胎儿骨髓基质细胞与细胞因子支持人脐血单个核细胞体外扩增的研究

为了探讨胎儿骨髓基质细胞(FBMSC)联合细胞因子对脐血单个核细胞(MNC)体外扩增作用的影响及比较扩增前后脐血(CB)CD34 细胞上细胞表面趋化因子受体CXCR4和黏附分子CD49d (VLA4)的表达情况,将从新鲜CB标本中分离出的MNC分别接种于已建立的无血清培养体系,该体系分4组:A组为培养过程中不加细胞因子和基质细胞;B组为单用胚胎骨髓基质细胞支持;C组为单用细胞因子支持;D组为细胞因子和胚胎骨髓基质细胞联合支持。在0、6、10及14天检测细胞总数、CD34 细胞数及集落形成单位(CFU)数,同时检测CD34 细胞上CD49d 及CXCR4的表达数。结果表明:在体外14天培养过程中,各时间点D组CD34 细胞、CFU数及CD34 CXCR4 细胞和CD34 CD49d 细胞扩增数均高于A、B、C组(P<0.05);B、C和D组在各时间点各测量指标与A组比较具显著性差异(P<0.05);6天后,B组各测量指标与C组比较具显著性差异(P<0.05)。结论:胚胎骨髓基质细胞联合外源性细胞因子不仅可以支持脐血MNC的有效扩增,而且扩增后与趋化作用和与粘附作用相关的造血细胞亦较扩增前明显增加。单用细胞因子扩增会造成造血细胞的耗竭,单用基质细胞支持可扩增或维持造血细胞的量,但难以实现造血细胞的大量扩增,FBMSC联合外源性细胞因子可能是扩增造血干祖细胞的较理想方案。     

白细胞介素3与白细胞介素6对人脐血单个核细胞体外扩增及黏附分子和趋化因子受体4表达的影响

背景:体外扩增脐血造血细胞对增加脐血造血细胞数量及植入能力至关重要,合适的细胞因子组合介导的体外扩增不仅能使造血细胞数鼙增加,而且能够上调和归巢有关的黏附分子和趋化因子受体4的表达.目的:实验拟观察白细胞介素3和白细胞介素6在人脐血单个核细胞体外扩增中的作用及对扩增后黏附分子和趋化因子受体4表达的影响.设计、时间及地点:随机区组开放性实验,于2007-03/12在广西壮族自治区人民医院及广州医学院附属广州市第一人民医院血液实验室完成.材料:10份足月顺产健康新生儿脐血标本.方法:将自新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7d,根据不同细胞因子组合实验分组为:对照组(无细胞因了组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子组(A组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素6组(B组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素3(C组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+自细胞介素6组+白细胞介素3(D组).主要观察指标:在0,7 d检测有核细胞数,CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数和集落形成单位数.结果:与对照组相比,A,B,C,D组均可有效的扩增脐血造血细胞(P<0.05),C,D两组扩增效果均优于A,B组,差异显著(P<0.05),但A,B两组之间无明显区别(P>0.05),D组能有效的扩增脐血细胞,并优于C组(P<0.05).A,B,C,D组细胞因子组合均可提高脐血CD34+细胞上CD49d,CD62L和趋化因子受体4的表达, A,B两组之间差异不显著(P>0.05),但均优于C组(P<0.05),D组CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+和CD34+CD49d+的细胞数扩增倍数优于A,B,C组(P<0.05).结论:白细胞介素6组+白细胞介素3可协同扩增脐血细胞,并能促进和归巢有关的CD49d,CD62L及趋化因子受体4表达.     

细胞因子介导的人脐血单个核细胞体外扩增并重建NOD/SCID小鼠造血及免疫功能

背景:细胞因子介导的脐血造血细胞体外扩增有望能解决脐血移植数量不足的问题.目的:实验拟确立在无基质培养条件下体外扩增脐血单个核细胞最合适的细胞因子组合及干细胞因子、FLT3配基协同促聚核细胞生成因子对造血及免疫重建功能的影响.方法:将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d,根据不同细胞因子组合分组,将3因子干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子组合在无血清无基质条件下扩增培养7 d前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠.在扩增培养0,7 d检测脐血CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数.脐血移植6周后通过流式细胞仪,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞.结果与结论:移植6周后,存活小鼠体内均可检测到人源性CD45+细胞,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠存活率和人特异性基因捡出率均高于新鲜脐血移植组和高于生理盐水移植组(P<0.05).扩增脐血组存活NOD/SCID小鼠骨髓中可检测到人髓系细胞(CD33+),T淋巴细胞(CD4+),B淋巴细胞(CD19+)和人造血干细胞成分(CD34+)细胞的表达.结果提示干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子3因子组合脐血造血细胞体外扩增是最合适的细胞因子组合,其扩增的脐血单个核细胞能够植入并重建NOD/SCID小鼠的造血及免疫功能.     

