甲胎蛋白特异启动元件介导的肝癌靶向性基因治疗的体外实 …

目的 采用体外培养的肿瘤细胞系探讨甲胎蛋白特异启动元件介导的靶向性肝癌基因治疗。方法 将２．２ｋｂ的重组人甲胎蛋白（ＡＦＰ）基因顺式调控元件克隆于胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因的上游,构建逆转录病毒载体ＬＸ２．２ＣＤ。再以此载体和另一不含ＡＦＰ基因调控元件的逆转录病毒载体ｐＣＤ２分别转染３种肝癌细胞系和１种肺腺癌细胞系,筛选出整合ＣＤ基因的抗Ｇ４１８克隆,并进行细胞生长抑制实验。     

胞嘧啶脱氨酸基因治疗人胰腺癌的实验研究

探讨腺病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因用于人胰腺癌基因疗法的可行性。方法将含癌胚抗原启动子的重组腺病毒感染人胰腺癌ＳＷ１９９０细胞和Ｃａｐａｎ－２细胞以及人宫颈癌Ｈｅｌａ细胞,用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＣＤ基因在细胞中的表达,以ＭＴＴ法比较细胞对５－氟胞嘧（５－ＦＣ）的敏感性差异。建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察ＣＤ基因的原位治疗效应及安全性。结果腺病毒介     

甲胎蛋白启动子调控表达p53基因的肝癌细胞靶向性基因治疗？…

目的 利用含有人甲胎蛋白启动子的腺相关病毒载体,构建能在人肝癌细胞株中特异表达目的的基因的质粒。方法 通过设计含有特定酶切点位点的引物,选择性地从人基因组中扩增出人甲胎蛋启动子（ＡＦＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）主列并克琶含有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ报基因的质粒,ｐＲＴ－ＵＦ５上,构建成含报告基因的重组腺相关病毒质粒ｒＡＡＶ－ＡＦＰ－ＧＦＰ转染表达ＡＦＰ的Ｈｅｐ Ｇ２细胞株和不表达ＡＦＰ的２９３因的质粒ｒＡＡ     

hTERT启动子调控腺病毒介导的CD基因治疗卵巢癌的实验研究

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒载体,使CD基因只能在端粒酶阳性的细胞表达.方法:采用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定.分别将腺病毒感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,MTT法检测受染细胞的存活率.结果:构建的重组腺病毒中带有hTERT启动子及CD基因.用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:本实验构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力.     

肝癌特异性甲胎蛋白及甲胎蛋白-mRNA分析的临床应用

原发性肝细胞癌(HCC)是慢性乙肝和丙肝盛行的亚太地区最重要的医学问题之一[1],其死亡率位于恶性肿瘤第2位。我国每年死于HCC的约11万人,占全世界肝癌死亡人数的45%。几乎所有HCC都有肝硬化基础,确诊时已多属中、晚期,缺乏有效治疗,预后差。虽然HCC非手术疗法有进展,但手术切除     

腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶（CD）和胸苷激酶（TK）融合双自杀基因系统对膀胱癌治疗作用并与单基因系统作比较。方法 利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白（GFP）基因的复制缺陷腺病毒作载体,PCR检测CD、TK及E1基因。建立C57BL／6同系膀胱癌Mb49皮下移植瘤模型,观察肿瘤注射腺病毒联合丙氧鸟苷（GCV）或／和5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗后肿瘤体积及组织学变化。结果 PCR可检测到腺病毒DNA中含CD及TK基因、无E1基因。腺病毒注射联合GCV、5-FC、GCV＋5-FC治疗后,肿瘤体积与对照组相比明显缩小（P=0.00）,腺病毒注射联合GCV＋5-FC有协同作用（P=0．04）,优于腺病毒注射联合GCV以及腺病毒注射5-FC。基因治疗后肿瘤细胞大片坏死．对照组细胞形态无变化。结论 腺病毒介导CD-TK融合双自杀基因联合GCV或／和5-FC能有效治疗膀胱癌,融合双自杀基因CD-TK／（GCV＋5-FC）系统对膀胱癌治疗有协同作用,其效果优于CD-TK／GCV或CD-TK／5-FC系统。     

