表达载体在LPS致伤前后的A549细胞中转基因表达KGFR蛋白情况。结果KGFR腺病毒表达载体感染LPS致伤前后的A549细胞，转基因组对抗LPS致伤作用明显，western blot检测表明KGFR腺病毒表达载体转基因表达KGFR蛋白效果显著（P〈0．05）。结论KGFR腺病毒表达载体能够转基因表达KGFR蛋白，并具备转基因治疗急性肺损伤的能力。     

腺病毒载体的不足与对策

重组腺病毒载体存在对某些细胞感染能力差,转基因表达水平较低,持时较短等缺点。可通过提高感染力,改造腺病毒载体结构,调节机体的免疫能力等来克服其缺点,促进重组腺病毒载体在基因治疗中的应用。     

腺病毒相关病毒介导基因治疗的研究进展

基因治疗的载体可分为病毒载体和非病毒载体两类.常用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒及腺病毒相关病毒(AAV)等.腺病毒相关病毒是一个新的有前景的病毒载体,与逆转录病毒和腺病毒相比,具有以下优点:(1)宿主范围广,能感染哺乳类动物(人、鼠、猴、免)的多种类型的细胞.     

腺病毒载体的不足与对策

重组腺病毒载体存在对某些细胞感染能力差，转基因表达水平较低，持时较短等缺点。可通过提高感染力，改造腺病毒载体结构，调节机体的免疫能力等来克服其缺点，促进重组腺病毒载体在基因治疗中的应用。     

PPARγ 与重组腺病毒载体

PPARγ即过氧化物酶体增殖物激活受体，是核受体超家主成员之一。近年来关于PPARγ改善机体胰岛素敏感性的机制研究，一直是人们关注的热点之一。目前认为PPARγ可促进脂肪细胞分化，调节脂肪细胞信号传导，在脂肪代谢中起到重要作用。腺病毒载体是目前基因治疗中应用最广泛的一种病毒载体，与其他病毒载体不同，腺病毒载体的诸多优点决定了其在基因治疗领域中具有广阔的应用前景。成功构建PPARγ的重组腺病毒载体，为进一步研究PPARγ在胰岛细胞、脂肪组织、骨骼肌细胞和内皮细胞中的生物学功能奠定良好基础。     

血小板在机体清除腺病毒中的作用

基因治疗作为一种新兴的医疗手段,为人类疾病治疗开辟了一条新的途径。基因治疗最关键的问题之一是要选择合适的载体以确保治疗基因安全、高效地导入靶细胞。腺病毒因具有诸多优点而被作为最广泛的运载工具,特别是用于肿瘤基因治疗。但是作为非血液传染的病原体,腺病毒在血液里没有幸存     

提高腺病毒载体转染造血细胞效率的研究进展

重组腺病毒作为基因转移的载体已经广泛应用于基因治疗的基础研究和临床试验，但造血细胞由于缺乏腺病毒特异性受体柯萨奇-腺病毒受体(coxsacke virus and adenovirus receptor，CAR)导致转染效率较低，从而限制了腺病毒载体在造血系统的应用。多种策略可以提高腺病毒转染造血细胞的效率，这些策略包括腺病毒本身的改造、造血细胞CAR表达的提高等。本文就这一领域的主要研究进展作一综述。     

肝细胞生长因子受体的shRNA抑制胶质瘤生长的体内外研究

目的:探讨肝细胞生长因子受体(c-metprotooncogene,c-Met)的RNA干涉(RNAi)技术在体内外对U251细胞生长抑制作用.方法:PCR法获得人U6启动子及带有c-Met反向互补靶序列的片段HU6shmet;利用腺病毒载体将其传递至U251细胞;应用MTT法、流式细胞术和Matrigel基质生长实验评价肿瘤细胞转导前后的生物学行为.进一步应用裸鼠皮下荷瘤模型观察腺病毒载体介导shRNA基因治疗对U251细胞生长的抑制作用.对肿瘤组织应用免疫组化的方法进行c-Met和增殖细胞核抗原(PCNA)表达比较.结果:MTT法分析显示rAdUshmet2转导组细胞生长抑制率为70%;与对照组和rAdUsicon转导组比较,细胞周期分析结果表明rAdUshmet2转导组G0 ～ G1期细胞数没有明显变化,进入S期的细胞数较对照组减少了12.6% ～ 12.9%,而进入G2期细胞则增加了10.6% ～ l1.8%.Matrigel基质生长实验显示对照组和rAdUsicon转导组细胞呈正常形态贴壁生长,而rAdUshmet2转导组细胞不能贴壁生长,呈团块状簇集生长.裸鼠皮下荷瘤模型实验显示rAdUshmet2显著抑制皮下肿瘤生长,组织病理学分析显示治疗组c-Met表达下降、PCNA标记指数降低.结论:靶向c-Met的RNAi技术在体内外对U251细胞生长均产生明显抑制作用.因此,shRNA表达腺病毒载体介导的基因治疗可以成为胶质瘤靶向性c-Met治疗的新策略.     