不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响

为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化，将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天，在0天，7天检测有核细胞数，CD34^＋细胞数及CD34^＋CXCR4^＋，CD34^＋CD49d^＋的细胞数和集落形成单位（CFU）数．根据不同细胞因子组合实验分组为：对照组；SF组（SCF＋FL）；SFT组（SCF＋FL＋TPO）和SFT6组（SCF＋FL＋TP0＋IL-6）。结果表明，和对照组相比，SF组合仅能低水平支持脐血造血细胞扩增，加入TPO后即SCF／FL／TPO组合能有效的扩增脐血细胞，但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生（P〉0．05）；SF，SFT和SFT63组的细胞因子组合均可提高脐血CD34^＋细胞CD49d，CXCR4的表达，但3组之间差异无显著性（P〉0．05）。结论：SF组合可协同扩增人造血细胞，但协同作用较弱；TPO在脐血造血干／祖细胞体外扩增中起重要调节作用，而IL-6作用不显著；SCF／FL／TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增，而且可上调脐血造血细胞CD49d，CXCR4表达。     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血单个核细胞表面抗原表达的影响

背景:课题组已建立胎儿骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系,该培养体系能否有效扩增各个发育阶段的造血细胞有待验证。目的:观察骨髓基质细胞联合细胞因子培养体系对脐血单个核细胞表面抗原CD133、CD34表达的影响。方法:将从脐血标本中分离出来的单个核细胞接种于无血清培养体系,实验分为3组:①F组:干细胞因子+Flt3配体+促血小板生成素+单个核细胞。②S组:基质细胞+单个核细胞。③SF组:基质细胞+干细胞因子+Flt3配体+促血小板生成素+单个核细胞。在第0,6,10,14天检测有核细胞总数、CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞数以及集落形成单位数。结果与结论:SF组有核细胞总数在各个检测时间点均比其他两组高;除了第14天外,第6、10天两个时间点SF组中CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞及集落形成单位数均高于其他组;含骨髓基质细胞的S组和SF组中CD133+细胞/有核细胞、CD34+细胞/有核细胞、CD133+CD34+细胞/有核细胞的比例保持在较高的水平。结果说明骨髓基质细胞联合细胞因子能有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞,基质细胞对维持造血干细胞的原始性具有重要的作用。     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133+细胞体外扩增作用的研究

为了探讨胚胎骨髓基质细胞(FBMSC)联合细胞因子对脐血单个核细胞(MNC)中CD133+细胞的体外扩增作用,将新鲜脐血(CB)中分离出来的MNC接种于无血清培养体系中培养14天.实验分为4组:C组为空白对照组,不含基质细胞和细胞因子;S组为单用基质细胞组;F组为单用细胞因子组;SF组为联合使用基质细胞和细胞因子组.在第0,6,10及14天检测有核细胞总数、CD133+细胞数及集落形成单位(CFU)数.结果表明:各时间点SF组有核细胞总数的扩增倍数均高于其它组;除了第14天外,SF组在第6、10天时CD133+细胞数、CFU数的扩增倍数均高于其它组.结论:胚胎骨髓基质细胞对延缓造血细胞的分化具有重要的作用,基质细胞联合细胞因子可以有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133+细胞,这是一种比较接近于临床移植要求的造血细胞体外扩增方法.     

