体外诱导大鼠视网膜Müller细胞向神经节细胞定向分化的研究

目的 研究鼠视网膜Müller细胞经体外条件培养基诱导后去分化为神经干细胞及进一步定向分化成神经节样细胞的特性.方法 实验研究.体外培养出生后7-10 d的Sprague Dawley大鼠视网膜Müller细胞,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法及免疫荧光染色法鉴定Müller细胞纯度.取培养的第3或4代Müller细胞,用含有N2、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的Delbeccon's modified Eagle's medium(DMEM)-F12干细胞条件培养基培养3～5 d后,再用含5%胎牛血清、脑源性神经营养因子和视黄酸的DMEM培养基诱导分化7～10 d,采用免疫荧光染色法分别鉴定去分化及再诱导分化后的细胞.结果 RT-PCR及免疫荧光染色结果显示,分离培养的视网膜Müller细胞纯度可达(95.17±2.68)%以上.干细胞条件培养基培养3～5 d后,大部分Müller细胞汇集形成细胞球,经免疫荧光染色法鉴定,显示细胞球内(95.26 ±1.35)%以上的细胞Nestin表达阳性,(90.33±4.12)%以上细胞BrdU表达阳性.将这些细胞球进一步诱导分化后,可见细胞球内细胞可向外扩展、铺开,分化出形态各异的细胞,其中约(21.14±1.49)%细胞表达神经节细胞特异性标记物Thy1.1阳性.结论 成年啮齿动物视网膜Müller细胞经体外条件培养基诱导后,可以产生具有增殖能力和分化潜能的神经干细胞,并可进一步定向分化为神经节样细胞,这为干细胞研究和视神经再生治疗等提供了新的方法和手段.     

低温冷冻对角膜缘干细胞生物学特性的影响

目的 评价低温冷冻保存对体外培养兔角膜缘干细胞生物学特性的影响.设计实验研究.研究对象新西兰白兔.方法 新西兰白兔20只（40眼）,制备2 mm周边角膜和2 mm球结膜的环形浅层角膜缘植片,待形成细胞单层后,将培养的细胞低温冻存1个月,然后复苏培养.将未冻存的细胞和冻存复苏后的细胞采用免疫细胞荧光染色、流式细胞仪检测,鉴定培养细胞的生物学特性,通过倒置显微镜、MTT比色法比较传代培养的角膜缘干细胞低温保存前后的形态结构和特性.主要指标角膜缘干细胞活性及生物学特性.结果 显微镜下观察冻存复苏后的细胞,与未冻存细胞相比,细胞状态差,贴壁时间晚,核浆比变小,形态不规则;免疫荧光细胞染色检测ABCG2单克隆抗体阳性率未冻存细胞为81.7%,低温冻存细胞降至46.9%,差异有统计学意义（P〈0.05）;流式细胞仪检测低温冻存细胞与未冻存细胞角膜缘干细胞占总细胞的比例分别为0.90%和2.43%,差异有统计学意义（P〈0.05）;MTT法检测低温冻存的细胞比未冻存细胞增殖活性降低,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 低温冻存后角膜缘干细胞的活性和生物学特性均受到严重影响,其冻存方法和复苏技术有待进一步改进.     

胎儿视网膜前体细胞的分离培养

目的建立视网膜前体细胞的培养方法。方法分离8~12周流产胎儿的视网膜神经上皮细胞，采用悬浮和贴壁两种方法分别进行培养和传代，取传代细胞用含5%胎牛血清的、无碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的培养基诱导分化培养14 d，并采用免疫荧光法检测培养细胞诱导分化前后前体细胞和视网膜终末细胞标记物表达的改变。结果悬浮培养的细胞形成神经球并表达神经干细胞的标记物巢蛋白nestin，但无法成功传代扩增；贴壁培养的细胞可连续传代并表达nestin，传代细胞诱导分化后表达视网膜终末细胞的标记物胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、β微管蛋白(β-tubulin)和恢复蛋白recoverin。结论从8～12周的人胚胎视网膜神经上皮分离培养的视网膜前体细胞具有体外扩增和多分化潜能。（中华眼底病杂志，2007，23：98-100）     

