1 去神经支配骨骼肌提取液对离散运动神经元存活的影响

<正>取15天龄SD鼠胚的脊髓腹侧半制成单细胞悬液,用低亲合性的神经生长因子受体P75NGFR的抗体(192IgG)结合出其中的运动神经元,再将运动神经元洗脱下来接种培养.运动神经元来自15只鼠胚的脊髓,分别接种于20只培养孔,并将20只分为二组,一组的培养基为DMEM,另一组培养基为DMEM加去神经支配骨肢肌提取液.以胞体无空泡,轴突长度大于二倍胞体直径为存活标准,于细胞接种后3小时计数各组的细胞总数,以后每隔24小时计数一次.并在接种后24小时时每组各取二孔进行乙酞基胆碱转移酶活性(CHAT)的检测.结果,5天后DMEM组内的运动神经元几乎全部死亡并漂浮于培养液表面,而DMEM+去神经支配骨骼肌提取液组在8天时仍有近20%的运动神经元保持存活.我们的结论是:1.去神经支配骨骼肌提取液可以明显延长离散运动神经元的存活期;2.用192IgG可以很方便地从脊髓腹侧半制成的单细胞悬液中结合出运动神经元,同时防止其它细胞的混入,提高培养的运动神经元的纯度.与传统的用HRP逆行标记运动神经元后再培养的方法相比,运动192IgG还具有消除HRP对体外培养的运动神经元存活的影响和增加获得的运动神经元的数量等优点.     

人胚肢芽、骨骼肌提取液的运动神经营养活性研究

目的:从人胚胎肢芽、骨骼肌中提取对运动神经元具有生物活性的神经营养因子。方法:用人胚胎肢芽、骨骼肌制备提取液,以成年Wistar大鼠骨骼肌提取液及生理盐水为对照,在切断单侧坐骨神经的Wistar乳鼠动物模型上,检测运动神经营养活性。结果:在损伤侧局部注射提取液,术后30天损伤侧腰髓运动神经元存活率:第2月人胚肢芽提取液组为73.7％;第4～5月胎儿骨骼肌提取液组为67.2％;成年大鼠骨骼肌提取液组为48.2％;生理盐水空白对照组为25％。结论:人胚胎肢芽、骨骼肌提取液与两个对照组相比均显示了明显的运动神经元营养活性。     

失神经支配肌肉提取液对创伤性运动神经元胞体死亡的保护作用

周围神经损伤后的功能恢复常不尽如人意，原因之一是周围神经损伤会导致一定数量的神经元胞体死亡。对于感觉神经元胞体的退变死亡，于损伤局部连续施用神经生长因子即可取得较好的保护效应，但对于运动神经元胞体的损伤性死亡，目前尚无一种有效的保护因子。作者从失神经支配肌肉能诱导其邻近的正常运动神经纤维发芽生长这一现象受到启发，研究了失神经支配肌肉提取液（ＤＭＥ）对周围神经损伤所导致的运动神经无胞体死亡的保护作用。结果表明，用失去神经支配后５ｄ的骨骼肌制成的提取液最具运动神经元营养活性。经乳鼠坐骨神经损伤实验模型检测，这种自制的ＤＭＥ能保护８７．６％的脊髓腰段前角运动神经元在坐骨神经损伤后一个月继续存活，而正常骨骼肌提取液的保护率仅为３７．３％。如不加以保护，则神经元胞体的存活率仅为８％。本研究结果提示骨骼肌的失神经支配可能会引起肌肉的某些代谢的改变，从而合成和分泌一些靶源性运动神经营养因子。     

胎鼠肢芽提取液生物活性研究

目的：从胎鼠肢芽中提取运动神经元具有生物活性的神经营养因子，方法：用Ｗｉｓｔａｒ大鼠第１５天胎鼠肢芽制备提取液，以成年Ｗｉｓｔａｒ大鼠骨骼肌提取液及生理盐水对对照，在切断坐骨神经的乳鼠动物模型上，检测其运动神经营养活性，用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电脉对两种提取液组份进行对比。结果：术后３０天损伤侧相应的腰髓运动神经元存活率，注射肢芽提取液组为７９．２％，成体骨骼肌提以液组为４２．１％，生理盐水组为２     

