原位杂交组织化学的进展及其应用

原位杂交组织化学(in situ hybridization histochemistry,ISHH)是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术,此技术的基本原理是通过已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针(probe),如双链或单链DNA探针、RNA探针、合成寡核苷酸探针,与组织细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合,形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统(如放射自显影、组织化学或免疫组织化学)在核酸原有的位置上把它显示出来,进而探测组织细胞内标记探针及其转录产物(mRNA)的定位。自1969年,Gall     

兔输卵管内皮素-1 mRNA阳性表达细胞的分布

为了探明内皮素－1在兔输卵管组织细胞中的来源,本文采用地高辛精标记ET－1 cRNA探针核酸原位杂交法对兔输卵管内皮素－1mRNA阳性表达细胞的分布进行了研究。结果显示,输卵管粘膜上皮细胞浆内可见ET－1mRNA阳性杂交信号,呈深蓝色,阳性杂交信号强且密集,该阳性杂交信号主要分布在细胞核的上方,靠近游离面。     

原位杂交法检测肝组织中输血传播病毒

采用对称和不对称PCR法 ,以地高辛素标记双链和单链探针 ,用原位杂交法检测了 56例肝组织中输血传播病毒 (TTV)核酸 ,以探讨TTV的致病性。发现 51例非甲～非庚型肝炎肝组织中TTV总检出率为 2 7.5% ( 1 4 /51 ) ;5例非肝炎肝组织杂交阴性。TTVDNA主要定位于肝细胞核内 ,受染肝细胞见于急性、慢性和重症肝炎的肝组织。双链探针杂交结果与单链探针检测病毒基因链的结果一致 ,2例 ( 2 /6)例组织TTV基因链与互补链同时存在。提示TTV是导致肝炎的一种新病原 ,并且在肝脏内有复制     

荧光原位杂交技术及其在医学中的应用

荧光原位杂交（fluorescenceinsituhydridization，FISH）是一种崭新的生物学技术．是利用非放射性标记核酸代替放射性标记核酸在染色体、细胞或组织切片上进行原位杂交，借助免疫细胞化学（immunocytochemistry）过程以荧光信号对杂交体（hubrids）加以检测和定位的方法。由于该方法具有安全、灵敏、快速、高效和分辨率高等优点，所以发展异常迅速，应用非常广泛。本文就此作一介绍。一FISH的原理同源互补的核酸（可以是DNA或mRNA）变性后，在适当的条件下，能退火、复性重新成为双链结构。如果被检测的靶标（DNA或mRNA）与所用核…     

FasL mRNA在椎间盘细胞中表达的分布

目的 观察凋亡相关基因FasL mRNA在椎间盘细胞中表达的分布.方法 收集胎儿及成人病理腰椎间盘髓核标本,PHA-P激活单个核细胞诱导FasL表达,提取总RNA,RT-PCR制备FasL基因片段.定向克隆入质粒载体pSPT19多克隆位点构建重组质粒,体外转录制备Dig-FasL cRNA探针.cRNA探针原位杂交进行FasL mRNA表达分布的观察.结果 克隆化FasL序列经DNA测序准确无误,体外转录cRNA探针标记效果满意;胎儿腰椎间盘组织脊索细胞、软骨样细胞中可检测到FasL mRNA的较高杂交信号,成人突出椎间盘细胞中罕见正常细胞,未检出FasL mRNA信号.结论 FasL基因在胎儿期腰椎间盘细胞内表达,细胞凋亡发生早.成年时期,细胞数急剧减少,代谢功能低下,无法检出凋亡基因表达.     

地高辛素标记DNA探针原位杂交的简便方法

原位杂交是将重组核酸分子杂交技术与组织细胞化学及免疫组织化学技术结合起来,在组织细胞原位显示某种特定基因、mRNA及其产物(特异蛋白质)的表达进行定位和定量检测的一项新技术。该方法用于组织和细胞学研究27年来[1],不论是对细胞内的DNA,还是mRNA已有大量成功的报告[2,3]。其中,DNA探针一般比RNA探针敏感,使用较方便,能选用各种标记方法,且杂交适宜温度的范围较宽。但操作程序较复杂,不易驾驭。     

用生物素化补骨脂素标记核酸探针的方法研究

补骨脂素在长波紫外光照射下与核酸分子的碱基发生共价结合。本实验对生物素化补骨脂素标记核酸的条件和效果进行了研究,发现该试剂不仅能标记双链DNA、单链DNA,更重要的是可以直接标记RNA及寡核苷酸。探针显色灵敏度可达1pg,杂交灵敏度可达2～5pg。     

