人纤溶酶原K5区基因真核表达载体的构建和活性鉴定

目的 构建含人纤溶酶原K5区基因的真核表达载体，转染人乳腺癌细胞株MDA—MB—231，观察阳性克隆表达的K5蛋白对人脐静脉内皮细胞株ECV304和MDA—MB—231细胞增殖的影响。方法 应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5cDNA，所得的目的片段与真核表达载体pcDNA3重组，构建重组质粒poDNA3K5，脂质体法将其转染MDA—MB—231，G418筛选阳性克隆，PCR鉴定，RT-PCR和Western blot检测K5的表达。将鉴定正确的阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞，MTT、法检测其增殖情况，并用MTT法检测转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖的影响。结果 构建的重组质粒pcDNA3K5经酶切鉴定、测序正确，将其转染MDA-MB-231后挑取的阳性克隆有3个经PCR鉴定正确，并经RT-PCR和Western blot检测证实K5的表达。阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞后，其存活率降低；转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖无明显影响。结论 应用脂质体法将带有人纤溶酶原信号肽序列的K5cDNA转染MDA-MB-231细胞后，其分泌产生的有生物学活性的K5，呈现对ECV304细胞增殖的抑制作用，而对MDA-MB-231细胞的生长则无影响。     

血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建一种具有生物学活性的血管活性肠肽(VIP)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从小鼠胸腺淋巴细胞中克隆有信号肽序列的VIP cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1,构建含VIP的重组质粒pcDNA3.1-VIP,转染COS-7细胞,用ELISA和Western blot鉴定表达的蛋白,细胞因子释放抑制法测定生物学活性.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为带有信号肽序列的VIP基因;经转染的COS-7细胞表达VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬细胞的TNF-α释放.结论:成功构建了能够表达具有生物学活性的真核表达质粒pcDNA3.1-VIP.     

水蛭素衍生物基因的克隆及其在哺乳类细胞中的表达

设计特异性更高的水蛭素新突变体。化学合成编码水蛭素基因，并融合了ＲＧＤ３编码序列，通过连接，克隆、酶切筛选、ＤＮＡ序列分析，得到真核表达质粒ｐＡＰＲ－ＨＤ，表达质粒转染ＣＨＬ细胞，经Ｇ４１８筛选，获得表达克隆。     

含小鼠分泌型内皮抑素基因重组质粒的构建及表达

目的:克隆小鼠分泌型内皮抑素(sEndostatin)cDNA,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,检测重组质粒在B16细胞中的表达. 方法:用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出内皮抑素cDNA,经测序证实后,连入信号肽,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,以脂质体转染小鼠B16细胞,用Western blot方法检测B16细胞上清中内皮抑素的表达.结果:测序表明扩增的分泌型内皮抑素序列与报道完全一致, Egr-1启动子和分泌型内皮抑素cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1,Western blot证实转染B16细胞上清中有目的蛋白表达.结论:小鼠内皮抑素基因成功地被克隆和表达,为今后检测pEgr-分泌型内皮抑素的辐射诱导表达和恶性肿瘤的基因-放射治疗奠定基础.     

VEGFR-3基因转染淋巴管内皮祖细胞后可溶性VEGFR-3蛋白的分泌

目的 研究携带BABL/c小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的重组腺病毒转染淋巴管内皮祖细胞(LEPCs)后,对可溶性VEGFR-3蛋白分泌及其生物学特性的作用.方法 采用巢式RT-PCR技术从BABL/c小鼠胎盘组织中扩增VEGFR-3(1-3Ig)的编码基因,并通过重组PCR技术在基因的N端加上人CD33的信号肽.将该基因片段亚克隆入腺病毒表达载体(pDC316-IRES-EGFP),重组质粒经酶切及测序验证后,与包装质粒共转染293细胞以产生重组腺病毒.将构建好的携带有小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的重组腺病毒转染淋巴管内皮祖细胞,通过ELISA检测转染细胞上清液中可溶性VEGFR-3蛋白的分泌及其对VEGF-C的中和作用.结果 成功构建了带有信号肽的BABL/c小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的腺病毒表达质粒,并获得高滴度的携带有小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的重组腺病毒,重组腺病毒转染淋巴管内皮祖细胞后,可使转染细胞分泌可溶性VEGFR-3蛋白,该蛋白具有中和VEGF-C的作用.结论 成功地制备了携带BABL/c小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的重组腺病毒,用该病毒转染淋巴管内皮祖细胞可使其分泌可溶性VEGFR-3,该蛋白在体外具有中和VEGF-C的作用,这为临床抑制肿瘤淋巴管新生奠定了基础.     