IL-2和IL-12联合基因治疗小鼠肝癌的实验研究

目的探讨瘤内注射共表达mIL-12和hIL-2质粒DNA抗小鼠肝癌皮下移植瘤的作用.方法构建pDC511hIL2-mIL12、pDC511mIL-12、pDC511hIL-2真核表达质粒载体;ELISA方法检测各组质粒在真核细胞的表达;小鼠肝癌H22皮下移植瘤瘤内注射各组质粒DNA后,检测不同时间血清中细胞因子浓度;观察各组小鼠存活时间,肿瘤大小变化;并检测各组小鼠脾脏细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)活性.对各治疗组在质粒DNA注射后一月进行瘤体组织学观察.结果酶切鉴定各组质粒载体,均示构建成功,并能在真核细胞内高效表达相应细胞因子.瘤内注射各组质粒载体后,pDChIL2-mIL12组在不同时间表达的hIL2和mIL12分别与pDC511hIL2 组(F=71.11,P<0.01)、pDC511mIL12组 (F=30.70,P<0.05)比较有显著性差异.mIL-12基因和hIL-2基因联合治疗组,肿瘤生长明显受抑制,疗效显著优于各单独治疗组和对照组(P<0.05),并且小鼠脾细胞CTL杀伤活性增强.双基因联合治疗组,病灶内肿瘤细胞坏死明显,炎性细胞广泛浸润.结论 IL-12、IL-2基因治疗可抑制小鼠肝癌H22皮下移植瘤的生长,提高机体的抗肿瘤免疫应答,两者联合运用可产生协同效应.为进一步运用高效基因导入技术进行肝癌基因治疗研究提供初步的实验依据.     

CD/5-FC自杀基因治疗系统体外杀伤恶性人脑胶质瘤细胞作用的研究

目的：探讨胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）自杀基因治疗系统对恶性人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法：采用Lipofectamine2000脂质体介导法将CD基因转染U251恶性人脑胶质瘤细胞,G418筛选获得抗性克隆（取名为U251/CD细胞）,使用不同浓度的5-FC作用于U251/CD细胞,MTT法测定活性细胞比率。采用高效液相色谱法（HPLC）检测5-FC培养液内5-FU的浓度。结果：U251细胞获得了质粒的成功转染。基因转染使G418抗性细胞（U251/CD细胞）对5-FC高度敏感。未转染的U251细胞对5-FC不敏感,IC50 约为6 500 μmol/L,而转染基因后 IC50 约为10 μmol/L。并且加入不同浓度的5-FC后,U251/CD细胞培养液内均能检测到5-FU。结论：5-FC对CD基因修饰U251细胞具有杀伤作用;为胶质瘤基因治疗的在体研究提供依据。     

腺病毒载体介导的CD基因转移联合5-FC对大鼠卵巢癌细胞株的作用研究

目的：研究胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转移及其与5－氟胞嘧啶（5－FC）联合应用对卵巢癌细胞株生长的影响。方法：用复制缺陷型重组腺病毒为载体，将CD基因转染大鼠卵巢癌细胞株NUTU－19细胞，加入含5－FC的培养液培养，MTT法检测培养孔吸光度值，计算细胞存活率。结果：5－FC对转染了CD基因的NUTU－19细胞的生长抑制作用显著增强，并随着腺病毒滴度和5－FC浓度的增加，该作用不断增强。此外，5－FC可通过旁观者效应杀伤CD基因转染细胞周围未转入该基因的NUTU－19细胞。结论：CD基因转移联合5－FC作用对NUTU－19细胞具有显著的杀伤作用。     

甲胎蛋白动态变化在原发性肝癌诊断中的价值(摘要)

甲胎蛋白动态变化在原发性肝癌诊断中的价值（摘要）刘玉诚１张世杰２张建立２甲胎蛋白（ＡＦＰ）是原发性肝癌（ＰＨＣ）的肿瘤标记物，其增高对ＰＨＣ的诊断有重要价值，其动态变化在ＰＨＣ诊断中的作用尚不清楚。为此，我们对５０例ＨＢｓＡｇ阳性的慢性乙型肝炎和肝硬...     

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因治疗大肠癌的实验研究

目的　观察腺病毒介导下CD/5 -FC对小鼠结肠癌C2 6细胞体外、体内的治疗作用。方法　先构建通过细菌内同源重组法制备CD腺病毒 ,用Ad -CD感染体内、体外小鼠结肠癌C2 6 ,并给予前药 5 -FC ,观察其杀伤肿瘤效果。结果　Ad -CD体外感染小鼠结肠癌C2 6 ,给予前药 5 -FC后 ,可有效杀伤肿瘤细胞 ,并有明显的旁观者效应。AdCD瘤内注射腹腔给前药 5 -FC对BALB/C皮下荷瘤小鼠C2 6大肠肿瘤有较好的治疗作用 ,尤其在早期能使肿瘤生长明显减慢 ,但是未能完全消除肿瘤 ,在后期还观察到肿瘤明显生长。结论　体外腺病毒介导CD/5 -FC可以有效杀伤肿瘤细胞 ,并具有明显的旁观者效应。腺病毒介导CD/5 -FC对皮下荷瘤小鼠早期有一定的治疗作用 ,但是它不能以绝对的优势控制肿瘤的生长 ,更难以长期维持其疗效。说明这一腺病毒介导的自杀基因系统对C2 6皮下肿瘤的抑制作用是有限的。     