大鼠视网膜干细胞与神经干细胞体外增殖、分化特点比较

目的 通过对大鼠视网膜干细胞和神经干细胞体外增殖、分化特点进行比较,进一步明确视网膜于细胞自我更新及向神经细胞方向分化的能力.方法 实验研究.分离出生10 d大鼠睫状体区组织及新生大鼠脑组织,分别应用酶消化法将两种组织制成单细胞悬液,放入含有20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子及1×B27添加剂的无血清DMEM/F12培养液中培养,观察并比较视网膜干细胞及神经干细胞体外增殖的特点.分别取第2代细胞,应用免疫细胞化学染色法检测干细胞特异性抗原神经巢蛋白（nestin）及细胞分裂增殖标志物5-溴脱氧尿核苷（BrdU）的表达.同时,应用含50 ml/L的胎牛血清及1×N2添加剂的培养基促进其分化,观察两种细胞向神经细胞方向分化的特点：分别应用免疫细胞化学染色法对分化后的细胞nestin、神经无标志物神经元特异性烯醇酶（NSE）、神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白（GFAP）进行检测,并应用卡方检验对两种干细胞分化后的NSE及GFAP阳性细胞数比例进行比较.结果 两种细胞原代培养48 h后均可见小的球状细胞团悬浮生长,折光性强.原代培养约7 d后传代,传代后细胞能重新形成球状细胞团,应用免疫细胞化学染色方法均可检测到细胞内nestin及BrdU的阳性表达,视网膜干细胞体外增殖的能力较神经干细胞弱.两种细胞均可在血清诱导条件下转变为贴壁生长,并分化出具有神经细胞形态的细胞.诱导第7天进行免疫细胞化学染色,检测出两种干细胞表达nestin阳性细胞数比例分别为（9.5±3.5）%及（9.1±0.7）%.视网膜干细胞分化后NSE及GFAP的阳性细胞数比例分别为（11.2±2.8）%及（18.9＋2.1）%,低于神经干细胞分化后两种标志物阳性细胞数比例[（34.1±63）%及（41.9±3.3）%],NSE、GFAP在两组表达的差异均有统计学意义（x2=103.23,P＜0.05;x2=74.36,P＜0.05）.结论 来源于睫状体区的大鼠视网膜干细胞形态、体外增殖及可分化特性与神经干细胞相似,但其增殖及分化为神经细胞的能力较神经干细胞弱.     

转化生长因子-β2对体外培养的小鼠视网膜干细胞的诱导分化作用

目的研究转化生长因子（TGF）-β₂是否能促进体外培养的鼠视网膜干细胞的分化及其作用的强弱。方法小鼠胚胎在解剖显微镜下分离视网膜干细胞并进行培养，传代，nestin和chx-10免疫荧光鉴定；将第六代细胞进行诱导分化，并进行抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、抗opsin、抗b-tubulin、抗蛋白激酶C（PKC）免疫荧光染色，鉴定终末细胞。结果培养细胞经TGF-β₂诱导可向成熟细胞分化, 免疫荧光检测显示分化细胞的数量较胎牛血清诱导的分化细胞数量多。结论TGF-β₂能诱导视网膜干细胞分化为视网膜细胞；其诱导分化作用强于单独的血清诱导。(中华眼底病杂志, 2007, 23: 104-107)     

干细胞移植在视网膜疾病治疗中的应用前景

干细胞是具有自我更新、高度增生和多向分化潜能的细胞群。随着干细胞技术的不断发展以及其本身所具有的生物学特性，体外培养某些干细胞,定向诱导分化为所需的组织细胞以供某些疾病的治疗已成为研究的热点。干细胞在眼科的应用尚处于研究阶段，越来越多的实验显示干细胞具有作为细胞供体移植治疗视网膜疾病的应用潜能。（中华眼底病杂志，2007，23：147-149）     

