皮肤科学基础

20101389甲磺酸伊马替尼对人黑素瘤细胞c-KIT表达的影响/高莹(中国医科院北京协和医学院皮研所病理科),陈浩,关杨…∥临床皮肤科杂志.-2010,39(2).-76~79通过观察甲磺酸伊马替尼对人黑素瘤细胞(M14细胞)和鼠黑素瘤B16F10细胞c-KIT表达和细胞增殖能力的影响,探讨其对黑素瘤的作用。结果,M14细胞存在c-KIT表达,B16F10细胞未见表达。3种浓度的甲磺酸伊马替尼均能抑制M14细胞的增殖;10,20μmol/L甲磺酸伊马替尼均可抑制B16F10细胞的增殖,5μmol/L甲磺酸伊马替尼则对其无影响。不同浓度甲磺酸伊马替尼均可抑制M14细胞p-c-KIT蛋白的表达,     

甲磺酸伊马替尼对人黑素瘤细胞c-KIT表达的影响

目的:探讨甲磺酸伊马替尼对体外培养的人黑素瘤细胞系c-KIT表达及增殖的影响.方法:采用免疫组化和Western 印迹法检测人黑素瘤M14细胞和鼠黑索瘤B16F10细胞中c-KIT的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分析3种浓度(5、10、20μmol/L)甲磺酸伊马替尼对M14细胞和B16F10细胞的生长抑制作用,Western印迹法观察M14细胞c-KIT和p-c-KIT蛋白的表达情况.结果:M14细胞存在c-KIT表达,B16F10细胞未见表达.3种浓度甲磺酸伊马替尼均能抑制M14细胞的增殖,导致其形态改变:10、20μmol/L甲磺酸伊马替尼均能抑制B16F10细胞的增生,5μmol/L甲磺酸伊马替尼对其无影响.不同浓度甲磺酸伊马替尼均能抑制M14细胞p-c-KIT蛋白的表达,但对c-KIT蛋白无影响.结论:甲磺酸伊马替尼能抑制M14细胞的增殖,机制可能与抑制c-KIT的磷酸化有关.     

甲磺酸伊马替尼对黑素瘤细胞Hs294T生物学活性的影响

【摘要】 目的 探讨酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼对黑素瘤细胞Hs294T生物学活性及其Wnt/β-连环蛋白通路的的影响。 方法 用甲磺酸伊马替尼作用黑素瘤细胞Hs294T后,用MTT实验、Annexin V-PI双染色法、基质胶侵袭实验分别观察细胞增殖活性、凋亡和侵袭能力的变化。用激光共聚焦显微镜观察细胞中Wnt通路关键性蛋白分子β-连环蛋白定位的改变。用Western印迹和荧光定量PCR分别检测β-连环蛋白,靶基因细胞周期蛋白D1蛋白的表达变化,及通路转录因子LEF1、靶基因C-myc 的mRNA表达的变化。结果 4 ～ 10 μmol/L浓度药物能使细胞增殖活性呈梯度下降（P ＜ 0.05）;用10 ?滋mol/L药物可使细胞增殖能力呈时间梯度下降（P ＜ 0.01）;与对照组相比,处理组细胞早期及晚期凋亡比例均明显增加,细胞侵袭能力显著降低约48%（P ＜ 0.05）,同时β-连环蛋白蛋白表达未见明显变化,但其胞核定位相对减少,LEF1、C-myc、细胞周期蛋白D1的表达均下调。结论 甲磺酸伊马替尼可能通过下调Wnt/β-连环蛋白通路而抑制黑素瘤细胞增殖、促进凋亡并降低侵袭力。     

甲磺酸伊马替尼抑制黑素细胞游走的实验研究

目的探讨甲磺酸伊马替尼对人黑素细胞(NHEM)游走的抑制作用。方法培养NHEM,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法测定甲磺酸伊马替尼对NHEM生长和分化的影响;使用侵袭小室测定甲磺酸伊马替尼抑制NHEM的游走情况;用蛋白印记法测定甲磺酸伊马替尼抑制c-kit磷酸化情况。结果甲磺酸伊马替尼0.1μmol/L,1.0μmol/L,5.0μmol/L能够抑制由SCF50ng/mL引起的NHEM游走,并能抑制c-kit的磷酸化。结论甲磺酸伊马替尼抑制SCF引起的NHEM游走及抑制c-kit的磷酸化,为其用于防治色素痣治疗后的复发奠定了理论基础。     