含人p27基因的重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含有人p27基因和EGFP基因的重组腺病毒载体,并观察其表达.方法 利用腺病毒载体系统Adeno-X,通过质粒抽提、电泳、酶切、连接、转化等多种基因工程技术,构建重组腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP;酶切、PCR鉴定重组腺病毒质粒;利用293细胞包装重组腺病毒载体PAd-p27-EGFP,通过荧光倒置显微镜观察EGFP的表达.结果:经酶切和PCR鉴定,成功构建重组腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP,利用脂质体转染人293细胞后,转染腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP可见EGFP表达和细胞致病效应(CPE).结论:利用腺病毒载体系统Adeno-X成功构建含CMV启动子的Flag-p27和EGFP基因的腺病毒载体,为进一步研究细胞周期调控与慢性移植物失功之间的关系,并为寻找慢性移植物失功的基因治疗的途径奠定基础.     

携带HIV-1vpr基因的重组腺病毒的构建与鉴定

目的　构建携带HIV 1vpr基因的重组腺病毒 ,为进一步基因治疗的实验研究奠定基础。方法　利用AdEasy 1系统 ,通过含有目的基因片段vpr的穿梭载体pShuttle CMV/vpr和骨架质粒pAdEasy 1在细菌内同源重组的方法构建重组腺病毒质粒pAdCMV/vpr。将重组质粒转染 2 93细胞包装出重组腺病毒rvAdCMV/vpr。利用PCR等方法对重组腺病毒进行鉴定。结果　获得表达vpr蛋白的重组腺病毒。结论　成功构建出携带HIV 1vpr基因的重组腺病毒 ,为更深入的基因治疗研究奠定了基础。     

小鼠白细胞介素10重组腺病毒载体构建及对树突状细胞的基因修饰

背景:对于抗原递呈细胞树突状细胞及其分泌的细胞因子白细胞介素10在气道高反应性和炎症中的作用国内外文献报道较少.目的:构建小鼠白细胞介素10腺病毒重组体Ad-mIL-10,获得小鼠白细胞介素10基因修饰的树突状细胞,以期为下一步基因治疗的动物实验打下基础.方法:通过人工合成获得小鼠白细胞介素10基因,根据白细胞介素10基因序列及腺病毒载体的多克隆位点,合成包括酶切位点的基因序列,连接到pMD18-T载体并测序鉴定.用基因工程的方法将小鼠白细胞介素10基因克隆到BDAdeno-X~(TM)腺病毒载体,于人胚肾293细胞中包装、扩增病毒并测定白细胞介素10蛋白表达,转染到体外培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞.结果与结论:成功构建了小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并高包装、扩增成功,测定高表达白细胞介素10蛋白,体外成功培养小鼠骨髓来源的小鼠树突状细胞并顺利转染Ad-mIL-10.提示用基因工程方法构建小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并转染小鼠骨髓来源的树突状细胞是可行的,可为进行相关基因治疗的可能性提供更充足的理论依据.     

重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP的构建与鉴定

背景:基因治疗是目前脊髓损伤治疗的方向,目的基因和载体是基因治疗的关键.目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)标志人脑源性神经营养因子(human brai-denved neurotrophic factor,hBDNF)基因重组腺病毒载体.设计、时间及地点:单.一样本观察,实验于2007-09/2008-06在福建医科大学附属第一医院完成.材料:感受态大肠杆菌DH-5 α购自美国Stratagene公司;pDC316-hBDNF、载体质粒pDC316-mCMV-EGFP、腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre 、腺病毒包装系统AdMax 和包装细胞株293购自加拿大Mixcrobixg- Biosysrerms公司.方法:以pDC316-hBDNF为模板,聚合酶链反应扩增酶切获得hBDNF基因片段,连接到带有EGFP标记基因的载体质粒pDC316-mCMV-EGFP上,构建穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP.利用AdMax包装系统.穿梭质粒与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,反复感染293细胞扩增病毒后,离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数及滴度.主要观察指标:①hBDNF基因原始质粒聚合酶链反应鉴定.②穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP的构建及鉴定.③重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的包装、扩增及纯化.④毒种目的基因的聚合酶链反应鉴定.⑤纯化病毒的滴度测定结果.结果:经聚合酶链反应鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP;扩增纯化后,测得重组腺病毒颗粒数为2.4×1011VP/mL,A260/A280值约为2.0,滴度为0.8×1010 CCID50/mL.结论:已成功构建重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,为hBDNF基因功能及基因治疗的进一步研究奠定实验基础.     

