人乳头瘤病毒DNA的限制性核酸内切酶分析

用差速离心和CsCl平衡密度梯度离心法,从收集的寻常疣中分离并纯化了人乳头瘤病毒(HPV),从中抽提病毒DNA,经四种限制性核酸内切酶消化后,其消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示EcoRI,BamHI,HindⅡ,HindⅢ分别将环形的HPV DNA裂解成1、2、3、2个片段,同时以λDNA的HindⅢ片段为标准核酸计算了各HPV DNA片段的分子量。     

人乳头瘤病毒、疱疹病毒Ⅱ型及人巨细胞病毒与宫颈癌关系的研究

用人乳头瘤病毒(HPV)16,18,11型、疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)N/BglⅡ,L/HindⅢ片段和人巨细胞病毒(HCMV)DNA等6个核酸探针,通过分子杂交技术对宫颈疾患活检标本进行了检测和分析,结果在同一标本中未发现3种病毒DNA均阳性者,但宫颈癌标本中46%HPV和HCMV DNA同时存在,2例HSV-2 DNA阳性的宫颈癌标本中有1例同时存在HCMV DNA。提示宫颈癌的病毒病因是多因素的,HPV,HSV-2和HCMV均可能有关,在宫颈癌发生过程中3者之间可能有某些内在联系。     

用限制性核酸内切酶分析钩端螺旋体DNA的研究

作者选用钩体赖型56601株、017株、秋季型56606株、曼耗2型67020株、1987年分离株87112、87369株,用内切酶EcoR Ⅰ、Bgl Ⅱ、Hha Ⅰ和Hind Ⅲ消化分析其DNA,结果表明:钩体017株的四种内切酶图谱明显不同,在EcoR Ⅰ酶切图谱上,赖型、秋季型、曼耗2型钩体DNA的主要差别在高分子区带,赖型强毒力株017较同型弱毒力株56601在10.5kb处染色较深;三型钩体的Hind Ⅲ酶切图谱仅有细小差异;分离株87112和87369的EcoR I 酶切图谱与赖型56601和017基本一致。在HindⅢ酶切图谱上,分离株87112与赖型56601株、017株相似。提示:限制性核酸内切酶分析可以作为钩体分型和鉴定的手段。     

用核酸杂交技术检测抗病毒i-RNA制剂中病毒核酸的残留及其在免疫小鼠体内的动态变化

以生物素化dUTP标记CI(?)、株基因组Hind Ⅲ酶切Y片段为探针,用核酸杂交技术检测抗HCMV-iRNA制剂中巨细胞病毒核酸的残留,同时用HCMV免疫小鼠观察病毒核酸在小鼠体内的存留时间。结果,HCMV DNA在小鼠体内的存留时间有明显的个体差异,而与HCMV DNA有同源序列的RNA在免疫后7天被清除。在4批来自羊肝、脾组织的抗HCMV-iRNA 制剂中,有3批查出HCMV核酸。     

DNA限制性内切酶分析应用于伴放线放线杆菌的鉴定和分型

本文用限制性内切酶分析(REA)作伴放线放线杆菌(Aa)的鉴定和分型研究,提取Aa染色体DNA,井分别用BamHI、HindⅢ,Sal Ⅰ和Xho Ⅰ消化,作琼脂糖凝胶电泳。结果显示,Aa和嗜沫嗜血杆菌的DNA片段图谱明显不同;分属于两种不同血清型的两株Aa菌株,其DNA片段图谱也明显不同。这表明,REA可用于Aa菌的鉴定和分型,在所用的4种酶中,以Sal Ⅰ和Xho Ⅰ消化的DNA片段图谱差异最明显。     

重组人肝细胞生长因子基因的克隆

用RT PCR技术从人胎盘组织内成功地扩增全长肝细胞生长因子 (HGF)cDNA基因 (2 184bp) ,并将其克隆至pGEM T载体 ,经限制性核酸内切酶NdeⅠ ,Bg1Ⅱ ,HindⅢ ,BamHⅠ和XhoⅠ的酶谱分析和DNA测序分析证实。再将其亚克隆至逆病毒载体pLNL XHC ,可进一步用于基因表达和基因治疗的研究     

