乳腺生物反应器的基础研究──载体构建,检测及反应器的建立方法

乳腺生物反应器的研究和开发是近年生物工程领域的研究热点。乳腺特异性表达调控的研究和表达载体的构建是该工作的基础和关键。本文介绍了乳腺蛋白基因表达调控的研究现状，外源基因乳腺特异性表达载体构建策略以及乳腺生物反应器建立方法的研究进展。     

转人溶菌酶基因小鼠乳腺生物反应器的建立

目的 研究人溶菌酶（human lysozyme，hLYZ）动物乳腺生物反应器制备的可行性。方法 将hLYZ基因与动物乳腺特异表达载体p205C3连接，所得重组载体p205C3-hLYZ用显微注射法建立转基因小鼠。结果 共出生了136只F0代小鼠，PER和Southern杂交检测基因整合阳性率分别为5．15％（2♀5♂）和2．94％（1♀3♂）。Western印迹检测结果表明，分泌在小鼠乳汁中的表达产物与正常hLYZ具有相同的分子量。目前转基因小鼠已经繁殖到B代，每一代基因整合阳性母鼠的乳腺均表达hLYZ，乳汁中的表达量最高达750mg/L。斑点杂交试验证明，表达有较强的组织特异性，除在乳腺表达外，仅在脾脏和小肠有一定的异位表达。结论 成功建立了hLYZ小鼠乳腺生物反应器。     

血管生物反应器的研究进展

利用生物反应器构建人工血管是血管组织工程的核心技术之一，一直受到国内外学者和临床医生的广泛关注。文章就组织工程化培养生物反应器关键问题、血管生物反应器设计、生物反应器在工程化血管构建中的应用进行综述，并就今后的焦点问题和研究方向进行论述。     

生物反应器在组织工程研究中的应用

生物反应器在组织工程研究中的应用非常广泛,从最初的种子细胞增殖、分化,到关键的组织体外构建,都可以利用生物反应器来模拟细胞和组织在体内的生长环境,提高工程化组织构建的效率。本文结合本期发表的6篇相关文献,介绍了组织工程中研究中生物反应器的作用,建议通过包括生物力学在内的多学科的研究手段,获得调控不同类型细胞生长和组织构建的关键参数,实现功能化组织工程的研究目标。     

软骨组织工程生物反应器的研究进展

体外软骨构建是软骨组织工程产业化发展及临床应用的重要手段。然而,采用现有的体外构建技术无法构建功能接近正常的软骨。生物反应器能够在一定程度上模拟体内环境,有望弥补现有体外构建技术的弊端。研究发现,流体剪切力、静态液压力和直接压缩力是体内软骨发育和成熟的重要力学因素,常用软骨生物反应器均据此设计而产生。由于不同类型生物反应器各具特点,研究和开发新型复合式生物反应器将成为未来的发展方向。对目前软骨组织工程生物反应器的研究现状做一综述。     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因乳腺定位表达载体的构建及表达

目的:将人α-防御素-1(α-HNP-1)基因与山羊β-乳球蛋白(Beta-Lac-toglobulin,BLG)基因5’调控区序列融合,构建α-HNP-1基因的乳腺定位表达载体并对其进行检测。方法:用PCR方法获得α-HNP-1基因片断并克隆于pMD18-T载体,经DNA测序证实α-HNP-1基因序列无误后,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1-HNP-1重组质粒。用PCR方法扩增出BLG基因5’区调控序列并克隆到pcD-NA3.1-HNP-1中,构建乳腺定位表达载体pcDNA3.1-BLG-HNP-1,该载体经脂质体包裹后,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠乳腺中进行表达。结果:经酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-BLG-HNP-1构建正确,经ELISA检测,大鼠乳汁中有α-HNP-1表达,其48h表达量为27.67ng/ml,72h表达量为49.00ng/ml。结论:成功构建了α-HNP-1基因乳腺定位表达载体并最终在乳腺获得一定量表达,说明乳腺导管注入法是一种较理想的评价乳腺特异表达载体的可行性方法。     