西达本胺联合姜黄素对人皮肤T细胞淋巴瘤细胞系Hut78的影响及其分子机制

目的 研究西达本胺联合姜黄素对皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用,探讨西达本胺联合姜黄素治疗CTCL的机制。 方法 分别用0.3、0.6、1.2、2.4 μmol/L西达本胺,10 μmol/L姜黄素,1.2 μmol/L西达本胺联合10 μmol/L姜黄素处理Hut78细胞24、48、72 h后,采用MTS法检测Hut78细胞的生存率。用0.6、1.2 μmol/L西达本胺,10 μmol/L姜黄素,1.2 μmol/L西达本胺联合10 μmol/L姜黄素分别处理Hut78细胞24 h,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况及细胞周期,用实时PCR和Western印迹法检测凋亡相关基因Fas、caspase 8、NF-κB p65及细胞周期相关基因P21、CDK2、细胞周期蛋白E（cyclin E） mRNA和蛋白的表达。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析和LSD-t检验。 结果 西达本胺能明显抑制Hut78细胞的增殖,且呈剂量依赖性（F = 266.558,P < 0.001）和时间依赖性（F = 564.966,P < 0.001）。培养48 h和72 h时,1.2 μmol/L西达本胺联合10 μmol/L姜黄素对细胞增殖的抑制作用显著强于1.2 μmol/L西达本胺及10 μmol/L姜黄素（均P < 0.001）。流式细胞仪结果显示,联合组的凋亡细胞比例均显著高于0.6、1.2 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组（均P < 0.001）。此外,联合组和1.2 μmol/L西达本胺组G0/G1期细胞比例明显高于0.6 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组,而其S期细胞比例及G2/M期细胞比例均明显低于0.6 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组（均P < 0.05）,联合组与1.2 μmol/L西达本胺组各细胞周期比例差异均无统计学意义（均P > 0.05）。实时PCR结果显示,联合组和1.2 μmol/L西达本胺组Fas、caspase 8、P21 mRNA的表达均明显高于0.6 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组（均P < 0.001）,而其NF-κB p65、CDK2、cyclin E mRNA的表达均明显低于0.6 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组（均P < 0.001）。联合组Fas mRNA的表达明显高于1.2 μmol/L西达本胺组（P < 0.001）,而caspase 8、P21、NF-κB p65、CDK2、cyclin E mRNA的表达与1.2 μmol/L西达本胺组差异无统计学意义（均P > 0.05）。Western印迹结果显示,联合组与0.6、1.2 μmol/L西达本胺、不加药物的对照组比较,Fas、caspase 8、P21蛋白的表达明显增加,而NF-κB p65、CDK2、CyclinE蛋白的表达明显降低,与以上基因mRNA的表达一致。 结论 西达本胺通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡来抑制CTCL细胞系Hut78生长,联合姜黄素能明显提高抑制CTCL细胞系Hut78的生长率。     

丹皮酚对人黑素瘤A375和M14细胞系增殖与凋亡的影响

目的:确定丹皮酚对体外培养人黑素瘤A375和M14细胞增殖与凋亡的影响。方法:利用CCK8检测黑素瘤A375和M14细胞的增殖抑制率;以流式细胞仪检测细胞周期变化、Annexin-V/PI法观察细胞凋亡的变化;用Hoechst33258染色法观察细胞凋亡的形态变化。结果:细胞周期显示丹皮酚处理过的A375和M14细胞G2/M期比例均高于对照组。以0 mmol/L、1.25 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L丹皮酚作用24 h后,A375细胞的早期凋亡率分别为3.11%±0.53%,13.74%±1.73%,25.95%±0.57%和46.44%±0.81%;M14细胞的早期凋亡率分别为1.00%±0.08%,2.00%±0.01%,2.99%±0.29%和14.73%±0.94%,呈剂量依赖性诱导A375和M14细胞凋亡。经5 mmol/L丹皮酚作用后Hoechst33258染色示凋亡细胞形态改变。结论:丹皮酚对黑素瘤A375和M14细胞均具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。     

