角膜缘干细胞培养体系的研究进展

正常角膜上皮形态稳定和功能的维持是依靠角膜缘干细胞的不断增殖和移行来实现。近年来，角膜缘干细胞的重要作用逐渐被人们所认识。本文从角膜缘干细胞的定位、体外取材、分离培养、培养条件的选择、常用体外培养的载体、鉴别方法等对角膜缘干细胞培养体系进行综述。     

角膜缘干细胞研究新进展

位于角膜最外层的角膜上皮细胞,正常损耗或创伤后,由角膜缘干细胞不断自我更新补充。当损伤等致角膜缘干细胞缺乏时,则会导致角膜溃疡、新生血管、混浊等角膜病变而影响视力。目前治疗这些角膜疾病的重要方式之一为移植体外培养的角膜缘干细胞。本文将从角膜缘干细胞的定位、体外培养、新细胞来源等方面进行综述。     

兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻兔角膜缘干细胞体外培养方法。方法 分别用20％小牛血清营养液和20％胎牛血清营养液兔角膜缘干细胞行体外培养，观察细胞贴壁生长情况；同时对生长良好的原代细胞进行消化传代，进一步观察传代细胞的形态和生长情况。结果 20％胎牛血清营养液组，角膜缘干细胞在培养48－72h有80％贴壁生长，7－10天形成良好单层，细胞呈圆形、卵圆形或多边形，类似角膜上皮细胞；传代培养细胞形态仍正常，生长良好，但混有成纤维细胞。20％小牛血清营养液培养72h，仅有20％细胞贴壁生长，且细胞形态极不规则，有细胞“拉网”现象，培养14天仍未形成单层。结论 角膜缘干细胞的培养较常规细胞培养难，需要特殊培养基。20％胎牛血清营养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。     

培养的角膜缘干细胞移植研究进展

由于传统治疗方法的局限性，培养的角膜缘干细胞移植成为近年来眼表疾病研究的核心内容之一。动物实验和基础临床研究证实，培养的角膜缘干细胞移植能有效恢复眼表正常结构，具有较多优越性，但仍有诸多问题亟待解决。本就其近年的进展进行综述。     

角膜干细胞和角膜缘缺陷症

本文总结了近年来国内外有关角膜干细胞的概念，组织学鉴定、细胞生物学特征、增殖调节以及由于角膜缘功能障碍导致角膜干细胞丧失后引起的角膜缘缺陷症及其临床表现，对认识干细胞在角膜疾病中的重要作用具有一定意义。     

角膜缘干细胞的研究进展

健康的角膜上皮是维系完整的眼表以及良好视功能的前提条件,角膜上皮的稳定是由一群位于角膜缘基底部的干细胞实现的。一、角膜缘干细胞的概念Davanger和Evensen[1]于1971年首次观察到角膜缘色素样细胞作水平向心运动,推测角膜上皮细胞更替源于角膜缘,提出了角膜缘干细胞(limbalstem     

角膜缘干细胞不同载体培养的研究进展

角膜缘干细胞缺乏所致眼表疾病已成为重要的致盲角膜病之一,而体外培养的角膜缘干细胞移植是治疗眼表疾病的重要途径。其中载体的选择是成功的关键。本文将从不同载体的生物特性,用于培养干细胞的可行性及优缺点等方面,阐述选择合适的载体培养角膜缘干细胞的研究进展。     

角膜缘干细胞在重建眼表中的作用研究进展

正常角膜上邓小平的完整性依赖于基底层角膜缘干细胞的不断增殖。角膜缘于细胞对角膜上皮的再生起着重要的作用。如果角膜缘干细胞因各种原因严重缺乏，会导致持续性角膜上皮糜烂、角膜新生血管和假性翼状胬肉形成，角膜的完整性和透明性将受到破坏。本对角膜缘干细胞的性质、特点、分布、检测、各种干细胞移植术、干细胞的体外培养及其适宜的载体等进行综述，以便对角膜缘干细胞进行更深入的研究。     