新疆妇女宫颈癌与高危HPV病毒载量的相关性研究

目的:探讨高危型HPV病毒载量与新疆妇女宫颈癌的相关性。方法:以因宫颈癌住院进行治疗的200例患者为研究对象,采用杂交捕获2代(HC-Ⅱ)方法定量检测宫颈HPV-DNA的含量(以此表示HPV的病毒载量),进一步观察HPV载量与宫颈癌的关系。结果:①HPV-DNA在宫颈癌Ⅰa^Ⅱa期组中检出率为82.7%,ⅡbⅡa期组中检出率为82.7%,Ⅱb^Ⅲb期组中检出率为87.2%,Ⅲb期以上检出率为92.9%,各组差异有统计学意义(P<0.05)。②HPV-DNA病毒载量(均数)在ⅠaⅢb期组中检出率为87.2%,Ⅲb期以上检出率为92.9%,各组差异有统计学意义(P<0.05)。②HPV-DNA病毒载量(均数)在Ⅰa^Ⅱa期组中为396.41,ⅡbⅡa期组中为396.41,Ⅱb^Ⅲb期组中为548.89,Ⅲb期以上为793.31,不同期别的宫颈癌组中HPV DNA病毒载量差异有统计学意义(P<0.05)。③根据不同级别的宫颈癌中HPV DNA病毒载量总体分布发现宫颈癌中HPV DNA病毒载量普遍在高载量范围,其中在宫颈癌ⅠaⅢb期组中为548.89,Ⅲb期以上为793.31,不同期别的宫颈癌组中HPV DNA病毒载量差异有统计学意义(P<0.05)。③根据不同级别的宫颈癌中HPV DNA病毒载量总体分布发现宫颈癌中HPV DNA病毒载量普遍在高载量范围,其中在宫颈癌Ⅰa^Ⅱa期组中有30.7%在500以上,在宫颈癌ⅡbⅡa期组中有30.7%在500以上,在宫颈癌Ⅱb^Ⅲb期组中有48.7%在500以上,在宫颈癌Ⅲb期以上为82.0%,各组间进行Spearman秩相关分析(r=0.72,P<0.05),不同期别的宫颈癌与HPV DNA病毒载量有关。结论:HPV DNA病毒载量与新疆妇女宫颈癌期别高度相关,HC-Ⅱ检测在宫颈癌筛查中有重要意义。     

HSV临床分离株的限制性核酸内切酶酶切分析与鉴定

采用三种方法从感染细胞中分离HSV DNA。同时对用三种方法提取的HSV DNA的量以及与细胞DNA分离程度的差别作了比较。采用其中一种方法对10株流行病学上无关的、分别来自疱疹性角膜炎和口唇疱疹病人的分离病毒株,用限制性核酸内切酶BglⅡ、HindⅢ和BamHⅠ进行了酶切分析与鉴定,BglⅡ和HindⅢ可明显区分HSV的型间差别,BamHⅠ可对10株HSV进行株间的鉴定。     

C-MYC癌基因与宫颈癌发生发展相关性的初步研究

应用细胞转化和核酸杂交技术研究 c-myc 癌基因与宫颈癌的关系,可见宫颈癌DNA 转染 NIH/3T3细胞,在 G_(418)-DMEM 选择性培养液中形成能持久增殖、呈重叠生长的转化灶,转化灶细胞基因组中 c-myc 癌基因有扩增现象;经斑点杂交检测正常宫颈、慢性宫颈炎和宫颈癌组织DNA 中 c-mye 癌基因,揭示宫颈癌组织中其拷贝数明显增加;宫颈腺癌 DNA 经 Hind Ⅲ单酶切进行Southern Blot 杂交出现两条阳性杂交带,而宫颈鳞癌 DNA 经 EcoRⅠ或 HindⅢ/EcoRⅠ或 EeoRⅠ酶切,均只出现一条阳性杂交带。     

高危型HPV感染负荷量预测宫颈病变转归可能性的研究

目的研究高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染负荷量与宫颈病变程度的相关性,以探讨HPV负荷量预测宫颈疾病转归的可行性.方法第二代杂交捕获技术(hc2 HPV DNA)检测云南省肿瘤医院2010年1月至2011年12月宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈癌患者143例HPV感染负荷量,研究高危型HPV病毒负荷量与宫颈病变的关系.结果 CINⅠ患者高危型HPV负荷量显著低于CINⅡ、CINⅢ及各期宫颈癌患者(P<0.05),CINⅡ及各期宫颈癌患者间HPV负荷量差异无统计学意义(P>0.05).结论 CINⅠ高危型HPV病毒负荷量较低,CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌患者HPV病毒负荷量增高,但病毒负荷量不随宫颈病变程度增加而增高.高危型HPV负荷量不能预测宫颈病变转归,但较高的HPV负荷与CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌相关.     