雷公藤内酯醇对人黑素瘤M14细胞系增殖与凋亡的影响

目的 探讨雷公藤内酯醇对体外培养人黑素瘤M14细胞增殖与凋亡的影响。 方法 利用CCK8检测不同浓度和时间雷公藤内酯醇作用下,对黑素瘤M14细胞的增殖抑制作用;用10、20、30 nmol/L 3种浓度雷公藤内酯醇作用48 h后,以流式细胞仪检测细胞周期变化、Annexin-Ⅴ/PI法观察M14细胞凋亡的变化;用Hoechst33258染色法观察30 nmol/L雷公藤内酯醇作用48 h后细胞凋亡的形态变化。结果 细胞周期显示,雷公藤内酯醇处理过的M14细胞S期比例高于对照组, G2/M期比例低于对照组。空白对照组及10、20、30 nmol/L浓度雷公藤内酯醇处理的M14细胞凋亡率分别为（2.92 ± 0.17）%,（20.99 ± 0.40）%, （34.28 ± 2.04）% 和（63.38 ± 0.71）%,呈剂量依赖性诱导M14细胞凋亡,经30 nmol/L雷公藤内酯醇作用后,Hoechst33258染色示凋亡细胞形态改变。 结论 雷公藤内酯醇对黑素瘤M14细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。     

西达本胺对恶性黑素瘤细胞系A375的体外抗增殖作用

目的 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺对体外培养的皮肤恶性黑素瘤细胞株A375细胞的抗癌作用。方法 用不同浓度的西达本胺和曲古抑菌素A处理A375细胞,以噻唑蓝法检测西达本胺和曲古抑菌素A对A375细胞体外增殖的影响;Annexin V-EGFP/PI双荧光活染-流式细胞测量法检测细胞凋亡率;DNA倍体分析检测细胞周期。结果 西达本胺和曲古抑菌素A可明显抑制A375细胞增殖,西达本胺在5 ~ 500 μmol/L浓度范围内呈量效关系,其中50 ~ 500 μmol/L浓度范围内在作用0 ~ 120 h时间内呈时效关系。曲古抑菌素A在0.1 ~ 1 μmol/L浓度范围内呈量效关系,其中在0.25 ~ 1 μmol/L浓度范围内作用0 ~ 120 h呈时效关系。西达本胺和曲古抑菌素A作用A375细胞48 h的IC50分别为250和0.7 μmol/L。西达本胺（62.5,125,250 μmol/L）作用48 h后诱导A375细胞的凋亡率分别为80.27% ± 3.06%、79.53% ± 5.70%、83.13% ± 6.90%,曲古抑菌素A（0.175,0.35,0.7 μmol/L）作用48 h后诱导A375细胞的凋亡率分别为16.27% ± 2.46%、28.83% ± 2.55%、83.40% ± 8.65%,显著高于空白对照组（10.43% ± 0.96%）（P < 0.01）。西达本胺（62.5,125,250 μmol/L）作用48 h后诱导A375细胞发生G0/G1期阻滞,G0/G1期细胞比例分别为76.30% ± 6.06%、82.79% ± 0.74%、88.91% ± 5.29%,与空白对照组（38.73% ± 3.36%）比较,差异有统计学意义（P < 0.01）;曲古抑菌素A（0.35,0.7 μmol/L）作用48 h后诱导A375细胞发生G2/M期阻滞,G2/M期细胞比例分别为25.15% ± 2.71%、58.71% ± 3.45%,与空白对照组（15.73% ± 0.23%）比较,差异有统计学意义（P < 0.01）。结论 西达本胺和曲古抑菌素A在体外能诱导A375细胞发生周期阻滞,促使细胞凋亡,抑制细胞生长。     

药物反应

20140738药疹分子遗传学机制研究进展（综述）/高薇（中国医科院北京协和医学院皮研所）,王洪生,王宝玺∥国际皮肤性病学杂志.-2013,39（5）.-330-332 20140739甲磺酸伊马替尼诱导的皮肤反应的治疗对策（综述）/杨欢（南京医科大学第一医院皮肤科）,蒋洁瑶,苏忠兰…∥国际皮肤性病学杂志.-2013,39（5）.-318-320     