人视网膜祖细胞和脑神经干细胞的体外培养和诱导分化研究

目的比较人视网膜祖细胞和脑神经干细胞的体外分化潜能。方法分离8-12周人胎儿神经视网膜和脑皮质、纹状体神经干细胞,进行无血清体外培养;采用光镜和免疫细胞化学或荧光免疫细胞化学染色方法,分别观察在无血清和10％胎牛血清培养条件下,两种来源的神经干细胞分化后的细胞特性。结果两种来源的神经干细胞,均能在体外有或无血清培养条件下增殖并分化。视网膜祖细胞不但表达视网膜祖细胞标志物Pax-6,也可表达神经干细胞标志物．巢蛋白（Nestin）、成熟神经元标志物-微管相关蛋白2（Map2）、星形胶质细胞标志物-胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、节细胞标志物Thy-1和视杆细胞标志物视紫红质（Rhodopsin）;脑神经干细胞也能表达这些特异性细胞标志物。血清诱导分化时,视网膜祖细胞较难贴壁,贴壁细胞球伸出少而短的突起,单个细胞形态不清;而脑神经干细胞球易贴壁并伸出较长突起交织成网,大量细胞从细胞球中沿突起徙出,单个细胞形态清晰。结论人胎儿视网膜祖细胞和脑神经干细胞体外培养均具有向神经元、胶质细胞及视网膜终末细胞分化的能力;两种干细胞在进行血清诱导分化时,细胞的贴壁、迁移能力及分化后的细胞形态均存在差异。（中华腠科杂志,2006,42：901．907）     

SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

目的 探讨视网膜神经细胞培养的上清液对胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES）体外分化的诱导作用。 方法 收集SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液，抽滤后按2∶3比例与DMEM培养液混合，用该混合液进行ES 细胞的诱导分化，每天倒置相差显微镜观察ES细胞的生长及分化情况,对诱导分化后的细胞进行神经丝蛋白(nellcofilament protein，NFP)免疫组织化学检查。 结果 加入了视网膜神经细胞培养上清液的ES细胞生长出类似神经细胞突起样结构，NFP免疫组织化学染色阳性。 结论 SD大鼠视网膜神经细胞培养的上清液具有诱导ES细胞向神经细胞分化的作用。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 134-136)     

胚胎和生后大鼠视网膜干细胞在体内和体外的分化差异

目的 研究胚胎和生后大鼠视网膜干细胞（RPCs）在体内和体外的分化.方法 取胚胎18 d和生后2周SD大鼠视网膜,分别用悬浮法及贴壁法培养.传至第1代后转入分别含10 ng/ml睫状神经营养因子（CNTF）、20 ng/ml表皮生长因子（EGF）、10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、10%视黄酸、10%胎牛血清的DMEM：F12中进行诱导分化,贴壁后2、3、5、6 d的细胞及胚胎18 d,生后1、3、5、7、14 d的大鼠视网膜切片分别行nestin、vimentin、opsin及GFAP的二步法免疫组织化学染色.结果 大鼠的RPCs在悬浮时呈球状生长,nestin染色阳性,悬浮培养传至第1代,贴壁培养传至第5代.CNTF、bFGF、EGF及视黄酸组在培养至6 d时可呈神经元样细胞改变,有轴突,但持续出现nestin阳性.生后2周的RPCs无法诱导成opsin阳性细胞.结论 RPCs可在体外培养并传代,其在分化过程中形态学的改变先于功能学变化.光感受器细胞的体外诱导较困难.     

体外培养及诱导胚兔视网膜及脑神经干细胞分化的研究

目的 比较体外不同培养条件对视网膜及脑神经干细胞(NSCs)视紫红质的纯化能力及不同诱导条件对NSCs的诱导分化能力.方法 取胚兔视网膜及大脑皮质制备单细胞悬液,分别在5种不同培养基中进行体外培养并纯化.选取无血清条件下传3代的NSCs,分别在2种培养基中诱导8～10 d.采用免疫荧光法及流式细胞仪检测所获得细胞的神经干细胞和视网膜神经上皮细胞抗原的表达.结果 免疫荧光法显示无血清培养条件下2种组织来源的NSCs均部分表达巢蛋白.流式细胞术显示2种诱导方式均部分细胞表达巢蛋白,较诱导前明显降低,而视紫红质及Thy1.1的表达均较诱导前明显增高.经5%胎牛血清(FBS)诱导的细胞表达视紫红质较联合应用全反式视黄酸(ATRA)时高,差异均有统计学意义(χ2=30.59,6.76;P<0.01).但Thy1.1表达低于后者,差异也有统计学意义(χ2=6.19,22.92;P=0.01).结论 无血清培养基添加N2、EGF、bFGF、LIF 4种因子可以获得最佳纯化效果.2种诱导培养基都能够诱导NSCs的分化,视网膜NSCs分化为视网膜神经上皮细胞的能力高于大脑皮质NSCs.     