肌源性神经营养因子(MDNF)对体外培养的大鼠脊髓运动神经元缺氧时Bcl-2表达的影响

为证明大鼠肌源性神经营养因子对损伤神经的保护作用 ,本文观察了此因子对缺氧时体外培养的大鼠脊髓运动神经元Bcl-2表达的影响。本实验从成鼠和乳鼠骨骼肌中提取肌源性神经营养因子 ,取 10 0μl (0 .1μg/ml)加入培养的胚胎大鼠脊髓运动神经元的培养液中 ,对照组加入等量的 PBS。然后用液体石蜡封闭液面造成神经元缺氧损伤 ,3 d后行 Nissl染色和免疫组化反应 ,观察和计数大鼠脊髓运动神经元存活数以及 Bcl-2免疫反应阳性神经元数 ,并对 Bcl-2阳性神经元作平均光密度分析。结果发现 :经成鼠和乳鼠肌源性神经营养因子孵育的脊髓运动神经元缺氧后的神经元存活数、Bcl-2阳性神经元数以及平均光密度均明显高于对照组 ,但乳鼠肌源性神经营养因子的效果更好。提示 :大鼠肌源性神经营养因子能增强缺氧时脊髓运动神经元 Bcl-2的表达 ,抑制缺氧后运动神经元的死亡 ,以乳鼠肌源性神经营养因子的效果为最好     

肌源神经营养因子(MDNF)对体外培养大鼠脊髓运动神经元划伤后Bcl-2表达的影响

为检测大鼠肌源神经营养因子对体外培养大鼠脊髓运动神经元划痕损伤后 Bcl-2表达的影响 ,本实验从成鼠和乳鼠骨骼肌中提取出肌源神经营养因子。在胎鼠脊髓运动神经元培养第 7d时将其随机分成对照组和实验组 (成鼠组和乳鼠组 ) ,取 10 0μl肌源神经营养因子 ( 0 .1μg/ ml)加入实验组 ,对照组加入等量的 PBS,同时进行划痕损伤。损伤后第 3d计数各组存活的运动神经元 ,行 Nissl染色和免疫组化反应 ,计数 Bcl-2免疫反应 ( Bcl-2 -IR)阳性神经元数量 ,并在图像分析仪上对 Bcl-2 -IR阳性神经元作光密度分析。结果发现 ,损伤后第 3d,实验组运动神经元存活数 ,Bcl-2 -IR阳性神经元数和平均光密度均明显高于同期对照组 ,而乳鼠肌源神经营养因子组功效优于成鼠肌源神经营养因子组。结果提示 ,大鼠肌源神经营养因子对体外培养的受损运动神经元具有增强 Bcl-2表达、减少凋亡和损伤修复等作用 ,且乳鼠的此因子效能尤佳     

限定骨骼肌提取液（ME，10～50kDa）影响培养的大鼠脊髓腰段运动神经元生长的定量研究

用胎鼠的限定骨骼肌提取液（ＭＥ，１０～５０ｋＤａ）作用于无血清培养的胚胎大鼠脊髓腰段腹角细胞后，用四唑盐（ＭＴＴ）微量自动比色定量法和ＬＤＨ活性测定法检测了骨骼肌提取液对大鼠脊髓运动神经元生长存活的生物活性，结果显示：细胞培养４ｄｉｖ后，ＭＴＴ微量比色的ＯＤ值随加入骨骼肌提取液浓度的增加而升高，含骨骼肌提取液２００和４００μｇ／ｍｌ蛋白的实验孔与单纯无血清的对照孔比较有极显著性差异（Ｐ＜０．００１），说明２００μｇ／ｍｌ以上浓度的骨骼肌提取液对脊髓腹角神经元的生长有明显的促进作用。细胞培养１４ｄｉｖ后，ＬＤＨ活性测定ＯＤ值的线性回归斜率亦随加入骨骼肌提取液浓度的增加而升高，说明存活细胞数的增加。实验说明培养神经细胞的ＭＴＴ和ＬＤＨ的检测方法有可能成为评估运动神经营养因子活性的指标。     

人胚胎脑提取液的运动神经营养活性研究

目的 从人胚胎脑中提取对运动神经元具有生物活性的神经营养因子。方法 用人胚胎脑组织制备提取液,以成年Wistar大鼠脑提取液及生理盐水为对照,在切断坐骨神经的乳鼠动物模型上,检测运动神经营养活性。结果 在损伤侧局部注射提取液,术后30天损伤侧腰髓运动神经元存活率;第2月人胚脑提取液组为81.4％;第4～5月胎儿脑提取液组为80.7％;成年大鼠脑提取液为50.7％;生理盐水空白对照组为25％。结论 人胚胎脑提取液与两对照组相比具有明显的运动神经营养活性。     