应用转瓶和生物反应器培养表达HBsAg的哺乳动物细胞系的比较研究

大规模培养哺乳动物细胞是生产具有重要医用价值的生物制品 ,如疫苗、生长因子、单抗等的重要方法。哺乳动物细胞的大规模培养方式主要有传统的转瓶和现代的各种生物反应器。目前 ,我国乙型肝炎疫苗 (转基因中华地鼠卵巢细胞产品 )的生产采用转瓶培养方式。但近年来 ,应用载体和生物反应器大规模培养哺乳动物细胞已成为国际上细胞培养工业化最有发展前途的技术〔1〕 。本室引进了国外最新的篮式载体型生物反应器系统用于哺乳动物细胞系的大规模培养研究。本实验分别采用转瓶和生物反应器系统培养表达乙型肝炎表面抗原Ｓ和ＰｒｅＳ1的哺乳动…     

基于虚拟仪器技术的血管生物反应器系统的研制

目的　生物反应器是组织工程研究的重要载体。本文构造了一种基于虚拟仪器技术的血管生物反应器系统研究平台。方法　系统使用曲柄滑块机构压缩和拉伸波纹管,模拟出人体血管内的搏动流。同时利用LabVIEW平台对压力等参数进行测量和控制,系统与PC机连接,可实现远程监控,使整个组织工程生物反应器系统初步实现分步式,自动化。结果　实验结果表明,该生物反应器能够对细胞施加合适的生物力学刺激,并准确检测各项参数。结论　基于虚拟仪器技术构造的血管生物反应器系统研究平台具有较大的应用推广价值。     

心肌组织工程生物反应器研究进展

组织工程的研究主要围绕种子细胞、生物材料和组织构建这三个基本要素而展开。组织构建技术是组织工程研究的核心。组织工程生物反应器是一种体外构建人体组织的系统装置。心肌组织工程在替代和维持梗塞的心肌组织功能,并进而治愈疾病以最大限度地挽救病人生命方面可能发挥巨大作用。主要介绍了国内外工程化心肌组织体外构建技术,特别是用于构建工程化心肌组织的心肌组织工程生物反应器研究方面的进展。     

巨噬细胞特异性启动子调控的真核表达载体的构建及靶向性研究

目的:构建巨噬细胞特异性启动子调控的靶向巨噬细胞的真核表达载体.方法:PCR方法合成巨噬细胞特异性启动子,并将其插入带有绿色荧光蛋白(CFP)基因的真核表达载体pEGFP-N1 中,替代CMV启动子.利用脂质体转染法,将其与红色荧光蛋白真核表达载体(pERFP-N1)共转染巨噬细胞和非巨噬细胞,通过荧光显微镜观察GFP和RFP在不同细胞中的表达水平来鉴定启动子的靶向性.结果:成功构建了巨噬细胞特异性启动子调控的真核表达载体,并且能在巨噬细胞中高效特异性地表达报告基因.结论:构建的靶向巨噬细胞的真核表达载体能提高目的基因的表达特异性,为提高基因治疗胞内菌感染的靶向性及降低毒副作用奠定了实验基础.     

人前列腺特异性膜抗原基因启动子/增强子表达载体的构建及组织特异性鉴定

目的：构建前列腺特异性表达的人前列腺特异膜抗原（PSMA）基因启动子/增强子表达载体，并进行组织特异性鉴定。 方法：从人外周血中提取基因组DNA，采用PCR技术分别扩增PSMA上游 1 175 bp 的启动子序列，及第三内含子中258 bp的增强子序列，将两个序列定向克隆至荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-Basic，构建前列腺特异性表达载体pGL3-PSMP-PSME。将构建载体用脂质体分别转染前列腺癌PC-3M细胞株及4种非前列腺癌细胞株，48 h后通过检测荧光素酶表达活性，确定克隆的启动子及增强子的活性及其组织特异性表达活性。结果：构建的pGL3-PSMP-PSME质粒经酶切及DNA测序分析鉴定，证实克隆片段的大小、插入方向及其序列正确。细胞转染结果显示， pGL3-PSMP-PSME在PC-3M细胞株中表达活性明显高于其它4种非前列腺癌细胞株。结论：构建的前列腺表达载体具有较高的组织特异性, 为进一步研究PSMA调控序列驱动治疗基因进行前列腺癌的靶向生物治疗奠定了基础。     