角膜缘干细胞缺乏的临床诊疗

许多严重的眼表疾病与角膜缘干细胞缺乏相关:先天性无虹膜症、眼表烧伤、接触镜相关眼病、眼表多次手术、长期局部滴眼剂损伤和各种眼表自身免疫性疾病等都将因角膜缘干细胞缺乏导致角膜结膜化或血管化而致盲。本文对角膜缘干细胞缺乏的诊疗原则作一系统介绍,着重讨论角膜缘干细胞移植术的多种术式和术后处理。     

人角膜上皮干细胞生物学特性的研究

目的 建立人角膜上皮干细胞体外培养体系，并探讨体外培养的人角膜干细胞的鉴定方法，从其生物学特性方面，为角膜上皮干细胞移植奠定基础。方法 采用低钙培养法对人角膜缘基底层细胞组织块进行培养。从生长特性、光镜特征、超微结构特点以及免疫细胞化学方面进行鉴别。结果 培养细胞呈多边形典型上皮细胞形态生长。电镜下可见张力丝等典型上皮细胞结构。单克隆抗体4Gl0．3染色，大部分阳性；AE5染色，绝大多数为阴性。结论 用无钙培养基与低钙培养基结合可获得较纯的、未分化的角膜干细胞。其鉴定应综合鉴别。     

角膜缘干细胞培养及研究进展

角膜缘干细胞是一种特殊类型的细胞,位于角膜缘基底上皮层,在角膜上皮更新和创伤愈合中起重要作用。对于角膜缘干细胞缺乏或功能障碍的疾病,培养角膜缘干细胞进行移植将是一种重要且有效的治疗方法。对角膜缘干细胞的生物学特性和解剖定位、影响培养的干细胞增殖的调控因素、培养的角膜缘于细胞移植、移植所需载体的选择等方面的研究进展作一综述。     

供体因素对人角膜缘干细胞培养影响的研究

目的观察供体年龄及角膜新鲜程度对人角膜缘干细胞体外培养的影响。方法168例人角膜，按年龄分为A、B、C三组：按供体死亡至被培养的时间分为新鲜组和陈旧组。采用组织块培养法进行细胞培养，观察各组细胞开始生长时间及培养生长率。结果细胞开始生长时间及培养生长率在不同年龄组之间差异无显著性意义；但在较新鲜组与陈旧组之间差异有显著性意义；组织越新鲜，细胞生长越快，生长率越高。结论选取较新鲜的供体(≤8天)进行培养可获得好的培养效果，而不需过多考虑年龄因素。     

Identification and characterization of limbal stem cells

The maintenance of a healthy corneal epithelium under both normal and wound healing conditions is achieved by a population of stem cells (SC) located in the basal epithelium at the corneoscleral limbus. In the light of the development of strategies for reconstruction of the ocular surface in patients with limbal stem cell deficiency, a major challenge in corneal SC biology remains the ability to identify stem cells in situ and in vitro. Until recently, the identification of limbal stem cells mainly has been based on general properties of stem cells, e.g. lack of differentiation, prolonged label-retaining, indefinite capacity of proliferation exemplified by the clonogenic assay as well as their special role in corneal wound healing. During the last years, a number of molecular markers for the limbal SC compartment has been proposed, however, their role in distinguishing limbal SC from their early progeny is still under debate. Data reported from the literature combined with our own recent observations suggest, that the basal epithelial cells of the human limbus contain ABCG2, K19, vimentin, KGF-R, metallothionein, and integrin alpha9, but do not stain for K3/K12, Cx43, involucrin, P-cadherin, integrins alpha2, alpha6, and beta4, and nestin, when compared to the basal cells of the corneal epithelium. A relatively higher expression level in basal limbal cells was observed for p63, alpha-enolase, K5/14, and HGF-R, whereas there were no significant differences in staining intensity for beta-catenin, integrins alphav, beta1, beta2, and beta5, CD71, EGF-R, TGF-beta-RI, TGF-beta-RII, and TrkA between limbal and corneal basal epithelial cells. Therefore, a combination of differentiation-associated markers (e.g. K3/K12, Cx43, or involucrin) and putative SC-associated markers (e.g. ABCG2, K19, vimentin, or integrin alpha9) may provide a suitable tool for identification of human limbal SC. While most putative SC markers label the majority of limbal basal cells and, therefore, may not distinguish SC from progenitor cells, only ABCG2 was strictly confined to small clusters of basal cells in the limbal epithelium. At present, ABCG2 therefore appears to be the most useful cell surface marker for the identification and isolation of corneal epithelial SC. Moreover, the characteristics of the specific microenvironment of corneal SC, as provided by growth factor activity and basement membrane heterogeneity in the limbal area, could serve as additional tools for their selective enrichment and in vitro expansion for the purpose of ocular surface reconstruction.     