酪氨酸酶启动子调控的CD基因治疗恶性黑色素瘤

目的：克隆酪氨酸酶（Ｔｙｒ）启动子并探索其调控细菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）在黑色素瘤基因治疗中的应用价值。方法：用ＰＣＲ法从小鼠恶性黑色素瘤细胞Ｂ１６基因组中克隆Ｔｙｒ启动子片段并与正常序列比较，并于逆转录病毒载体ＧｌＮａ中调控ＣＤ基因（ＴｙｒＣＤ）。测体外表达和体内抗肿瘤作用。结果：来源于Ｂ１６基因组的Ｔｙｒ启动子重要反式作用位点未见突变。该Ｔｙｒ启动子可使ＣＤ基因在Ｂ１６中特异表达。转ＴｙｒＣＤ的     

胞嘧啶脱氨酶基因联合干扰素-酌基因治疗大肠癌的实验研究

目的:研究胞嘧啶脱氨酶基因(EC鄄CD)联合干扰素-酌(INF鄄酌)基因对大肠癌的治疗作用。方法:以重组腺病毒载体AdCMVCD转导EC鄄CD基因;AdCMVINF鄄γ转导鼠INF鄄γ基因。采用体外培养和小鼠移植瘤实验,研究EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因对CT26大肠癌细胞的杀伤作用。结果:AdCMVIFN鄄γ感染对CT26细胞生长有明显的抑制作用。AdCMVCD/5鄄FC联合AdCMVINF鄄γ可以增强对CT26细胞的杀伤作用,IC50明显变小(P<0.01),肿瘤生长明显抑制(P<0.01)。组织学检查显示,EC鄄CD基因与INF鄄γ基因联合治疗后肿瘤内有大量淋巴细胞浸润。结论:EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因可以明显增强抗肿瘤效应,局部淋巴细胞浸润增加可能起到一定作用。     

婴儿双歧杆菌介导的CD和UPRT联合5-FC基因疗法对黑色素瘤的体外治疗实验研究

目的 采用婴儿双歧杆菌为载体,探讨尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(UPRT)对胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因系统抗瘤作用的增强效应.方法 构建原核表达质粒pGEX-UPRT,以电穿孔法将该质粒转化入婴儿双歧杆菌,筛选阳性重组菌并鉴定.采用MTT法检测表达的UPRT是否可以与CD产生抗瘤协同作用,并观察细胞形态学改变.结论 重组婴儿双歧杆菌可以正确表达UPRT.体外MTT检测显示CD UPRT组细胞存活率低于对照组(P＜0.01),且可使B16-F10鼠黑色素瘤细胞对5-FC的杀伤敏感性(IC50＝0.015 μmol/mL)提高,是CD组(IC50＝0.127 μmol/mL)的8.5倍.形态学观察CD UPRT组肿瘤细胞显示出明显的损伤性改变,细胞生长受到明显抑制,而UPRT组和CD组变化明显不如前者.结论 婴儿双歧杆菌联合转导UPRT基因可明显增强CD/5-FC自杀基因系统对鼠黑色素瘤细胞B16-F10的杀伤作用.     

厌氧菌介导的肿瘤靶向自杀基因系统对鼠黑色素瘤B16-F10细胞的杀伤作用研究

目的 构建婴儿双歧杆菌介导的胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)肿瘤基因治疗系统,探讨该系统对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的体外杀伤效应.方法 构建重组质粒pGEX-CD,以电穿孔法转化婴儿双歧杆菌,筛选阳性克隆菌,然后加入5-FC厌氧培养,24 h后取其上清液,作用于小鼠黑色素瘤B16-F10细胞,采用MTT法检测细胞存活率,并观察细胞形态学改变.结果 成功构建出婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC肿瘤基因治疗系统.与空白对照组和pGEX组相比,CD组肿瘤细胞发生了明显的形态学改变,细胞存活率明显降低.结论 婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC系统对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞具有明显的体外杀伤效应.     

婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC自杀基因系统对黑色素瘤的抑瘤实验

目的 观察婴儿双歧杆菌介导的胞嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶(CD／5-FC)自杀基因系统对黑色素瘤的体内、外抑瘤效果。方法 含重组CD基因的婴儿双歧杆菌中加入5-FC．厌氧条件下培养24h后取其上清液．加到黑色素瘤B16-F10细胞上．观察其对细胞形态及细胞生长抑制率的影响;建立小鼠黑色素瘤动物模型,尾静脉注入含重组CD基因的婴儿双歧杆菌,腹腔注入5-FC,观察携带重组CD基因的婴儿双歧杆菌联合5-FC对黑色素瘤肿瘤体积及肿瘤体积倍增时间的影响。结果 ①体外实验：实验组肿瘤细胞形态显示出显著的损伤性改变,细胞生长受到明显抑制．而对照组肿瘤细胞影响不大。②小鼠黑色素瘤动物模型实验结果显示,经重组婴儿双歧杆菌联合5-FC治疗21d．实验组肿瘤倍增时间明显长于对照组．其肿瘤体积明显小于对照组．且随着观察时间的延长,这种差异越显著。结论 婴儿双歧杆菌介导的CD／5-FC自杀基因系统对黑色素瘤具有明显的抑瘤效果。     