生物素标记的6种cDNA探针检测S180及其克隆细胞株mRNA的表达

目的检测S180及其克隆细胞株S1B11及S2D9mRNA的表达,对这些细胞株进行识别和质量控制.方法用生物素标记的6种cDNA探针,细胞玻片原位杂交的方法检测细胞中mRNA的表达.结果北京市肿瘤研究所(肿瘤所)保存的S180与生物素标记的P16、c-fos、c-myc及c-jun探针杂交阳性,克隆细胞株S1B11与c-fos及c-jun探针杂交阳性,克隆细胞株S2D9与c-fos、c-myc及c-jun探针杂交阳性.结论肿瘤所S180及其2株克隆细胞中mRNA的表达不同,c-myc基因的表达与否可以把S1B11及S2D9克隆细胞区别开;细胞株致瘤性与癌基因表达有关.     

生物素标记DNA探针的研制(简报)

目前国内外应用核酸分子杂交技术检测外源基因以诊断病毒等微生物的感染,探测内源基因的多态性和缺陷以诊断遗传病和研究肿瘤。其中基因探针(即DNA探针)是关键,常用~32P放射性同位素标记DNA作探针。由于~32P脱氧核苷三磷酸半衰期短、价钱昂贵、主要依靠进口、以及保存和防护运输等原因,使基因诊断技术不能广泛应用。本文参考国外经验,用生物素标记的DNA作探针巳获得成功. 生物素标记的DNA是已知片断,例如作者用生物素标记HBV-DNA及Y染色体特异的DNA等.标记方法既采用传统的缺口平移法,以Bio-ll-duTP(BRL公司产品)为标记底物,标记双链DNA还     

L1210克隆细胞mRNA的表达及蛋白电泳图谱分析

目的 研究L1210及其克隆细胞mRNA表达的差异，从基因水平探讨质控瘤株的方法。方法 用SDS－PAGE电泳观察瘤细胞株的蛋白质电泳图谱；6株生物素标记的探针与瘤细胞进行玻片原位杂交测定瘤细胞mRNA的表达。结果 北京肿瘤所L1210蛋白质条带数为32条带，克隆细胞L3F9和L3E11均为31条带；细胞原位杂交证明，北京肿瘤所L1210与6株探针均杂交阳性，但杂交阳性染色强度不同；克隆细胞L3E11与p16,c-jun及p53探针杂交阳性，克隆细胞L3E9和p16,c-fos,c-myc及c-jun探针杂交阳性。结论 从北京肿瘤所保存的L1210细胞中获得的2株克隆细胞L3E11和L3F9的蛋白质电泳图谱的条带数一致，但其mRNA的表达不同；c-fos,c-myc以及p53基因的表达与否可以把这2株克隆细胞区别开来，cDNA探针检测可作为对细胞株进行质量控制的有效方法。     

用地高辛配基标记DNA探针及其应用

核酸杂交技术中,同位素标记DNA探针是最常用的技术,其优越性是检测灵敏度高,但同时有很多缺点。80年代初,Langer等开始用生物素标记多核苷酸探针。随着方法的不断完善,近年来已用于基因诊断、定位及表达等研究。本文报道一种新的非同位素标记技术,即用地高辛配基(digoxigenin-dUTP)标记DNA探针,其原理是具有类固醇半抗原性质的地高辛配基,通过随机引物(random pr-imer法)掺入到DNA上,与靶DNA进行碱基互补同源序列结合形成杂交产物,然后通过酶联免疫法与     

用生物素标记CVB_3 cDNA制备探针检测病毒核酸

本文报道用含CVB_3 cDNA PstI酶切片段(530bp)的重组质粒pGP_(51)B转化大肠菌;经扩增后提取,纯化重组质粒DNA;用生物素标记制备探针。通过原位杂交技术检测不同的肠道病毒和非肠道病毒感染的HeLa细胞。实验结果表明,该探针只与肠道病毒RNA杂交,而不与非肠道病毒核酸杂交,且可检测出病毒感染后3h,5h(CPE-)的病毒核酸。可见该探针具有良好的特异性和敏感性,且可用于肠道病毒感染引起的心脏疾病的活检标本诊断。     

用生物素标记Y特异DNA探针对一例Y染色体结构异常患者的研究

用生物素标记Y特异3.4kbDNA为探针,应用染色体原位杂交技术对一例表型异常、常规染色体显带技术为小Y染色体的患者进行了研充:该患者不能与3.4kbDNA杂交,与~3H标记探针的染色体原位杂交结果一致。进一步以生物素标记此探针对患者的基因组DNA进行Southern印迹杂交分析,患者缺少一部分可检测的男性特异性片段,结合其临床特征,提示该患者为Yq的中间缺失。     

地高辛与光敏生物素标记探针在肝细胞癌原位杂交中应用的比较观察

地高辛与光敏生物素标记探针在肝细胞癌原位杂交中应用的比较观察同济医科大学实验医学研究中心，武汉４３００３０杨木兰，郑杰，杨渝珍，李东关键词地高辛；光敏生物素；肿瘤中图法分类号Ｒ９７２＋１，Ｒ７３５．７原位分子杂交技术最早（１９６９）用于细胞内核蛋白体...     