白细胞介素6/可溶性白细胞介素6受体对人脐血单个核细胞扩增及归巢能力的影响

目的:体外扩增脐血造血细胞的目的是促进脐血造血细胞的植入能力,并重建受体的造血功能,而这和脐血造血干/祖细胞的细胞数和体外扩增后细胞的归巢能力密切相关.实验拟观察白细胞介素6/可溶性白细胞介素6受体对人脐血单个核细胞体外扩增及扩增后对归巢有关的CD49d和CXCR4表达的影响.方法:实验于2005-06/2006-03在广州医学院附属广州市第一人民医院血液实验室完成.①实验材料:10份足月顺产健康新生儿脐血标本由广州市第一人民医院妇产科提供,产妇对实验知情同意,实验经医院伦理委员会批准.②实验方法:将由新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d.根据不同细胞因子组合实验分组为:对照组、干细胞因子 FLT3配基 促聚核细胞生成因子组(简称SFT组)、干细胞因子 FLT3配基 促聚核细胞生成因子 白细胞介素6组(简称SFT6组)、干细胞因子 FLT3配基 促聚核细胞生成因子 白细胞介素6/可溶性白细胞介素6受体组(简称SFT6s组).SFT6s组根据可溶性白细胞介素6受体浓度又分为50,100, 500, 1 000 μg/L组.③实验评估:在0,7 d检测有核细胞数, CD34 细胞数及CD34 CXCR4 ,CD34 CD49d 的细胞数.结果:①培养7 d后,SFT、SFT6、SFT6s组有核细胞数及CD34 细胞数扩增效果优于对照组(P < 0.05), SFT、SFT6、 SFT6s3组间差异不显著(P > 0.05).②与对照组比较,SFT、SFT6、SFT6s组细胞因子组合均可提高脐血CD34 细胞上CD49d, CXCR4表达,3组间差异不显著(P > 0.05).③500,1 000 μg/L SFT6s组脐血单个核细胞扩增效果和CD49d和CXCR4表达均优于SFT, SFT6s组和100 μg/L SFT6s组(P < 0.05), 500,1 000 μg/L SFT6s组比较差异不显著(P > 0.05) .结论:在干细胞因子 FLT3配基 促聚核细胞生成因子组合的基础上,加入白细胞介素6/可溶性白细胞介素6受体后可有效地扩增脐血细胞,并促进CD49d和CXCR4表达,对可溶性白细胞介素6受体浓度有一定的依赖性.     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血单个核细胞表面抗原表达的影响

背景：课题组已建立胎儿骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系,该培养体系能否有效扩增各个发育阶段的造血细胞有待验证。目的：观察骨髓基质细胞联合细胞因子培养体系对脐血单个核细胞表面抗原CD133、CD34表达的影响。方法：将从脐血标本中分离出来的单个核细胞接种于无血清培养体系,实验分为3组：①F组：干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。②S组：基质细胞＋单个核细胞。③SF组：基质细胞＋干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。在第0,6,10,14天检测有核细胞总数、CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞数以及集落形成单位数。结果与结论：SF组有核细胞总数在各个检测时间点均比其他两组高;除了第14天外,第6、10天两个时间点SF组中CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞及集落形成单位数均高于其他组;含骨髓基质细胞的S组和SF组中CD133＋细胞/有核细胞、CD34＋细胞/有核细胞、CD133＋CD34＋细胞/有核细胞的比例保持在较高的水平。结果说明骨髓基质细胞联合细胞因子能有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞,基质细胞对维持造血干细胞的原始性具有重要的作用。     

体外扩增的脐血单个核细胞植入NOD/SCID小鼠的研究

为了探讨在无血清、无基质培养条件下SCF、FL和TPO 3种因子组合体外扩增的脐血单个核细胞(MNC)的最佳移植时机及植入潜能,将SCF,FL和TPO 3种因子组合体外扩增的脐血单个核细胞培养14天,在0、7、10和14天检测有核细胞数(TNC),CD34 细胞数,CD34 CXCR4 细胞数,CD34 CD49d 的细胞数及集落形成单位(CFU)数,并将SCF FL TPO 3种因子组合的无血清无基质条件下扩增培养7天前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠,6周后用流式细胞术,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞.结果表明,经过14天的培养,脐血细胞得到了有效的扩增,TNC数,CD34 细胞数,CD34 CD49d 的细胞数于7天达高峰,其后开始下降,而CFU数,CD34 CXCR4 细胞数于第10天达高峰.在移植6周后,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠的存活率和人源性CD45 细胞的检出率分别为56.25%和(1.39±0.63)%,高于新鲜脐血移植组31.25%和(0.73±0.16)%,亦高于生理盐水移植组(0和0),差异有显著性(p＜0.05),扩增脐血移植组有6只NOD/SCID小鼠骨髓细胞中可检测到人特异ALU序列的表达.结论体外培养7-10天可能是收获细胞的最佳时机;SCF FL TPO 3种因子组合扩增7天的脐血单个核细胞能够植入NOD/SCID小鼠,其植入水平优于未扩增的脐血;上调脐血造血细胞上CXCR4,CD49d的表达可能会增加脐血造血细胞的植入能力.     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133+细胞体外扩增作用的研究