人乳头瘤病毒11型的DNA分子克隆

以E coli C300为受体菌,利用人乳头瘤病毒11型DNA与pBR322的重组质粒(pBR322-HPV11DNA),成功地进行了HPV11DNA的转化,经筛选获得61株重组子,随机对15株转化子以碱变性法及清亮裂解法抽提了pBR322-HPV11DNA的重组质粒,纯化后经BamHI酶切及琼脂糖凝胶电泳,以λDNA/HindⅢ作参考分子量测定,初步结果证实存在有分子量为5.5×10~6(约8.1kb)的HPV11DNA。这为HPV11DNA的分子扩增,基因探针的制备及HPV11型量鳞癌的研究提供了方便。     

人乳头状瘤病毒16型E2基因的克隆表达

采用分子克隆技术在大肠杆菌中表达HPV16 E2 ORF。用Cfol和BamHI将含有E2基因的3.2kb片段从HPV16基因组中切出来,用S1核酸酶修平末端;同时,表达性载体pBD2 DNA用HindⅢ切开后也用S1核酸酶修平末端.两者连接后转化E coli BMH71—18.用原位杂交技术筛选出阳性重组子,进行DNA酶切分析和蛋白质SDS-PAGB分析及免疫学鉴定.我们认为表达的蛋白质为β-gal与E2的融合多肽。     

人类乳头瘤病毒的实验诊断

人类乳头瘤病毒属乳多空病毒科乳头瘤病毒属，是小分子双链DNA病毒，据基因片段序列的多态性分型，目前已确定100余型。HPV亚临床感染和潜伏状态感染是尖锐湿疣感染状态的14倍，仅靠临床症状判断，则低估了HPV感染的严重性。随着核酸杂交技术和核酸扩增技术的发展，HPV的高感染率业已逐渐被人们认识。     

pET21b-HPV16E4重组质粒的构建及鉴定

目的 构建HPV16 E4重组表达质粒,以获得HPV16 E4活性蛋白,为进一步研究打基础.方法 从宫颈癌组织中提取DNA,用PCR方法扩增HPV16E4 DNA片段,定向克隆到原核表达载体pET21b质粒中,利用菌液PCR方法筛选重组阳性菌株.提取重组质粒,利用酶切图谱分析方法和核酸序列测定验证重组质粒pET21b-HPV16E4构建的正确性.结果 用PCR方法从宫颈癌组织中扩增出HPV16 E4片段,大小为0.3kb.从PCR筛选的重组菌株中提取重组质粒pET21b-HPV16E4,经单酶切得到5.7kb的片断,HindⅢ和BamHⅠ双酶切得到5.4kb和0.3kb两个片段,并且测序结果与已知序列相符,证实了重组质粒构建的正确性.结论 pET21b-HPV16E4重组质粒构建成功.     

携带HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定

①目的构建携带人乳头瘤病毒16型（HPV16）E7病毒癌基因的复制缺陷型重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E7。②方法应用PCR技术从宫颈癌组织中扩增E7病毒癌基因全长片段,并导入T载体进行测序,与Nucleotide中HPV16标准毒株序列比较鉴定。目的基因及穿梭质粒载体pAdTrack-CMV分别经Bgl Ⅱ和Hind　Ⅲ双酶切后连接,转化宿主菌E．coli DH5α,应用PCR法及限制性内切酶消化法双重鉴定重组质粒,并测序。③结果PCR扩增产物与Nucleotide中HPV16E7序列一致,重组穿梭质粒经Bgl　Ⅱ和Hind　Ⅲ双酶切后电泳,可观察到9220bp大小的载体条带和313bp大小的目的基因条带;将经PCR和双酶切鉴定的重组阳性克隆测序,结果证实克隆成功。④结论成功地构建了携带HPV16E7基因的重组腺病毒穿梭质粒。     

Epstein-Barr病毒DNA多聚酶基因扩增和表达载体构建

【目的】扩增Epstein Barr病毒 (EBV)DNA多聚酶基因 ,构建高效表达载体。【方法】根据EBV全基因序列 ,在EBVDNA多聚酶基因的 3′、5′端设计一对附加EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的特异性引物 ,以B95 8细胞DNA为模板 ,采用改良PCR方法扩增出EBVDNA多聚酶基因 (3 0 44bp)。用EcoRⅠ和HindⅢ酶切该基因片断并克隆至表达载体 pMAL p2 ,采用蓝白斑试验筛选阳性菌落。EcoRⅠ和HindⅢ酶切分析、鉴定重组体 pEBP。【结果】通过电泳鉴定 ,PCR产物为 3 0 44bp ,与EBVDNA多聚酶基因大小一致。经蓝白斑试验及限制性DNA内切酶分析 ,成功地筛选到EBVDNA多聚酶基因重组表达质粒 pEBP。【结论】本实验成功地扩增出完整EBVDNA多聚酶基因 ,并构建了高效表达重组体 ,为进一步在体外表达、制备EBVDNA多聚酶蛋白奠定了基础。     