衔接蛋白p66Shc CH2结构域分泌表达载体的构建及其表达

目的:构建可以产生分泌p66ShcCH2结构域重组蛋白的质粒,期望进一步研究p66Shc的功能。方法:利用定点诱变的方法在pDisplay中去除HA和Myc表达序列,但保留小鼠Igκ信号肽和PDGFR跨膜结构域。在小鼠Igκ信号肽后是外源CH2结构域、凝血因子Xa识别位点和Flag序列,与PDGFR跨膜结构域形成融合基因。PCR扩增得到完整表达片段后用于慢病毒载体上的克隆,之后在包装细胞Fx293中产生重组慢病毒用于后续实验。结果:经测序证实所构建的质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒构建正确,体外感染细胞后产生重组蛋白。结论:成功构建体外可以产生p66ShcCH2结构域的慢病毒载体,为体外产生重组分泌的CH2多肽和体外鉴定与p66ShcCH2结构域结合的蛋白分子实验奠定基础。     

pCDNA3.1/NY-ESO-1真核表达质粒的构建及在肝癌细胞系HepG2中稳定高表达

目的 建立癌-睾丸抗原NY-ESO-1稳定表达的HepG2肝癌细胞系.方法 设计NY-ESO-1的引物,PCR法从NY-ESO-1阳性表达的睾丸癌组织中扩增出目的片段,克隆至T载体,双酶切后定向连入pCDNA3.1载体,构建pCDNA3.1/NY-ESO-1真核表达质粒.经酶切、PCR、测序检测其构建的正确性,脂质体转染法将重组质粒转入HepG2细胞,G418药物筛选出稳定转染的细胞系,RT-PCR法、间接免疫荧光法分别检测稳定转染HepG2细胞中NY-ESO-1基因、蛋白的表达水平.结果 构建的pCDNA3.1/NY-ESO-1质粒经酶切、测序等检验表明质粒构建成功,筛选获得稳定高表达NY-ESO-1的HepG2细胞.结论 构建了pCDNA3.1/NY-ESO-1真核表达质粒及稳定高表达NY-ESO-1的HepG2细胞株,为下一步以NY-ESO-1为靶标进行肝癌的抗原特异性免疫治疗研究奠定了实验基础.     

转录调节因子p8分泌表达载体的构建及在Fx293细胞中的表达

目的:构建可以产生分泌型转录调节因子p8重组蛋白的载体,期望进一步研究p8的功能。方法:利用定点诱变的方法在pDisplay表达载体中去除HA和Myc标记序列,保留小鼠Igκ信号肽和PDGFR跨膜结构域。在小鼠Igκ信号肽后是外源p8、凝血因子Xa识别位点和Flag序列,与PDGFR跨膜结构域形成融合基因。PCR扩增得到完整表达片段后用于慢病毒载体上的克隆,之后在包装细胞Fx293中产生重组慢病毒用于后续实验。结果:经测序证实所构建的质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒构建正确,体外转染Fx293细胞后产生重组蛋白。结论:成功构建体外可以产生p8的慢病毒载体,为体外产生重组分泌的p8多肽和体外鉴定与p8结合的蛋白分子实验奠定基础。     

MEK转染的内皮细胞表达人内皮细胞特异性分子-1的初步研究

目的人内皮细胞特异性分子-1(Human endocellular-specific molecule-1, ESM-1)表达载体的构建及其体外表达,表达产物的纯化及多克隆抗体和单克隆抗体的制备.重组MEK基因的真核转染,转染的内皮细胞中ESM-1的表达. 方法用PCR方法扩增ESM-1的基因片段,扩增产物与T-Vector连接,构建克隆载体pGEM-T- ESM-1.在宿主菌中扩增重组质粒,提取质粒并进行酶切纯化,将目的基因插入pET-28b中构建成表达载体,再次转化入大肠杆菌XL1-blue,蓝白选择、耐药性标记粗筛并挑取阳性克隆,经限制性内切酶酶谱分析、DNA序列分析两种方法鉴定.然后提取质粒,转化入大肠杆菌BL-21,用IPTG诱导表达.表达产物行SDS-PAGE,割下所需条带,用电洗脱方法纯化得到所需目的蛋白.免疫新西兰纯种大白兔,制备多抗,并用免疫双扩散法测定抗体效价;免疫BALB/C小鼠,制备抗人ESM-1的单克隆抗体.用重组MEK( )基因转染人脐静脉内皮细胞ECV304,加以鉴定,并检测转染细胞中ESM-1表达的改变. 结果经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为pET-28b-ESM-1重组质粒,SDS-PAGE证实获得的融合蛋白分子量为24 ku,表达量约占菌体总蛋白的24%.所得多抗效价为1:16(免疫双扩散),单抗效价为1:6000(ELISA).重组MEK基因转染成功,用Western blot和免疫荧光的方法检测显示,转染不同活性型重组MEK基因的ECV304其ERK-2的表达量不同, ESM-1的表达量在转染不同活性型重组MEK基因的细胞中也不同,都是转染高活性型的细胞中表达量最高,转染野生型的细胞中次之,未转染的ECV304中表达最少. 结论成功获得ESM-1的表达载体, 并在大肠杆菌中获得表达,成功制备了抗ESM-1的多克隆抗体和单克隆抗体.在转染了不同活性型重组MEK基因的ECV304细胞中,ESM-1的表达量有改变,在转染高活性型重组MEK基因的细胞中表达量最高,转染野生型重组MEK基因的细胞次之,未转染的ECV304中ESM-1的表达量最少.说明ESM-1可能是MAPK信号转导通路上的一个重要的成分,并在肿瘤转移以及肿瘤血管生成中发挥作用.     