人内皮抑素重组腺病毒的构建及鉴定

目的:利用Adeasy1系统,构建并鉴定人内皮抑素(hES)重组腺病毒。方法:从真核表达载体pEGFP-N1-ASP-hES中将ASP-hES扩增,亚克隆至pAdTrackCMV穿梭质粒中,与pAdEasy1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组为腺病毒载体。线形化后转染293细胞进行包装扩增,利用AdEasy系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达。结果:重组腺病毒载体经PCR鉴定正确,病毒滴度为1×108PFU/ml。结论:成功构建了人内皮抑素重组腺病毒Ad-ASP-hES,为内皮抑素基因治疗新生血管的进一步研究奠定了基础。     

小鼠CD40L重组腺病毒载体的构建

目的构建含有小鼠CD40L基因的重组腺病毒载体,为研究mCD40L的生物学特性及肿瘤基因治疗提供基础。方法用XhoI、SwaI双酶切质粒pORF-mCD40L,回收1955bp基因片断并定向克隆插入穿梭质粒pShuttle中XhoI、EcoRV双酶切位点,得到重组质粒pSh-mCD40L。经PmeI酶切与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,同源重组后用选择培养基筛选阳性克隆,提取质粒PacI酶切线性化后用脂质体介导转染293细胞。14天左右观察细胞病变及PCR鉴定重组的腺病毒。结果酶切分析、PCR验证mCD40L基因克隆到腺病毒pAdEasy-1载体中。结论成功构建表达mCD40L基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其功能和基因治疗提供了基础。     

大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达☆

背景:过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义. 目的:构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率. 方法:采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV.线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒.用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度.用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体α mRNA、蛋白表达. 结果与结论:成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×1011 pfu/L.重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高.该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础.     

携带入VEGF165的腺病毒载体的构建及鉴定

目的　构建携带人血管内皮生长因子 (VEGF) 16 5基因的重组腺病毒载体 ,用于治疗重症冠心病。方法　将人VEGF16 5cDNA正向插入到穿梭质粒 pHCMVSP1A的CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,即pAd hVEGF16 5 ,通过脂质体与pJM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人VEGF16 5基因的重组腺病毒载体Ad hVEGF16 5。通过PCR扩增法鉴别Ad hVEGF16 5 ,根据A2 60nm计算病毒滴度。结果　人VEGF16 5cDNA成功地正向插入到 pHCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组DNA为模板 ,同时扩增出了 5 76bp的VEGF16 5cDNA基因片段和 86 0bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了Ad hVEGF16 5的正确性。测病毒滴度为 1.94× 10 12 pfu/ml。结论　携带人VEGF16 5的腺病毒载体的成功构建为用VEGF16 5基因治疗冠心病奠定了基础。     

NK4基因在重组腺病毒中的表达与初步鉴定

目的 构建含有肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体，为应用HGF／NK4进行肿瘤基因治疗奠定实验基础。方法 应用AdEasy腺病毒载体系统，将PCR扩增所得的NK4基因片段与穿梭质粒pShuttle-CMV进行连接，获得重组质粒pShuttle-CMV-NK4，将该质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5l83获得重组腺病毒质粒pAdCMV-NK4，用该质粒转染293细胞包装产生出重组腺病毒rvAdCMV-NK4。重组腺病毒分别经电子显微镜技术及RT-PCR、Western Blot等方法进行鉴定。结果 得到含有NK4基因的重组腺病毒rvAdCMV-NK4，电子显微镜下可见典型腺病毒颗粒形态，RT-PCR及Westem Blot分析显示rvAdCMV-NK4感染293细胞后NK4基因可有效转录并表达。结论 成功构建出含有NK4基因的重组腺病毒rvAdcMV-NK4，为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。     

重组人血管内皮生长因子165腺病毒载体的构建与鉴定

目的 探讨构建携带人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的重组腺病毒载体,为进一步的基因转染构建组织工程骨的血管化提供实验基础.方法 采用RT-PCR扩增的方法获得人源性的hVEGF165,并克隆入穿梭质粒pAdTraek CMV.构建的质粒pAdTrack CMV-VEGF165经酶切及测序鉴定正确后,通过pAdeasy 1质粒的介导与腺病毒包装质粒pAdTrack CMV.VEGF165共转染至人胚肾细胞HEK293,经同源重组后获得携带人VEGF的重组腺病毒pAdTrack CMV.VEGF165.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒,测定病毒滴度.结果 PCR鉴定证实重组腺病毒含有人VEGF,病毒滴度为0.5×10"pfu/ml.结论 成功构建的携带人VEGF的重组腺病毒载体能在HEK293细胞内扩增获得足够高的病毒滴度,为基因治疗构建组织工程骨血管化的研究奠定基础.