一种简便有效的枯草杆菌质粒克隆方法

目的　在用枯草杆菌质粒克隆并表达白喉毒素突变型DT del14 8时 ,出现A70 0T突变 ,导致Ile2 0 9Leu氨基酸取代 ,为纠正这一突变 ,设计一种简便有效的枯草杆菌质粒克隆方法。方法　首先对含I2 0 9L突变的载体PSM6 0 4 DT del14 8 I2 0 9LDNA进行计算机限制内切酶谱分析 ,以位于PflMⅠ及HindⅢ间的唯一切点的限制内切酶KpnⅠ消化 ,然后去磷酸化 ,热灭活相应酶 ,加入不含I2 0 9L突变的大肠杆菌质粒PET15b DT del14 8,再以PflMI、HindⅢ消化 ,浓缩后进行连接、转化、筛选克隆 ,最后DNA序列分析。结果　经限制内切酶消化及序列分析 ,所有转化子均含目的基因片段。载体DNA仅需 30 0ng ,转化效率达 4 5× 10 2 转化子 / μg ;结论　方法简便、有效、快捷 ,成本低、成功率高 ,值得推广和借鉴     

人C型利钠肽基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：为开展C型利钠肽基因治疗，克隆人C型利钠肽基因并构建其真核表达载体。方法：通过RT-PCR从人胎盘组织中克隆人C型利钠肽基因全长编码区，将该DNA片段亚克隆至克隆载体pBS-T中，用SmaⅠ单酶切筛选出负向插入片段，用HindⅢ和BamHⅠ双酶切将目的DNA片段定向克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，然后用双酶切、PCR鉴定和DNA序列测定三重鉴定方法对重组质粒进行鉴定。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实，人C型利钠肽基因全长编码区被准确插入至pcDNA3．1（＋）酶切位点HindⅢ和BamHⅠ之间，并且未发现有碱基突变或移位。结论：含人C型利钠肽基因真核表达质粒的成功构建并鉴定，为开展C型利钠肽基因治疗奠定了物质基础。     

家兔C型利钠肽基因真核表达载体的构建及鉴定

目的为开展C型利钠肽(CNP)基因治疗构建家兔CNP基因真核表达载体。方法通过RT-PCR从家兔腹主动脉组织中克隆CNP基因全长编码区,将该DNA片段亚克隆至克隆载体pMD 18-T中,用PstⅠ单酶切筛选出负向插入片段,用HindⅢ和KpnⅠ双酶切将目的DNA片段定向克隆至真核表达质粒pEGFP-N1中,然后用双酶切、DNA序列测定鉴定方法对重组质粒进行鉴定。结果酶切及测序鉴定证实,家兔CNP基因全长编码区被准确插入到pEGFP-N1酶切位点HindⅢ和KpnⅠ中。结论含家兔CNP基因真核表达载体的成功构建和鉴定为CNP基因治疗的研究奠定了基础。     

宫颈上皮内瘤变患者不同亚型HPV感染的流行病学

目的:探讨宫颈上皮内瘤变(CIN)患者不同亚型人乳头瘤病毒(HPV)感染的流行病学特征。方法:回顾性分析本院2019年2-10月慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ患者各200例的临床资料。通过PCR-反向点杂交法对各组HPV感染情况进行检测并比较,分析不同宫颈病变中低危型及高危型HPV感染的分布情况。结果:慢性宫颈炎组检测出病毒株260株,CINⅠ组检测出病毒株287株,CINⅡ组检测出病毒株280株、CINⅢ组检测出病毒株269株。慢性宫颈炎组与CINⅠ组低危型HPV感染率均高于CINⅡ组与CINⅢ组,而高危型HPV感染率均低于CINⅡ组与CINⅢ组(P0.05)。四组感染低危型HPV中HPV42与HPV43比例均高于HPV6、HPV11与HPV81(P0.05)。CINⅢ组感染HPV11比例明显低于CINⅠ组,且CINⅡ组感染HPV42与HPV43比例均高于慢性宫颈炎组(P0.05)。CINⅡ组与CINⅢ组感染高危型HPV中HPV16比例高于慢性宫颈炎组,而慢性宫颈炎组、CINⅡ组与CINⅢ组感染HPV33比例高于CINⅠ组(P0.05)。CINⅡ组与CINⅢ组感染的高危型HPV以HPV16、HPV52、HPV58为主。结论:慢性宫颈炎以及CINⅠ病变中HPV感染主要以HPV42、HPV43等低危型HPV感染为主,而CINⅡ、CINⅢ病变中HPV感染主要以HPV16、HPV52、HPV58等高危型HPV感染为主。临床工作中可通过对上述特殊高危病毒类型予以重点关注,同时进行密切随访,继而达到降低宫颈癌发生的目的。