CD基因对大肠癌杀伤作用的实验研究

目的：探讨ＣＤ基因对大肠癌靶向治疗的作用。方法：构建以ＣＥＡ基因顺式转录调控序列（ＴＲＳ）驱动ＣＤ基因的组织特异性重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡＣＤＮa,脂质体裹 法将重组组织特异性载体pＣＤ２在逆转录病毒包装细胞ＰＡ３１７细胞中进行包装,收获病毒上清后分别转染入高分泌ＣＥＡ的大肠癌细胞ＬoＶo中,经Ｇ４１８筛选阳性克隆扩增后进行体外前药敏感实验及观察旁观者交应,然后再将转基因ＬoＶo细胞接种对裸鼠皮下成     

高尔基体蛋白73与甲胎蛋白对肝癌诊断价值的研究

目的：探讨甲胎蛋白（AFP）与高尔基体蛋白73（GP73）对肝癌早期诊断的价值。方法采用酶联免疫法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）对肝癌患者80例、肝硬化患者30例血清中AFP、GP73进行检测,30例健康体检者作为对照。结果①肝癌组、肝硬化组、正常对照组AFP平均浓度为64.5μg/L、50.1μg/L、21.9μg/L （肝癌组vs对照组P〈0.01,肝硬化组vs对照组P〈0.01,肝硬化组vs肝癌组P〈0.01）,肝癌组、肝硬化组、正常对照组GP73平均浓度为268.4μg/L、192.3μg/L、49.8μg/L （P〈0.01）。②AFP诊断肝癌的ROC曲线下面积为0.729,P=0.000,GP73诊断肝癌的ROC曲线下面积为0.892,P=0.000。AFP联合GP73对肝癌诊断的ROC曲线下面积为0.902。结论 GP73诊断肝癌的价值高于AFP,AFP＋GP73联合检测不能提高诊断效率。     

肝癌患者术前外周血甲胎蛋白mRNA检测与术后复发的关系

【目的】探讨肝细胞癌患者的外周血中甲胎蛋白（AFP）mRNA的检测在肝癌术后预后中的应用价值。【方法】应用巢式PCR和TaqManMGB探针法定量PCR技术，检测105例肝细胞癌患者和30例健康志愿者外周血AFPmRNA的表达情况。【结果】肝细胞癌患者术前外周血AFPmRNA的阳性率43.8％（46／105）高于健康对照10．0％（3／30），有显著性差异（P〈0．001）。术前血中AFPmRNA的表达与各项肿瘤侵袭性指标显著相关，包括肿瘤数目、大小、有无肉眼及镜下血管侵犯。AFPmRNA阴性患者1、2、3年生存率以及1、2、3年无瘤生存率均显著比AFPmRNA阳性患者术后高（两者均P=0．004）。多因素分析也指出术前外周血中是否表达AFPmRNA是预测术后复发的独立因素。【结论】肝癌患者术前外周血中是否表达AFPmRNA与肿瘤侵袭性相关，对于预测术后复发具有重要价值。     

肝细胞性肝癌合并门静脉癌栓与甲胎蛋白的高危因素分析

目的：探讨肝细胞性肝癌（hepatic carcinoma,HCC）,以下简称肝癌,患者发生门静脉癌栓（portal vein tumor thrombus,PVTT）的高危因素。方法：通过回顾性分析随机抽取的本科室2009年4月至2011年4月收治的HCC患者126例。分析 PVTT形成高危因素,包括甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）值（以400 ng/ml为界）、有无 PVTT、HBsAg、肿瘤直径、肿瘤数目、细胞分化程度（Edmondson-Steiner分级法）、有无脉管浸润以及性别。用卡方检验及非条件logistic回归分析。结果：126例为HCC,56例（44.4%）确诊为HCC合并PVTT。脉管浸润、肿瘤直径、高滴度AFP、肿瘤数目、细胞分化程度为 PVTT形成的高危因素（ χ2=20.97、13.67、4.73、5.04,均P＜0.05）。肿瘤大小、脉管浸润、细胞分化程度与AFP有关系（ χ2=8.121、4.038,均P＜0.05）。多因素分析AFP、脉管浸润是PVTT发生的独立危险因素。结论：在 HCC患者中,高滴度血清AFP可成为HCC患者发生 PVTT的一项危险指标,对早期发现肝癌合并 PVTT具有临床指导意义。