为了探讨胚胎骨髓基质细胞（FBMSC）联合细胞因子对脐血单个核细胞（MNC）中CD133＋细胞的体外扩增作用,将新鲜脐血（CB）中分离出来的MNC接种于无血清培养体系中培养14天。实验分为4组：C组为空白对照组,不含基质细胞和细胞因子;S组为单用基质细胞组;F组为单用细胞因子组;SF组为联合使用基质细胞和细胞因子组。在第0,6,10及14天检测有核细胞总数、CD133＋细胞数及集落形成单位（CFU）数。结果表明：各时间点SF组有核细胞总数的扩增倍数均高于其它组;除了第14天外,SF组在第6、10天时CD133＋细胞数、CFU数的扩增倍数均高于其它组。结论：胚胎骨髓基质细胞对延缓造血细胞的分化具有重要的作用,基质细胞联合细胞因子可以有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133＋细胞,这是一种比较接近于临床移植要求的造血细胞体外扩增方法。     

Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus

The present study was performed to identify cells responsible for the elimination of T cells reactive with minor lymphocyte-stimulating (Mls) antigens during T cell development. Experiments were carried out in a fetal thymus organ culture (FTOC) system. To examine the tolerance-inducing activity, various populations of cells from adult CBA/J (Mls-1a) mice were injected into deoxyguanosine (dGuo)-treated FTOC of C3H/He (Mls-1b) mice with a microinjector, and 2 d later, the thymus lobes were injected with fetal thymus cells from C3H/He mice as T cell precursors. After 14 d of cultivation, cells were harvested and assayed for the expression of the T cell receptor V beta 6 element. The absence or marked reduction of T cells expressing V beta 6 at high levels (V beta 6high) was regarded as indicating the deletion of Mls-1a-reactive T cells. T cell-depleted populations of thymic as well as splenic cells from CBA/J mice were able to induce clonal deletion. Further characterization of the effector cells was carried out by fractionating the spleen cells before injecting them into dGuo-FTOC. None of the dish-adherent population, dish-nonadherent population, or purified B cells alone were able to induce clonal deletion, whereas the addition of purified B cells to adherent cells restored tolerance inducibility. It was further shown that a combination of CBA/J B cells and C3H/He dendritic cells was effective in eliminating Mls-reactive clones. These results indicate that for the deletion of clones reactive with Mls antigens during T cell development in the thymus, both DC and B cells are required.     

Differentiation of dendritic cells in cultures of rat bone marrow cells

Although dendritic cells (DC) originate from bone marrow, they were not observed in fresh preparations of bone marrow cells (BMC). Likewise, accessory activity was barely measurable in a sensitive assay for this potent function of DC. However, both DC and accessory activity developed when BMC were cultured for 5 d. Based on fractionation before culture, nearly all of the accessory activity could be attributed to only 5% of the total BMC recovered in a low-density (LD) fraction. The LD-DC precursors differed from mature DC in a number of important respects. Removal of Ia+ cells from the LD fraction by panning did not decrease the production of DC when the nonadherent cells were cultured. Thus, the cell from which the DC is derived does not express or minimally expresses Ia antigens, in contrast to the strongly Ia+ DC that is produced in bone marrow cultures. Irradiation of LD cells before culture prevented the development of DC. When irradiation was delayed by daily intervals, progressive increases in the number of DC resulted, up to the fifth day. These findings, together with preliminary autoradiographic data, indicate that cell division has occurred, in contrast to the DC, which does not divide. We conclude that bone marrow-derived DC arise in culture from the division of LD, Ia- precursors.     