大鼠角膜缘上皮细胞培养与同体移植的实验研究

目的：观察以明胶为载体培养的角膜缘上皮细胞移植治疗角膜缘干细胞缺乏症的疗效。 方法：大鼠角膜缘上皮细胞在铺有明胶载体的细胞培养板上进行培养5d后,角膜上皮细胞移植术前24h用3H胸腺嘧啶核苷标记培养的角膜缘上皮细胞,培养标记的角膜缘上皮细胞对角膜缘干细胞缺乏的大鼠动物模型行角膜缘上皮细胞同体移植术,对移植术后角膜进行观察、病理学检查及同位素检测。 结果：大鼠角膜缘上皮细胞可以在明胶载体上培养、增殖、分化为密集角膜上皮细胞层;角膜缘上皮细胞移植术后角膜上皮完整、基质细胞浸润减轻、新生血管减少。病理学检查角膜缘及周边部上皮细胞为多层结构,角膜新生血管消失及基质中炎性细胞浸润减轻。角膜缘上皮细胞移植术后4wk受眼角膜仍可测到3H胸腺嘧啶核苷。 结论：角膜缘上皮细胞移植治疗角膜缘干细胞缺乏症可恢复角膜缘干细胞缺乏病变角膜上皮结构的完整性,减少角膜新生血管的形成,维持角膜缘干细胞的屏障功能,为角膜移值提供更好的条件。     

角膜缘niche细胞与基质细胞维持角膜缘干细胞功能的对比研究

目的比较角膜缘niche细胞(limbal niche cells,LNCs)与角膜缘基质细胞(limbal stromal cells,LSCs)在维持角膜缘干细胞功能上的不同特性。方法将LNCs和LSCs分别从6个角膜缘组织分离,并在相同的条件下培养、传代。LNCs与LSCs经丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)处理后分为LNCs组与LSCs组作为饲养细胞分别与角膜缘干细胞共培养,比较两组角膜缘干细胞克隆形成率(colony-forming efficiency,CFE)、上皮细胞复层化以及细胞标志物和部分基因的表达。结果 LNCs组角膜缘干细胞CFE(6.57±1.54)%高于LSCs组(1.43±0.47)%。LNCs组细胞复层上皮数(4～5层)多于LSCs组(2～3层)。角膜缘干细胞克隆与免疫荧光染色及mRNA半定量分析结果显示,LNCs组比LSCs组表达了更多干细胞标志物ΔNp63,能更有效地维持角膜缘干细胞的细胞特性。逆转录PCR分析结果显示,LNCs组与LSCs组都分泌了一些维持角膜缘干细胞生长的生长因子,但LNCs组比LSCs组高表达上皮型钙黏蛋白(E-cad...     