备用根大鼠脊髓后角组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性测定

<正> 我室新近的研究发现,部分去传入纤维支配的脊髓后角组织提取液含有神经营养活性组份,其分子量约在40KD～78KD之间,但不清楚是那种分子量的蛋白质具有神经营养活性作用.为了寻找这种物质,本研究应用Superdex G-75prep grad凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)层析和细胞培养等技术和方法,进一步分离纯化备用根大鼠部分去传入纤维支配(手术侧)的脊髓后角组织提取液,以期获得某种神经营养活性物质.用SD雄性大鼠100只,切除其一侧L_1-L_3、L_5和L_6背根,仅保留L_4背根(此动物为备用根模型大鼠),术后5天处死动物.分别切取L1_～L_6节段的手术侧和非手术侧脊髓后角组织,制备成提取液、凝胶层析洗脱液和PHLC层拆洗脱液.结果发现,手术侧脊髓后角组织提取液具有神经营养活性作用,将该提取液经Superdex G-75prep grade凝胶层析和PHLC层析后,得到的A峰洗脱液具有促进体外培养鸡胚背根节(DRG)分离神经元存活及其神经突起生长的神经营养活性作用.经SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳(PAGE)显示,A峰洗脱液呈现一条分子量约为60kD的蛋白质主带.结合生物活性检测结果,我们推测分子     

限定骨骼肌提取液（ME,10—50kDa）影响培养的大鼠脊髓腰段运动神经元生长的

用胎鼠的限定骨骼肌提取液（ＭＥ，１０￣１５ｋＤａ）作用于无血清培养的胚胎大鼠脊髓腰段腹角细胞后，用四唑盐（ＭＴＴ）微量自动比色定量法和ＬＤＨ活性测定检测了骨骼肌提取液对大鼠脊髓运动神经元生长存活的生物活性，结果显示：细胞培养４ｄｉｖ后，ＭＴＴ微量比色的ＯＤ值随加入骨骼肌提取液浓度的增加而升高，含骨骼肌提取液２００和４００ｕｇ／ｍｌ蛋白的实验孔与单纯无血清的对照孔比较有极显著差异（Ｐ〈０．００１），     

肌源神经营养因子（MDNE）对体外培养大鼠脊髓神经元划伤后Bcl—2表达的影响

为检测大鼠肌源神经营养因子对体外培养大鼠脊髓运动神经元划痕损伤后Bcl-2表达的影响，本实验从成鼠和乳鼠骨骼肌中提取出肌源神经营养因子。在胎鼠脊髓运动神经元培养第7d时将其随机分成对照组和实验组（成鼠组和乳鼠组），取100μl肌源神经营养因子（0.1μg/ml)加入实验组，对照组加入等量的PBS，同时进行划痕损伤。损伤后第3d计数各组存活的运动神经元，行Nissl染色和免疫组化反应，计数Bcl-2免疫反应（Bcl-2－IR）阳性神经元数量，并在图像分析仪上对Bcl-2－IR阳性神经元作光密度分析。结果发现，损伤后第3d，实验组运动神经元存活数，Bcl-2-IR阳性神经元数和平均光密度均明显高于同期对照组，而乳鼠肌源神经营养因子组功效优于成鼠肌源神经营养因子组。结果提示，大鼠肌源神经营养因子对体外培养的受损运动神经元具有增强Bcl-2表达，减少凋亡和损伤修复等作用，且乳鼠的此因子效能尤佳。     

备用根大鼠脊髓后角组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性测定

目的　进一步分离纯化备用根大鼠部分去传入纤维支配 (手术侧 )的脊髓后角组织提取液 ,以获得某种神经营养活性物质。　方法　用 Superdex G- 75 prep grade凝胶层析、高效液相色谱 (HPL C)层析和细胞培养等技术分离和检测神经营养活性物质。　结果　手术侧脊髓后角组织提取液经 Superdex G- 75 prep grade凝胶层析和 HPL C层析后 ,得到的 A峰洗脱液具有促进体外培养鸡胚背根节 (DRG)分离神经元存活及其神经突起生长的神经营养活性作用。经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)显示 ,A峰洗脱液呈现一条分子量约为 6 0 k D的蛋白质主带。　结论　结合生物活性检测结果 ,分子量约 6 0 k D的蛋白质可能是手术侧脊髓后角组织的神经营养活性物质     