Generation of self-macrophage-toxic non-T cells in the MHC-homozygous F1 spleen cells co-cultured with parental cells: possible involvements of host cells in impaired immunity in GVH disease

Simplified-in vitro system was developed to examine the contribution of host's cells in graft-versus-host (GVH)-disease-associated immunodeficiencies. In analogy with major histocompatibility complex (MHC)-matched GVH-reaction, (BALB/c x DBA/2)F1 (H-2d) hybrid spleen cells were co-cultured with irradiated BALB/c (H-2d) spleen cells, so that cellular activities to be generated are ascribable to F1 cells. In vitro development of anti-allo-specific cytotoxic T cells of the F1 origin was dramatically suppressed by coexistence of the irradiated parental cells and by the addition of F1 cells precultured once with the parental cells, suggesting the generation of suppressor cells in the F1 (host) cells activated by the parental cells. Thus generated suppressor cells are Thy.1-, weakly or nonadherent and radiosensitive. Interestingly, in the same reactions there also developed Thy.1- cytotoxic cells for autologous macrophage targets. An involvement in immunodeficiencies in GVH disease of the host-derived cytotoxic and/or immunosuppressive, non-T cells was discussed.     

脂肪干细胞体外分化为内皮细胞的可行性

目的：以内皮前体细胞为对照，探讨具有多向分化性能的脂肪干细胞的体外培养和分化为内皮细胞的可能性。方法：①实验于2003-10／2004-02在解放军总医院心内科实验室完成。选用雄性壮年和老年新西兰白兔各3只。②抽取兔髂骨骨髓，Percoll密度梯度离心后取单个核细胞，采用贴壁法以内皮细胞专用培养基（添加体积分数0．2胎牛血清，内皮细胞基本培养基2和辅助因子碱性成纤维细胞生长因子，氢化可的松，血管内皮生长因子，表皮生长因子，胰岛素样生长因子1，抗坏血酸，庆大霉素等）培养扩增内皮前体细胞。③取兔腹部皮下脂肪组织，胰蛋白酶消化提取脂肪干细胞，Iseove改良的Dulbecco培养基培养扩增，将第2代脂肪干细胞传代后，分为2份，分别用内皮细胞专用培养基和Iscove改良的Dulbecco培养基培养2～4周，观察细胞的变化。用乙酰化低密度脂蛋白，Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体鉴定，观察脂肪干细胞是否分化为内皮细胞。结果：①原代内皮前体细胞接种后48h才能贴壁，生长非常缓慢，呈集落状生长，一般需要10d左右才能形成较大的集落，达到传代的目的，传代细胞生长迅速。内皮前体细胞必须使用含有多种刺激因子的培养基才能生长。②脂肪干细胞培养无需刺激因子，原代细胞接种12h后即开始贴壁，继而迅速进入对数生长期，无集落形成，原代和传代细胞均生长迅速。将脂肪干细胞采用内皮细胞专用培养基培养2周后，细胞形态未见明显变化，但与内皮前体细胞一样，大部分细胞采用乙酰化低密度脂蛋白，Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体检测均为阳性；培养3周后细胞的贴壁习性改变，几乎所用细胞均为阳性．而采用Iscove改良的Dulbecco培养基培养的脂肪干细胞采用上述检测均为阴性。③壮年兔骨髓中内皮前体细胞含量较高，培养后能保持旺盛的分裂能力；老年兔骨髓中内皮前体细胞含量明显减少，有的老年动物骨髓甚至难以培养出内皮前体细胞，而且培养时细胞容易老化，表现为细胞体积增大，形态呈扁平状或不规则，细胞浆增多而核变小。壮年兔和老年兔脂肪干细胞在生长速度和细胞形态方面没有明显差别。结论：①脂肪干细胞培养远比内皮前体细胞简单，它不需要多种细胞因子刺激即可生长。②脂肪干细胞在使用内皮细胞专用培养基诱导后可快速分化为内皮细胞。③脂肪组织中有大量的脂肪干细胞，其体外增长和分化能力受年龄影响较小，而骨髓中内皮前体细胞含量和扩增性能受年龄影响较大。     

脂肪间充质干细胞对J774.1细胞的免疫调控

背景：近期研究发现脂肪间充质干细胞针对T细胞、B细胞和树突状细胞均有抑制免疫反应的能力,但对于其是否可以对巨噬细胞起到相应的免疫调控能力还不清楚。目的：观察脂肪间充质干细胞与J774.1细胞共培养后白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达方法：将脂肪间充质干细胞按照2×10^7孔分别接种于transwel 的上层小室和24孔板中,再利用含1 mg/L脂多糖的培养液重悬J774.1细胞,将J774.1细胞接种到含脂肪间充质干细胞的transwel 下层小室和24孔板中,同时设立未激活J774.1细胞阴性对照组和脂多糖激活J774.1阳性对照组。培养48 h收集细胞样,提取RNA样本,荧光定量PCR法检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA 水平。 结果与结论：相对于单纯脂多糖激活的阳性对照组J774.1细胞,脂肪间充质干细胞与J774.1细胞的接触型混合培养可以明显降低J774.1细胞的白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达量,而非接触共培养组中,只有白细胞介素6 mRNA 水平发生了明显的降低。以上结果表明脂肪间充质干细胞具有抑制脂多糖激活 J774.1细胞的免疫反应的能力。     

兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外分化成神经细胞的方法。方法:抽取兔骨髓,淋巴细胞分离液密度梯度分离单个核细胞,体外培养传代,第3代时加入二甲基亚砜(DMSO),观察MSCs分化为神经细胞的形态学变化。结果:MSCs在体外可以扩增,在DMSO诱导下向神经样细胞分化,行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体免疫反应染色,阳性率约为NSE60%,GFAP5%。实验活细胞率为70%～90%。结论:MSCs在DMSO存在下能够分化为神经细胞。     

脂肪干细胞体外分化为内皮细胞的可行性

目的:以内皮前体细胞为对照,探讨具有多向分化性能的脂肪干细胞的体外培养和分化为内皮细胞的可能性。方法:①实验于2003-10/2004-02在解放军总医院心内科实验室完成。选用雄性壮年和老年新西兰白兔各3只。②抽取兔髂骨骨髓,Percoll密度梯度离心后取单个核细胞,采用贴壁法以内皮细胞专用培养基(添加体积分数0.2胎牛血清,内皮细胞基本培养基2和辅助因子碱性成纤维细胞生长因子,氢化可的松,血管内皮生长因子,表皮生长因子,胰岛素样生长因子1,抗坏血酸,庆大霉素等)培养扩增内皮前体细胞。③取兔腹部皮下脂肪组织,胰蛋白酶消化提取脂肪干细胞,Iscove改良的Dulbecco培养基培养扩增,将第2代脂肪干细胞传代后,分为2份,分别用内皮细胞专用培养基和Iscove改良的Dulbecco培养基培养2～4周,观察细胞的变化。用乙酰化低密度脂蛋白,Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体鉴定,观察脂肪干细胞是否分化为内皮细胞。结果:①原代内皮前体细胞接种后48h才能贴壁,生长非常缓慢,呈集落状生长,一般需要10d左右才能形成较大的集落,达到传代的目的,传代细胞生长迅速。内皮前体细胞必须使用含有多种刺激因子的培养基才能生长。②脂肪干细胞培养无需刺激因子,原代细胞接种12h后即开始贴壁,继而迅速进入对数生长期,无集落形成,原代和传代细胞均生长迅速。将脂肪干细胞采用内皮细胞专用培养基培养2周后,细胞形态未见明显变化,但与内皮前体细胞一样,大部分细胞采用乙酰化低密度脂蛋白,Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体检测均为阳性;培养3周后细胞的贴壁习性改变,几乎所用细胞均为阳性,而采用Iscove改良的Dulbecco培养基培养的脂肪干细胞采用上述检测均为阴性。③壮年兔骨髓中内皮前体细胞含量较高,培养后能保持旺盛的分裂能力;老年兔骨髓中内皮前体细胞含量明显减少,有的老年动物骨髓甚至难以培养出内皮前体细胞,而且培养时细胞容易老化,表现为细胞体积增大,形态呈扁平状或不规则,细胞浆增多而核变小。壮年兔和老年兔脂肪干细胞在生长速度和细胞形态方面没有明显差别。结论:①脂肪干细胞培养远比内皮前体细胞简单,它不需要多种细胞因子刺激即可生长。②脂肪干细胞在使用内皮细胞专用培养基诱导后可快速分化为内皮细胞。③脂肪组织中有大量的脂肪干细胞,其体外增长和分化能力受年龄影响较小,而骨髓中内皮前体细胞含量和扩增性能受年龄影响较大。     