Comparison of the proliferation and differentiation ability between adult rat retinal stem cells and cerebral cortex-derived neural stem cells

Recent studies have demonstrated that retinal stem cells (RSCs) and stem cells of the central nervous system both exhibited the abilities of self-renewal, proliferation and differentiation into multilineage. In the present study, we compared the proliferation and differentiation abilities between RSCs and cerebral corticex-derived neural stem cells (CNSCs) of adult rats. Stem cells isolated from pigmented ciliary margins of eyes and cerebral cortical tissues of adult rats were cultured in 96-well plates that contained serum-free medium with epidermal growth factor (EGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF). In contrast to RSCs, which stopped proliferating after the 8th week, the total cell count of neurospheres in CNSCs increased twofold at the 5th week and more than fourfold at the 10th week after in vitro culture. In contrast, RSCs stopped proliferating after 8 weeks of culture. After adding 2% fetal calf serum and withdrawing EGF and bFGF from the culture medium, the percentages of nestin-positive cells(20.6 +/- 2.7%), microtubule-associated-protein-2-positive neurons (33.2 +/- 3.9%) and glial-fibrillary-acidic-protein-positive glial cells(51.3 +/- 6.2%) in the differentiated CNSCs were significantly higher than those in the differentiated RSCs (10.2 +/- 1.9, 22.3 +/- 1.3 and 44.6 +/- 5.1%, respectively; p < 0.05). We also found that the combination of transforming growth factor beta type III with retinoic acid played an important role in the induction of CNSCs to differentiate into opsin-positive cells. Our data demonstrated that CNSCs displayed a higher ability of proliferation and retinal lineage. This report also offers an alternative protocol of cell reproduction for producing retinal cells.     

超顺磁性铁纳米颗粒标记对视网膜前体细胞体外培养的影响

目的:探讨超顺磁性铁纳米颗粒(SPIO)标记对视网膜前体细胞体外培养的影响并对其进行量化,探求SPIO标记视网膜前体细胞的最佳浓度。方法:来源于19d胚胎大鼠的视网膜前体细胞,以不同浓度SPIO标记(Fe3+颗粒浓度为5.6,11.2,16.8,22.4mg/L)24~48h后,进行形态学观察和流式细胞技术、MTT和Turnel等技术分析,研究细胞增殖和凋亡情况。结果:当SPIO标记浓度低(<5.6mg/L)时,细胞生长不受影响但转染效率较低(<60%),无法满足MRI示踪的要求;浓度高(>22.4mg/L)时符合MRI示踪要求,但标记物对细胞产生毒性,影响其生长;浓度11.2~16.8mg/L时,既不影响细胞生长,也能达到较好的转染效率。结论:SPIO标记浓度在11.2~16.8mg/L范围内时为最佳,标记效率较高且不影响细胞的体外分化培养。     

视黄酸联合视网膜细胞培养上清液对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

目的：探讨经过初步诱导的拟胚体在视黄酸和视网膜细胞培养上清液作用下的分化特征。方法：将胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)自液氮中复苏、培养，传1代后进行拟胚体(embry-onic bodies,EB)培养。3天半的EB离心重悬后不作消化，使用视黄酸、视黄酸加鼠视网膜胶质细胞和神经细胞培养上清液、视黄酸加人视网膜色素上皮培养上清液、视黄酸加人胎儿视网膜胶质细胞培养上清液(分别记为A、B、C、D组)等进行诱导。观察诱导过程中形态学改变，培养3周时使用免疫细胞化学检测Nestin、GFAP、cytokeratin、MAP-2、rhodopsin等在诱导后细胞中的表达情况。结果：(1)形态学改变：4种条件下的早期改变基本相同，均可见多种形态的细胞；3周后：拟胚体结构基本已散开，A组：见多种形态的细胞，细胞边界欠清，饱满度下降；B组：细胞以透明度较高的圆形细胞为主；C组：拟胚体及拟胚体周围的细胞中出现了含有明显色素的细胞；D组诱导：细胞胞体较大，形态结构较为单一；(2)免疫细胞化学：4种条件下均表现为大部分细胞MAP—2阳性，未见Nestin阳性细胞；此外，A组中，未见GFAP、Cytokeratin、Rhodopsin阳性细胞；B组中，可见GFAP、Cytokeratin、Rhodopsin阳性细胞；C组仅见Cytokeratin阳性细胞；D组仅见GFAP阳性细胞。结论：在KSC的次级诱导中，视黄酸可以诱导大部分细胞成为神经细胞，多种视网膜细胞的上清液在诱导中具有一定的作用，ESC能被诱导形成与上清液来源细胞相关的细胞。眼科学报2003；19：122-125     