Notch1基因对裸鼠皮肤鳞状细胞癌移植瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨Notch1基因在人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞裸鼠移植瘤中的作用。方法 于裸鼠腋下接种0.2 ml 1 × 108/ml的SCL-1细胞悬液,建立人皮肤鳞状细胞癌裸鼠移植瘤模型,将其分为三组：未处理组（接种PBS悬浮的未转染细胞）,空载体转染组（接种空载体转染的细胞）和Notch1转染组（接种Notch1转染的细胞）。连续2周观察转染荷瘤裸鼠的生长情况,采用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）研究肿瘤组织中的细胞凋亡,利用RT-PCR和Western印迹研究肿瘤组织中Notch1、bcl-2和bax mRNA和蛋白的表达。结果 Notch1转染组中肿瘤的生长明显受到抑制,其肿瘤的重量为（0.574 ± 0.219） g,显著低于未处理组（2.642 ± 0.404） g和空载体转染组（2.606 ± 0.512） g（F = 26.642,P 值均 < 0.01）。TUNEL结果表明,Notch1转染组每500个细胞中凋亡的细胞数为87 ± 9,明显高于未处理组（8 ± 2）和空载体转染组（10 ± 3）中细胞凋亡的数目（P < 0.05）;此外,RT-PCR和Western印迹结果表明Notch1转染组中裸鼠肿瘤组织Notch1和bax mRNA和蛋白表达均显著上升,而bcl-2的表达显著下调,三组间比较差异具有统计学意义（P值均 ＜ 0.05）。结论 Notch1基因能抑制人皮肤鳞状细胞癌细胞SCL-1裸鼠皮下移植瘤的生长,诱导SCL-1细胞凋亡,后者可能与bax表达的上升和bcl-2表达的下调相关。     

角化棘皮瘤与高分化鳞状细胞癌细胞凋亡及凋亡基因bcl-2和bax比较研究

目的：探讨角化棘皮瘤与皮肤高分化鳞癌在细胞凋亡方面的差异。方法：用脱氧核苷酰转移酶介导的ｄ－ＵＴＰ生物素缺口末端标记技术，原位检测了ＫＡ和ｗＳＣＣ的凋亡细胞。用免疫组化研究技术研究了皮损部位与细胞凋亡有关ｂａｘ和ｂｃｌ－２的基因产物的表达。结果：凋亡细胞在ＫＡ发生率为８０％；在ｗＳＣＣ也为８０％。     

银屑病皮损细胞凋亡的研究

目的：通过对银屑病皮损细胞凋亡以及凋亡相关基因bcl-2、Fas、bax和Fas-L、穿孔素的检测，探讨细胞凋亡与银屑病的关系。方法：采用原位末端标记及免疫组化ABC法、SABC法。结果：银屑病中细胞凋亡较正常人增多。抑凋亡基因bcl．2几乎不表达：而促凋亡基因Fas、bax阳性表达。细胞毒性T淋巴细胞可能通过Fas-L和穿孔素两条途径起作用。结论：细胞凋亡在银屑病发病机理中有十分重要的意义。     

Expression of the bcl-2 family of genes in the course of keratinocyte differentiation

Bcl-2 and its homologous proteins play an important role in the control of apoptosis, mainly at the level of mitochondria. Their relationship to differentiation as well as regulation by retinoids in certain cell types has been recently reported. We examined the expression of the bcl-2 family oncoproteins bax, bak, bcl-2, bcl-xL, and mcl-1 in the course of differentiation of human keratinocytes cultured at low- (0.15 mM) and high- (1.87 mM) calcium concentrations. The pro-apoptotic bax showed an increase in expression during the first six days of culture, whereas bak remained stable until day 10 when it increased only slightly in both low- and high-calcium treated cells. The expression of anti-apoptotic bcl-xL increased during the first four days of culture, with a more pronounced increase in low- than in high-calcium treated keratinocytes. Apoptosis-suppressing bcl-2 and mcl-1 proteins did not change significantly in our culture experiment. None of the examined proteins of the bcl-2 family appeared altered upon addition of all-trans retinoic acid (10(-6) M) to the culture medium. We compare the results of our in vitro study with the expression of the bcl-2 family proteins in normal epidermis.     

祛疣洗剂治疗尖锐湿疣的临床研究及其作用机制

目的观察祛疣洗剂治疗尖锐湿疣的临床疗效，探讨其可能的作用机制。方法分别用祛疣洗剂及微波治疗尖锐湿疣患者各30例。用免疫组化SABC法检测祛疣洗剂治疗前后基底细胞和棘细胞的Ki-67表达及表皮bax、bcl-2的表达，同时采用TUNEL法检测治疗前后表皮细胞的凋亡情况。结果治疗组治愈率及有效率分别为：53.33％、93.33％，对照组治愈率及有效率分别为：47．67％、80．00％，差异无显著性（P〉0．05）；两组复发率分别为6．25％、42．86％，差异有显著性（P=0．031）。祛疣洗剂治疗后基底细胞和棘细胞增殖指数明显低于治疗前（P〈0．05），而bax、bcl-2在祛疣洗剂治疗前后表皮的表达没有明显差异（P〉0．05），TUNEL检测的细胞凋亡指数在治疗后略高于治疗前，但差异无显著性（P〉0．05）。结论祛疣洗剂治疗尖锐湿疣的作用机制，可能是通过抑制表皮的基底细胞和棘细胞增殖而发挥作用的。     