人内皮细胞特异性分子-1的转染及其在ECV304中的表达

目的构建人内皮细胞特异性分子-1(ESM-1)真核表达载体,转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,并在ECV 304中获得表达. 方法将ESM-1 cDNA插入真核载体pIRES的多克隆位点中,转染人脐静脉内皮细胞.原位杂交,免疫组化检测ESM-1基因的表达.结果构建的表达载体经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列分析证实,转染后发现ESM-1的表达在转录和蛋白水平都明显的增加. 结论成功构建了人 ESM-1真核表达载体和转染了人脐静脉内皮细胞系ECV304, 并获得高水平的表达,为进一步研究作好准备.     

抗精子抗体和抗子宫内膜抗体与不孕及流产的关系

目的　探讨抗精子抗体（ＡｓＡｂ）与抗子宫内膜抗体（ＥＭＡｂ）在不孕、流产中的作用及二者关系,进一步 揭示不孕、流产的病因。方法　采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）同时检测３４５例不孕、流产妇女血清中的ＡｓＡｂ与 ＥＭＡｂ,按ＡｓＡｂ检测结果分阳性组和阴性组,比较两组ＥＭＡｂ阳性率的差异。结果　原发不孕及自然流产妇女中, ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率高达１６．６７％和１９．５１％,而ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率高达４３．６４％和４２．８６％,显著高于 ＡｓＡｂ（－）组（Ｐ＜０．０１,Ｐ＜０．０５）。继发不孕妇女中ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率为１８．１８％,ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率 为３２．２％,二者无显著性差异（０．０１＞Ｐ＞０．０５）。结论原发不孕及自然流产妇女中因个体免疫反应差异使某些 人易对体内、外物质发生免疫反应而产生抗体,从而导致不孕或流产。     

亚硝基脲类和亚硝基硫脲类的理化性质及致突变能力

本题选择N,N′-二甲基亚硝基脲(DMNU),N,N′-二乙基亚硝基脲(DENU),及其类似物N,N′-二甲基亚硝基硫脲(DMNTU)、N,N′-二乙基亚硝基硫脲(DENTU)为代表,测定了这些化合物的水解反应速度、脂溶性(HPLC的logk′值)、水解产物和致突变能力。证明了硫脲的脂溶性大于脲的脂溶性。DMNTU对TA100菌株的致突变能力最强,其它较弱。     

气血与足月妊娠分娩关系的探讨

论述足月妊娠分娩的发动和维持依靠气的推动、温煦、气化、固摄功能和血的营养、濡润功能。顺利分娩既要气血充足，还要气顺血和。临床研究结果表明调补气血，是促进产程，预防难产的重要手段。实验研究结果阐明调补气血中药加强产力、促进产程主要是从改善产妇全身情况，提高机体抗应激、抗疲劳、耐缺氧能力，即所谓使产妇气血充足调和，充分发挥气血在分娩过程中的生理作用。     

水疗联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响

目的探讨新生儿游泳联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响。方法将经阴道顺产分娩的正常新生儿100例随机分为两组，观察组（水疗联合抚触组）50例，对照组（单纯沫浴组）50例。①测定两组10日、28日的体重、身长、上臂围；②观察记录胎便转黄时间，测定皿清胆红素；③记录24h睡眠时间。结果两组新生儿10日、28日体重、身长、上臂同增长有显著差异（P〈0．05），两组新生儿5日时，胎便转黄时间及黄疸指数比较均有显著性差异（P〈0．01），两组睡眠时间比较有统计学意义（P〈0．05），两组并发症比较无统计学意义（P〉0．05）。结论新生儿水疗联合抚触可促进新生儿的生长发育，能加速胎粪的早排出，减轻生理性黄疸程度，有效地降低新生儿高胆红素血症的发病率，提高睡眠质量。