移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠变性性视网膜病变

目的 观察视网膜下腔移植大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)治疗碘酸钠诱发的变性性视网膜病变的效果.方法 Brown-Norway(BN)大鼠120只,分为碘酸钠注射模型组、rMSCs移植治疗模型组、正常对照组,每组各40只大鼠.模型组大鼠通过尾静脉注射碘酸钠建立变性性视网膜病变模型,正常对照组大鼠给予生理盐水注射.通过视网膜眼底照相、荧光素眼底血管造影、视网膜电图(ERG)和组织学方法鉴定视网膜色素上皮(RPE)和神经视网膜损伤,进一步使用原位凋亡检测(TUNEL)的方法对碘酸钠诱导视网膜变性的细胞病理学变化进行观察.原代分离rMSCs后进行流式细胞术鉴定,将CM-DiI荧光染料标记的rMSCs移植到受体动物的视网膜下腔,采用临床检查手段结合组织学检查方法对细胞疗法进行评估.在移植手术后14～60 d,检查rMSCs的存活,整合和分化情况.结果 在碘酸钠注射14 d内,模型组大鼠视网膜的功能逐渐衰竭,呈现时间依赖的关系.模型组大鼠RPE细胞破坏后,光感受器细胞外节出现断裂、缩短的变化直到核同缩.细胞核形态变化和TUNEL标记的结果表明光感受器细胞的死亡主要是凋亡.经过rMSCs移植.供体细胞能够存活并散在分布于视网膜下腔,分化为RPE细胞.ERG检查结果显示,60 d后模型组ERG b波改善率为27.80%,模型组ERG震荡电位(Ops)改善率为59.38%;表明rMSCs移植治疗模型组大鼠视网膜功能得到明显保护.结论 经过rMSCs移植,碘酸钠诱发的视网膜变性可以得到有效地治疗,移植后的rMSCs能够存活,分化为RPE细胞.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的可行性研究

目的 探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)向视网膜色素上皮(RPE)细胞分化的可行性.方法 采用贴壁筛选法分离、培养Brown-Norway(BN)rMSCs.将反复冻融制成的BN大鼠RPE细胞裂解液加入到rMSCs培养体系中,鉴定被诱导的细胞是否同时表达RPE细胞的特征性标记物细胞角蛋白(CK)与S-100.结果 经RPE细胞裂解液诱导的rMSCs生长速度减慢,细胞呈长梭形,周边有毛刺样突起.免疫印迹法和双重免疫荧光标记显示部分经诱导的细胞同时表达CK与S-100.流式细胞术显示14.1%的细胞能够同时表达CK与S-100.结论 rMSCs经RPE细胞裂解液诱导后能够向RPE细胞方向分化.     

角膜干细胞增殖与分化表达实验研究

目的 了解角膜缘干细胞体外生长的增殖分化特性,检测上皮细胞生长因子对干细胞增殖的促进作用。方法 采用ＤＭＥＭ和Ｆ１２培养基进行兔角膜上皮细胞培养,用克隆形成率（ＣＦＥ）、免疫组化染色和蛋白质免疫印迹等方法检测细胞的增殖力和分化表达状况。结果角膜缘干细胞（ＬＣ）在本培养条件下能够正常传代生长５代,ＣＦＥ为（５．０７±２．３５）％,而角膜中央上皮细胞（ＣＣ）仅第１次传代生长,ＣＦＥ为（１．１２±０．８