Improving chemotherapeutic drug penetration in melanoma by imatinib mesylate

BACKGROUND: Imatinib mesylate has specific activity in inhibiting select tyrosine kinase receptors, including platelet-derived growth factor receptors (PDGFRs) and c-kit. In general, melanomas widely express PDGFR and c-kit, and their in vivo resistance to chemotherapy is attributable to high tumor interstitial fluid pressure (IFP). Recent studies have suggested that PDGFR-beta inhibition reduces tumor IFP, and thus increases the uptake of concomitantly administered drugs. OBJECTIVE: The present study was designed to investigate the potential of imatinib mesylate as a therapy for melanoma or as an adjuvant to chemotherapeutics. METHODS: Using in vivo mouse models, the effect of imatinib mesylate on the growth of melanoma with or without dacarbazine was studied. RESULTS: Imatinib mesylate enhanced the antitumor effect of dacarbazine on in vivo growth and lung metastases of melanoma cells, although treatment with only imatinib mesylate had no effect. We could detect perivascular expression of PDGF beta-receptor in melanoma tumors. Interestingly, dacarbazine uptake in melanoma was more than three-times increased by treatment with imatinib mesylate, while its uptake in serum or bone marrow was not affected by imatinib mesylate. CONCLUSIONS: These data suggest interference with PDGF receptors, or their ligands, as a novel strategy to increase drug uptake and therapeutic effectiveness of chemotherapy for melanoma.     

Imatinib mesylate inhibits platelet-derived growth factor receptor phosphorylation of melanoma cells but does not affect tumorigenicity in vivo

Platelet-derived growth factor (PDGF) and its cognate receptor are widely expressed on melanomas. Coexpression of the growth factor and receptor suggests their role in autocrine or paracrine growth mechanisms. Imatinib mesylate was previously reported to have specific activity in inhibiting select tyrosine kinase receptors, including PDGF and c-Kit. Melanoma cells express abundant levels of the PDGF receptor (PDGFR). Nevertheless, c-Kit expression is progressively lost as the cells take on a more highly metastatic phenotype. To investigate the potential of imatinib mesylate as a therapy for melanoma, we studied its effect on the growth of melanoma cells using an in vivo mouse model. Melanoma cells with high malignant potential (PDGFR-positive, c-Kit-negative) or low malignant potential (PDGFR-positive, c-Kit-positive) were injected subcutaneously into athymic nude mice. Mice were treated with imatinib mesylate (100 mg/kg three times weekly) or with phosphate-buffered saline for 4 to 6 wk. PDGFR-alpha and -beta were expressed on all melanoma cell lines tested. The level of PDGFR expression correlated with the metastatic potential of the melanoma cells: higher levels of PDGFR-alpha were expressed on cells with higher metastatic potential, and higher levels of PDGFR-beta were expressed on cells with lower metastatic potential. There was no significant difference in tumor size between treated and control mice. Immunohistochemical studies demonstrated inhibition of PDGFR phosphorylation on the tumors from mice treated with imatinib mesylate but not from control mice, suggesting that the receptors were functional and that the concentration of drug used was appropriate. Our data demonstrated that imatinib mesylate blocked both PDGFR-alpha and PDGFR-beta in vivo. It did not, however, affect the growth of melanoma cells expressing PDGFR, regardless of whether the cells expressed c-Kit.     

生长抑制因子4对人黑素瘤细胞株M14凋亡的调控

目的探讨生长抑制因子4对人黑素瘤细胞株M14凋亡的调控及其作用机制。方法构建人生长抑制因子4基因的真核表达质粒,并将其转导入M14细胞,采用流式细胞术及TUNEL法检测细胞的凋亡情况,同时采用蛋白印迹法分析凋亡通路的活化及通路相关蛋白的表达情况。结果转染外源生长抑制因子4基因后,M14细胞出现了明显的凋亡峰并伴有G2/M期阻滞,凋亡率及凋亡指数也明显高于转染空载质粒及未转染M14细胞,差异有显著性意义(P<0.01)。还发现转染外源生长抑制因子4基因后,M14细胞凋亡通路活化,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,而促凋亡蛋白Bax表达上调,凋亡执行蛋白Cyt-c表达增加而caspase3表达下降。结论生长抑制因子4可能通过活化凋亡通路,进而促进M14细胞凋亡。这可能也是ING4抑制M14细胞增殖的机制之一。