体外诱导胚胎干细胞向甲状腺细胞的分化

背景：胚胎干细胞来源于发育早期囊胚的内细胞团，适当条件下能在体外维持未分化状态、正常二倍体核型及无限增碹能力，且具有多向分化潜能，能够发育分化成机体3个胚层的所有类型细胞。目的：观察体外定向诱导胚胎干细胞分化为甲状腺细胞的可行性及相关分子表达检测。设计、时间及地点：以细胞为对象的观察实验，于2004-01／2006—12在中山大学附属第二医院脐血库完成。材料：孕12．5～14．5d的Balb／c孕鼠用于胚成纤维细胞饲养层的制备。E14小鼠胚胎干细胞细胞株由美国哈佛大学Dr．Xu教授惠赠。成年昆明种小鼠用于甲状腺细胞的提取。方法：将制备的鼠胚成纤维饲养层接种于E14小鼠胚胎干细胞进行扩增培养。将脱离饲养层细胞后呈稳定克隆生长的胚胎干细胞诱导发育为胚胎体，再逐步添加促甲状腺素、胰岛素、碘化钾等共培养。以培养的成年昆明种小鼠甲状腺细胞为阳性对照。主要观察指标：①观察分化过程中细胞形态的变化。②免疫荧光法检测分化细胞标记物TSHR，PAX8，TTF-2，TTF-1的表达。③RT-PCR法检测分化细胞相关基因TSHR、PAX8，NIS，TPO，Tg的表达。结果：分化细胞边界清晰，呈圆形、类圆形、梭形或多角形贴壁生长。诱导培养第6天分化细胞中有甲状腺细胞特有基因PAX8，NIS，TPO，Tg，TSHR的表达，第8天检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TSHR，TTF-1，PAX8，TTF-2的表达，阳性细胞形态类似对照甲状腺细胞。结论：胚眙干细胞经胚胎体发育阶段，在特定条件下可定向分化为甲状腺细胞。     

干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究与进展

学术背景:干细胞是一群较原始的细胞,它们具有自我更新和多向分化潜能,可以被诱导分化为胰岛素分泌细胞,理论上可提供丰富的胰岛细胞来源.目的:本文就近年来干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究进展做一综述.检索策略:应用计算机检索Pubmed和CNKI数据库1990-2007年期间相关文献,检索词为"干细胞,诱导分化,胰岛素分泌细胞,stem cell,differentiation,islet-producing cell".对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的研究进展.排除标准:重复研究.文献评价:共收集到相关文献162篇,选择其中49篇文献进行重点阅读和分析.49篇文献中,1篇涉及糖尿病及其并发症的治疗,1篇涉及胰岛细胞移植,1篇涉及干细胞在糖尿病治疗中的应用,13篇涉及胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究,4篇涉及脐血来源的干细胞体内分化为胰岛素分泌细胞的研究,10篇涉及骨髓来源的干细胞分化为胰岛素分泌细胞的研究,13篇涉及胰腺干细胞分化为胰岛素分泌细胞的研究,6篇涉及其它器官来源的干细胞分化为胰岛素分泌细胞的研究.资料综合:胰岛细胞移植可以用来治疗1型和部分2型糖尿病,但由于供体细胞来源匮乏,因而寻找新的细胞来源成了当务之急.近年来,干细胞研究为新型胰岛细胞的来源带来了希望.目前用于胰岛细胞来源研究的干细胞主要有胍胎干细胞和成体干细胞,后者根据细胞来源不同分为脐血来源干细胞、骨髓来源干细胞、胰腺干细胞及其他器官来源的干细胞.目前的研究显示,骨髓来源的干细胞可以在体内促进胰腺的再生,并且可以在体外被诱导分化为胰岛样细胞.结论:深入了解干细胞向胰岛β细胞诱导分化的分了调控机制,将会加快糖尿病细胞治疗的研究进展.     

细胞因子诱导杀伤细胞抗淋巴瘤细胞作用的研究

目的:探讨体外细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞对淋巴瘤细胞的杀伤作用.方法:采集健康人外周血单个核细胞(PBMC),经IL-2、CD3Mc-Ab、IL-1、IFN-γ诱导,制备CIK细胞,同时以淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)作为对照,流式细胞仪检测CIK细胞的免疫表型,LDH释放法检测其对淋巴瘤细胞株的杀伤活性.结果:CIK细胞与LAK细胞增殖在前期无明显差异,CIK细胞在培养14d后大量增殖,21d后扩增能力显著高于LAK细胞(P＜0.05);表型分析表明CIK细胞主要由CD3+和CD56+双阳性细胞构成;同一效靶比时,CIK细胞对淋巴瘤细胞株的杀伤活性明显高于LAK细胞(P＜0.05).结论:CIK细胞对淋巴瘤细胞株的杀伤作用强于LAK细胞,具有较强的抗淋巴瘤细胞活性,是肿瘤过继免疫治疗中更为有效的杀瘤效应细胞.