蓖麻蚕蛹生物反应器生产重组人表皮生长因子的研究

重组人表皮生长因子(rhEGF)已经广泛应用于医疗和化妆品。以杆状病毒AnpeNPV为基因表达载体,昆虫为生物反应器而建立的蛋白表达系统已获得成功。本文以人表皮生长因子(hEGF)基因替代柞蚕AnpeNPV中的核多角体基因而获得的AnpehEGF病毒为载体、蓖麻蚕蛹为生物反应器表达的rhEGF蛋白质,采用PCR、West-ern blot和ELISA等实验方法对其进行检测,硫酸铵沉淀和Ni-NTA Agrose亲和层析法对其进行分离纯化。实验结果显示,无论是在基因或是蛋白水平上都可检测到rhEGF的表达。AnpehEGF感染蚕蛹后第6d开始检测到rhEGF的表达量快速上升,第12d达到高峰,第3、6、9、12d的表达量分别为19.77、24.90、618.59、1 952.46ng/g,而到了病毒感染后期(第15d)出现了蛋白降解现象。表达的rhEGF通过分离纯化获得了较纯的产品。结果表明蓖麻蚕蛹作为生物反应器生产外源蛋白rhEGF是可行的,说明利用AnpeNPV和蓖麻蚕蛹可开发更加低成本而又高效的rhEGF生产新途径。     

生物人工肝系统的生物反应器

目的:介绍生物反应器的基本作用、功能、条件和要求,并对主要生物反应器的研究进展予以探讨。方法:由第一作者应用计算机检索PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed,英文)及CNKI数据库(www.cnki.net/index.htm,中文)。检索时限1994-01/2009-08。中文检索关键词:生物人工肝,生物反应器,膜材料。英文检索关键词:bioartificial liver,bioreactor,membrane material。文献筛选、纳入标准:①选取针对性强,相关度高的文献。②对同一领域的文献选择近期发表或权威杂志的文献。③排除较陈旧的理论观点以及一些重复性研究。结果:计算机初检到150篇文献,阅读标题和摘要进行初筛,排除研究目的与本文无关的文献88篇,内容重复性研究32篇,共30篇文献符合标准。结果显示生物人工肝系统正在成为肝衰竭患者体外有效的肝支持治疗手段,生物反应器为肝细胞提供良好的生长代谢环境、物质交换及免疫隔离的平台,是人工肝最重要的组成部分。以纤维素半透膜为基础的生物反应器主要有平板式反应器、中空纤维型反应器,半透膜材料主要有混合纤维素酯膜、醋酸纤维素膜、铜仿膜、聚偏二氟乙烯膜、聚丙烯膜等。结论:生物反应器作为一个动态体系,伴随着生物反应器本身控制系统的优化,能够更好地控制反应器内部的传质,建立仿生物理化学梯度,实现肝细胞最小结构单元的模拟构建,膜材料的选择是构建人工肝支持系统生物反应器的首要和基础环节之一。     

75L生物反应器制备乙型脑炎病毒工艺研究

目的初步探索应用75L生物反应器和Cytodex1型微载体大规模培养Vero细胞制备乙型脑炎病毒的工艺。方法将14L生物反应器中细胞移种至75L生物反应器培养至单层,接种乙脑病毒,培养96h收获乙脑病毒原液。结果 75L生物反应器采用6g/L微载体浓度,细胞数最高达5.5×10^6/ml,病毒收获液滴度最高达7.84LgPFU/ml。结论用75L生物反应器制备乙脑病毒原液工艺稳定且易于规模放大。     

生物反应器在血管组织工程中的应用及进展

论述生物反应器的种类与发展,以及其在血管组织工程种子细胞培养和组织工程血管构建方面的主要研究进展。根据生物反应器领域的发展,分析了生物反应器对种子细胞培养、扩增的影响,尤其是对干细胞培养、定向分化方面的影响;阐述生物反应器内种植细胞的方法,以及机械力学对细胞生长、黏附的影响;探讨生物力学与血管构建的关系。最后提出生物反应器未来的发展趋势。     