不同发育期鸡胚脊髓背角提取液的神经营养活性初探

为了探讨在发育过程中鸡胚脊髓背角提取液的神经营养活性作用 ,分别取 Hamburger3 0期和 40期鸡胚的脊髓背角组织制成条件培养液 ,以 Hanks平衡盐溶液代替背角提取液设置对照组。实验组分别培养了两时相的脊神经节及其神经元。培养48h时测量各组每个脊神经节神经元的神经突起平均长度及神经元存活数。结果 :两时相实验组的神经元存活数量均明显大于对照组 (P<0 .0 5 ) ;而神经突起长度仅 40期组者大于对照组 (P<0 .0 5 )。另外 ,40期组脊神经节神经元的神经突起长度及神经元存活数量也明显高于 3 0期者。提示 ,两时相脊髓背角内均存在某些初级感觉神经元诱向因子。但在不同的发育阶段脊髓背角的神经营养活性却有变化。     

骨骼肌提取液对大鼠坐骨神经损伤所致腰段脊髓腹角和背根节神经细胞溃变的影响

用ＣＴ－ＨＲＰ逆行追踪法及ＣｈＡＴ单克隆抗体的ＡＢＣ免疫组织化学技术研究了新生大鼠骨骼肌提取液（ＭＥ，２０～５０ｋＤ）对钳夹大鼠坐骨神经所致的腰骶部脊髓腹角和背根节神经细胞溃变的影响。实验结果显示：注射ＭＥ实验组的脊髓腹角运动神经元和背根节细胞的存活均数与注射盐水的对照组相比，其比值为６：０，有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。提示骨骼肌提取液（２０～５０ｋＤ）对脊髓腹角运动神经元和背根节感觉神经细胞的演变有明显的保护作用。     

新生小鼠端脑神经干细胞可诱导分化为运动神经元

目的 探讨新生小鼠端脑神经干细胞诱导分化为运动神经元的可能性,并探索新的运动神经元诱导因子.方法 用悬浮培养法从新生小鼠端脑分离培养神经干细胞,按诱导因素的不同分为3组:组1为对照组,诱导因素为生长培养基+5%胎牛血清(FBS);组2为诱导因子组,诱导因素为生长培养基+5% FBS+视黄酸(RA)+Shh+联丁酰基环磷酸腺苷(dbcAMP);组3为骨骼肌细胞培养液组,诱导因素为骨骼肌细胞生长过的培养液.用双重免疫荧光方法检测分化细胞的微管相关蛋白2(MAP2)和同源蛋白(HB9)的表达,以验证运动神经元的分化,每组随机选取12个标本计数.结果 分化培养中检测到MAP2和HB9共表达的运动神经元,组1的运动神经元分化比例为1%;组2的分化比例为4.7%;组3的分化比例为2.9%.与组1相比有显著的统计学差异.结论 新生小鼠端脑神经干细胞能诱导分化为运动神经元;骨骼肌细胞可能分泌运动神经元诱导因子.     

肌源神经营养因子(MDNF)对体外培养的大鼠脊髓运动神经元缺氧时p53表达的影响

本研究目的是观察缺氧时肌源神经营养因子(MDNF)对体外培养的大鼠脊髓运动神经元p53蛋白表达的影响。从成鼠和胎鼠骨骼肌中提取MDNF。在胎鼠脊髓运动神经元培养第7 d时将其分成对照组和实验组(包括成鼠MDNF组和胎鼠MDNF组),取100μl MDNF(0.1μg/ml)加入培养大鼠脊髓运动神经元的培养液中,对照组加入等量的PBS。然后用液体石蜡封闭液面造成神经元缺氧损伤,缺氧3 d后,应用Nissl染色、原位末端标记、免疫组化方法,对损伤的大鼠脊髓运动神经元进行检测。结果表明:培养的大鼠脊髓运动神经元缺氧3 d后,经MDNF孵育可使脊髓运动神经元TUNEL、p53表达均较对照组明显减弱,神经元损伤程度减轻,神经元存活数明显高于对照组,且胎鼠MDNF的效果更好。提示:大鼠脊髓运动神经元缺氧后可出现神经细胞凋亡,但胎鼠MDNF较成鼠MDNF更能减弱缺氧时脊髓运动神经元p53的表达,抑制缺氧后神经元的死亡。     