人胎儿延髓bcl-2的发育表达

目的：研究人胎儿延髓bcl-2 mRNA的发育表达。方法：用地高辛标记的bcl-2 cRNA探针原位杂交组织化学技术，检测了12－39周胎儿延髓内bcl-2 mRNA的表达情况。结果：在所检测的延髓的运动神经bcl-2 mRNA表达较强，bcl-2 mRNA的水平一般是随胎龄的增长而下降，至第39周表达最弱，结论： 在人胎儿延髓发育中表面的bcl-2 可能与编程性细胞死亡有关。     

应用改良的原位杂交方法分析Pax3基因在鸡胚脊髓中的表达

目的改良传统的原位杂交方法,提高其信号强度和特异性;应用改良的原位杂交方法分析Pax3基因在鸡胚脊髓中的表达情况。方法分子克隆Pax3 cDNA进入pCR-TopoII质粒,使用sp6 RNA聚合酶体外合成Pax3 cRNA反义探针,组织原位杂交分析Pax3(pairedbox3)mRNA在鸡胚脊髓内分布。结果获得高质量的Pax3 cRNA探针,通过改进的原位杂交方法发现Pax3 mRNA在鸡胚脊髓内呈区域状特异分布。结论改进的原位杂交方法显著提高了杂交信号特异性,Pax3在鸡胚脊髓内区域状表达显示Pax3基因在脊髓发育过程中扮演一定角色。     

人脑星形细胞瘤p16基因表达研究

应用生物素标记的p16cRNA探针、p16单克隆抗体,对42例人脑星形细胞瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ-Ⅳ级组织标本进行原位杂交和免疫组化研究。结果显示：p16mRNA原位杂交阳性信号呈蓝色或紫蓝色细颗粒状,位于胞浆内。Ⅰ、Ⅱ级杂交阳性细胞密度显著高于Ⅲ－Ⅳ级（P＜0．001）,阳性细胞反应强度明显大于Ⅲ－Ⅳ级阳性强度。P16免疫组化阳性反应信号为棕黄色;Ⅰ和Ⅱ级免疫反应阳性细胞密度大于Ⅲ－Ⅳ级,（P<0．005,P<0．01）。p16原位杂交与P16免疫组化结果基本一致,二者呈正相关。研究结果提示,P16对星形细胞瘤的发生发展具有负向调节作用;p16在星形细胞瘤的恶性转化中也起到了重要作用。     

地高辛标记探针与生物素标记探针用于斑点杂交检测HBV DNA的初步研究

为研究地高辛标记和生物素标记核酸探针斑点杂交检测ＨＢＶ ＤＮＡ的敏感性、特异性和稳定性，用两种探针和＾３２Ｐ标记探针进行平行检测对照。结果表明，地高辛探针检测灵敏度为０．１Ｐｇ，已达到＾３２Ｐ标记探针水平。生物素探针为１￣１０Ｐｇ。两种探针与＾３２Ｐ标记探针相比。符合率分别９６．６５％和８９．１３％；敏感性分别为９４．４４％和８３．３３％；特异性分别为９６．４３％和９２．８６％。两种探针在－２０℃     

光敏生物素标记流行性出血热病毒R_(22)株M片段cDNA探针

核酸探针一般多采用同位素标记,限制了它的推广应用。所以应用非放射性标记物代替同位素,具有实际意义。作者采用国产光敏生物素,标记流行性出血热病毒R_(22)株M片段R_3 cDNA探针,报告如下。1 光敏生物素标记 cDNA探针的敏感性 以R_3克隆cDNA为目的基因,加热变性后再经10倍系列稀释后,点到硝酸纤维素膜上,分别用光敏生物素,生物素-11-dUTP及a-~(32)P-dATP标记的探针杂交检测,结果光敏生物素与生物素-11-dATP敏感性一致,均     

石蜡包埋组织切片原位核酸杂交研究

目的：探讨石蜡包埋组织片的原位核酸杂交方法。以检测克山病（KSD）尸检心肌中的RNA。方法：应用生物素标记的人工合成寡核苷酸探针。对72例心肌石蜡包埋组织切片进行原位核酸杂交。结果：各型克山病心肌肌组织切处的阳性杂交信号为80%-87.9%,而正常对照仅为14.4%。结论：应用人工合成寡核苷酸之原位核酸杂交技术,对长期保存的石蜡组织进行回顾性研究是可行的。