乳腺高效表达人溶菌酶转基因小鼠的制备

目的　研究自行构建的动物乳腺特异表达载体p2 0 5C3的表达特性。方法　将人溶菌酶 (hLYZ)cDNA插入p2 0 5C3载体 ,用获得的基因构件注射小鼠受精卵 ,用PCR和Southernblot对出生鼠进行基因整合检测 ,用微球菌溶解试验和Westernblot对表达产物进行鉴定。结果　共出生 136只F0 代小鼠 ,从中筛选出 4只 (1♀ 3♂ )转基因整合阳性鼠 ,其中的 1只母鼠不表达hLYZ ,1只雄鼠的 4只F1 代母鼠乳汁中hLYZ的表达量分别为 5、75、175和 2 0 0 μg ml,纯合后的 3只F3代母鼠乳汁中hLYZ的表达量分别为 5 2 6 μg ml、6 4 8μg ml和 75 0 μg ml,表达仅限于乳腺中 ,表达产物的相对分子质量与正常hLYZ相同。结论　p2 0 5C3能驱动hLYZcDNA在小鼠乳腺中特异和高效表达 ,可以用于动物乳腺生物反应器的研制。     

可用于短肽基因免疫的真核表达载体的构建及应用

目的: 构建可高效表达表位短肽的基因免疫载体, 并研究其在表位为基础的基因免疫中的免疫效应。方法:将基因表达调控序列插入pUC19载体中, 加入KOZAK增强序列、基因克隆位点及转录起始和终止码, 构建可表达短肽的表达载体, 进一步将表位基因克隆到构建的真核载体中,并研究其在体外的表达和体内基因免疫特性。结果: 成功地构建了高效表达短肽的真核表达载体, 并能在小鼠体内诱导表位特异性的免疫应答。结论: 本实验中构建的含PEC的载体以表位为基础的DNA疫苗研究提供了新的设计策略和工具。     

血液流体动力学研究与生物反应器在组织工程化心脏瓣膜构建的应用

由于目前临床应用的心脏瓣膜替代物各有其固有的不足，探索以合适的方法构建具有生长活性的组织工程化心脏瓣膜一直是该领域各国学者研究报道的焦点。心脏瓣膜生物反应器模拟了心脏瓣膜在体内所处的血流动力学环境，并具有传质功能，所以在TEHV构建中除了要有足够健康的种子细胞和理想的生物支架材料，生物反应器是不可缺少的。对血液流动力研究进展，心脏瓣膜生物反应器的原理、构造与设计，生物反应器在心脏瓣膜组织工程中的应用范围进行了逐一概述。     

成骨细胞在旋转壁式生物反应器内的大规模扩增

目的 进行SD大鼠成骨细胞在旋转壁式生物反应器内大规模扩增培养的研究。方法利用微载体悬浮培养法在旋转壁式生物反应器内大规模扩增成骨细胞，检测其组织形态和生物功能后。作为接种到支架材料上并于反应器内三维环境中培养组织工程骨的种子细胞。结果成骨细胞在生物反应器中每代可以扩增十倍以上，同时经过倒置相差显微镜、SEM(扫描电镜)以及ALP(碱性磷酸酶)和MTT等生物学性能检测后，发现在旋转壁式生物反应器中三维培养的成骨细胞各种生物指标性能良好。结论新型旋转壁式生物反应器可以提供低剪切力的培养环境，而且细胞之间有三维联系的机会，成骨细胞表现出良好的体外扩增能力，适于建立一种理想的成骨细胞体外扩增的三维培养体系。     

组织工程生物反应器的力学环境特点

组织工程学是一门以细胞生物学和工程学为基础,应用工程学和生命科学的原理,开发器官缺损患者所需代替物,并构建和保持或增强其组织功能性的一门交叉学科。生物反应器作为组织工程中非常重要的工具,目前主要是从生物力学问题、三维空间培养问题、传质问题、培养的环境条件问题(pH、氧张力等)和物理因素(电场、磁场、应力场)等方面开展其研究。本文作者主要从生物力学角度介绍组织工程生物反应器研究的最新进展,重点探讨组织工程生物反应器的力学环境。