备用根大鼠脊髓后角组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性鉴定

<正> 本实验采用凝胶过滤层析法和高效液相色谱技术,分离纯化备用根大鼠部分去传入侧的脊髓后角组织中的神经营养活性物质.1.生物活性检测方法的建立:切除大鼠一侧背根和背根节(DRG),仅保留L-4背根为备用根.术后动物存活5天.分别切取L1-L6节段手术侧和非手术侧脊髓后角组织,制备含手术侧和非手术侧提取液的培养液.用此液分别培养鸡胚DRG,48小时后手术侧组DRG神经突起密度明显大于对照组和非手术侧组,提示去传入纤维支配的脊髓后角组织存在着促神经突起生长的神经营养活性物质.又采用改良的悬滴培养法,发现手术侧脊髓后角组织能支持鸡胚DRG神经元的存活,而且具有促进神经突起生长的作用.2.备用根大鼠脊髓后角组织神经营养活性物质的分离与纯化,部分背根切除术后5天处死动物,切取手术侧脊髓L1-L6节段后角组织,匀浆、离心后,取上清液经Superdex prep grade G-75凝胶过滤层析,呈现Ⅰ、Ⅱ二个洗脱峰,将各洗脱峰浪加入培养基,Ⅰ峰洗脱液表现有神经营养作用.将Ⅰ洗脱峰进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,银染后呈现多条明显的蛋白区带,去传入脊髓后角组织呈现神经营养活性的物质是在40-78KD之间.将Ⅰ峰洗脱液浓缩,进行高效液相色谱(HPLC)分析,得到4个不同的洗脱峰(a、b、c、d峰).将各洗脱峰液配制成不同浓度的     

大鼠骨骼肌35kD运动神经诱向因子单克隆抗体的产生和鉴定

为探究脊髓运动神经元诱向因予,用大鼠腓骨肌提取液(PMe)作Phast电泳,分离PMe中能促进脊髓前角神经元生长的35kD蛋白带免疫动物。细胞融合,经MTT微量比色筛选,获得2株抗大鼠骨骼35kD蛋白的单克隆抗体。命名为ME10,MG9。2株单抗对体外培养的脊髓前角运动神经元的生长活性显示抑制作用,MTT OD值分别为0.023±0.003,0.030±0.005,以ME10抑制效应更强。与单独加35kD蛋白凝胶时促进细胞生长的OD值0.050±0.002比较,差别有显著意义(ME10 P<0.01,G9P<0.05)。为鉴定ME10单抗的特异性,进行中和试验。结果发现:ME10对运动神经元生长的抑制作用被35kD蛋白特异性地中和,说明ME10是3kD蛋白特异性抗体。用ME10单抗进行免疫组化反应,在骨骼肌细胞浆内,运动神经末稍都有免疫反应阳性物质,表明从腓肠肌组织提取液中分离的35kD蛋白是由骨骼肌细胞产生的神经诱向因子。     

运动神经生长因子的研究概况

1975年Hamburger报告了来自骨骼肌的神经营养因子,成为近代研究运动神经生长因子(motor neuron growth factor,MNGF)的开端。1976年Hollday给鸡胚移植外来的腿,发现运动神经元自然死亡的比例下降。阐明了运动神经元对来自靶器官的神经营养因子     

NGF、CNTF和GDNF对感觉和运动神经元的协同作用研究

为探讨神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对感觉和运动神经元的协同作用机制,本研究采用免疫组织化学技术对脊髓背根节感觉神经元和脊髓运动神经元经特异性烯醇化酶(NSE)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)染色后,通过图像分析测量阳性神经元数量、胞体直径、突起数量及长度。结果表明:NGF能明显促进感觉神经元的存活,对突起发育有轻微作用,对胞体发育的作用不显著,对运动神经元的存活无明显作用;CNTF对感觉和运动神经元的胞体发育均有很强的作用,对感觉和运动神经元的存活有一定的作用;GDNF对感觉和运动神经元的突起发育和延伸作用最强,对运动神经元的存活有很强的促进作用,对胞体发育的作用不如CNTF显著。本研究结果提示:联合应用上述三种神经营养因子,可克服单一因子功能的局限,全面促进感觉和运动神经元的存活和生长。