人牙周膜干细胞、脐带间充质干细胞对体外培养角膜缘干细胞的影响

目的　比较人牙周膜干细胞（ｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＨＰＤＬＳＣｓ）、人脐带间充质干细胞（ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＨＵＣＭＳＣｓ）作为饲养层培养角膜缘干细胞（ｌｉｍｂａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＬＳＣｓ）的优越性,从而筛选出扩增ＬＳＣｓ的最佳饲养层。方法　体外分离培养ＨＰＤＬＳＣｓ、ＨＵＣＭＳＣｓ,诱导细胞成脂、成骨分化,并检测细胞表面标志物的表达;将兔ＬＳＣｓ与ＨＰＤＬＳＣｓ、ＨＵＣＭＳＣｓ、ＮＩＨ-３Ｔ３共培养和无饲养层单独培养,比较各组克隆形成率,免疫荧光比较各组ＬＳＣｓ克隆团ＡＢＣＢ５、ＩＰＯ１３、ＣＫ３／１２的表达情况。结果　体外培养ＨＰＤＬＳＣｓ、ＨＵＣＭＳＣｓ均可向脂肪、成骨细胞分化,两种细胞均高表达间充质来源的表面标志ＣＤ９０,不表达ＣＤ４５;三组饲养层与兔ＬＳＣｓ共培养均可形成小克隆团, ＨＰＤＬＳＣｓ组、ＨＵＣＭＳＣｓ组、ＮＩＨ-３Ｔ３组、无饲养层组克隆形成率分别为（４．９０±０．９６）％、（４．１０±０．５６）％、（４．６７±０．７６）％、（０．８３±０．３５）％,四组间总体比较差异有统计学意义（Ｆ＝２２．０４７,Ｐ＝０．００）;ＨＰＤＬＳＣｓ组、ＨＵＣＭＳＣｓ组与ＮＩＨ-３Ｔ３组的克隆形成率差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）;ＨＰＤＬＳＣｓ组、ＨＵＣＭＳＣｓ组、ＮＩＨ-３Ｔ３组与无饲养层组间差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０１）。免疫荧光化学检测三种饲养层ＬＳＣｓ标志物ＡＢＣＢ５、ＩＰＯ１３呈高表达,ＣＫ３／１２呈低表达。结论　ＨＰＤＬＳＣｓ、ＨＵＣＭＳＣｓ均可作为替代饲养层用以培养ＬＳＣｓ。     

体外兔胚胎成纤维细胞为饲养层克隆兔角膜缘干细胞

目的研究兔胚胎成纤维细胞体外克隆兔角膜缘干细胞。方法兔胚胎成纤维细胞经丝裂霉素C(MMC)处理成饲细胞,用消化法培养兔角膜缘基底层细胞并接种于含有经MMC处理饲细胞的12孔培养板,进行原代培养。观察其光镜特征、电镜结构,用间接免疫细胞化学染色等对克隆的细胞进行综合鉴别。结果克隆的细胞呈典型的上皮细胞形态,电镜下可见微绒毛、桥粒、张力丝等典型上皮细胞结构,单克隆抗体AE1、PCNA染色后细胞大多数阳性,单克隆抗体AE5染色后细胞染色偶见阳性。结论体外兔胚胎成纤维细胞为饲养层成功地克隆出兔角膜缘干细胞。     

角膜上皮干细胞的体外生长特征

目的　了解角膜上皮干细胞的生长特性。方法　用体外细胞培养的方法 ,从生长曲线、细胞倍增时间、细胞 DNA合成的活跃程度等几个方面 ,观察人角膜缘部、周边部及中央部角膜上皮细胞的生长特征。结果　角膜缘部细胞群体倍增时间最短 (4 9.79h±1.2 6 h) ,周边部次之 (6 4.89h± 2 .18h) ,中央部最长 (78.86 h± 1.38h) ,3组两两比较 P<0 .0 1;角膜缘部角膜上皮细胞 DNA合成最活跃 (CPM值 92 7.75± 47.94) ,周边部次之(CPM值 711.75± 2 9.47) ,中央部最弱 (CPM值 5 14.0 0± 72 .82 ) ,3组两两比较 P <0 .0 1。结论　结果进一部证实了角膜上皮干细胞存在于角膜缘的观点 ;也反映了角膜缘在角膜上皮创伤愈合 ,角膜上皮完整与稳定性维持过程中起着重要的作用