乳腺生物反应器的基础研究──载体构建,检测及反应器的建立方法

乳腺生物反应器的研究和开发是近年生物工程领域的研究热点。乳腺特异性表达调控的研究和表达载体的构建是该工作的基础和关键。本文介绍了乳腺蛋白基因表达调控的研究现状，外源基因乳腺特异性表达载体构建策略以及乳腺生物反应器建立方法的研究进展。     

转人溶菌酶基因小鼠乳腺生物反应器的建立

目的 研究人溶菌酶（human lysozyme，hLYZ）动物乳腺生物反应器制备的可行性。方法 将hLYZ基因与动物乳腺特异表达载体p205C3连接，所得重组载体p205C3-hLYZ用显微注射法建立转基因小鼠。结果 共出生了136只F0代小鼠，PER和Southern杂交检测基因整合阳性率分别为5．15％（2♀5♂）和2．94％（1♀3♂）。Western印迹检测结果表明，分泌在小鼠乳汁中的表达产物与正常hLYZ具有相同的分子量。目前转基因小鼠已经繁殖到B代，每一代基因整合阳性母鼠的乳腺均表达hLYZ，乳汁中的表达量最高达750mg/L。斑点杂交试验证明，表达有较强的组织特异性，除在乳腺表达外，仅在脾脏和小肠有一定的异位表达。结论 成功建立了hLYZ小鼠乳腺生物反应器。     

血液流体动力学研究与生物反应器在组织工程血管构建的应用

利用生物反应器构建组织工程化血管是近年来诞生的一项新技术。本综述了其理论基础即血液流体动力学的研究进展，生物反应器的原理、结构、应用及评估，同时提出存在的问题并展望其应用前景。     

血液流体动力学研究与生物反应器在组织工程血管构建的应用

利用生物反应器构建组织工程化血管是近年来诞生的一项新技术。本文综述了其理论基础即血液流体动力学的研究进展,生物反应器的原理、结构、应用及评估,同时提出存在的问题并展望其应用前景。     

灌注式生物反应器中大段多孔磷酸三钙载体内流场分布的模拟研究

目的　对灌注式生物反应器中大段多孔磷酸三钙载体内流场分布进行模拟研究。方法　使用计算流体动力学(computational fluid dynamics, CFD)方法对我们自行设计的灌注式生物反应器中大段多孔β-TCP载体内流场分布情况进行了模拟研究,并对不同灌注速度条件下载体材料内的流体剪切应力进行了计算。结果利用CFD方法可以很好的模拟三维载体材料内的流场分布,并可以对载体材料内部的流体剪切应力进行计算。在我们的灌注反应体系中,3ml/min, 6ml/min及9ml/min灌注速度条件下载体内主要区域的流速值分别为(0.227±0.062)mm/s、(0.459±0.125)mm/s以及(0.701±0.193)mm/s,而相应的流体剪切应力值分别为5.2±1.5mPa、10.6±3mPa以及16.2±4.6Pa。结论　利用计算流体动力学(CFD)这一计算模型可以进行不同灌注系统之间结果的比较及不同显微结构载体之间结果的比较。并且可以根据细胞实验结果选择适于细胞分布增殖或者分化的流体剪切应力值。进而为组织工程中生物反应器的流速选择以及载体材料结构的加工提供依据。     

平滑肌细胞在旋转生物反应器内的微载体培养与快速扩增

为获取足量数量活性良好的膀胱平滑肌种子细胞,本实验探索在旋转生物反应器内应用微载体技术快速扩增膀胱平滑肌细胞的方法。将培养的第二代新西兰兔膀胱不滑肌细胞应用Cytodex-3微载体在旋转生物反应器（RCCS）内进行动态培养,观测平滑肌细胞的生长情况和细胞代谢率,进行a-肌动蛋白免疫组化染色,并与常规方法培养平滑肌细胞进行比较。结果显示膀胱平滑肌细胞在Cytodex-3微载体上生长迅速、细胞代谢率高、生长倍增时间缩短。在培养第九天,细胞数量可达最初接种的23倍。免疫组化显示平滑肌细胞活性良好。结果表明利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增平滑肌细胞,可为构建组织工程化人造膀胱提供大量活性良好的平滑肌细胞。     

软骨组织工程生物反应器的研究进展

体外软骨构建是软骨组织工程产业化发展及临床应用的重要手段。然而,采用现有的体外构建技术无法构建功能接近正常的软骨。生物反应器能够在一定程度上模拟体内环境,有望弥补现有体外构建技术的弊端。研究发现,流体剪切力、静态液压力和直接压缩力是体内软骨发育和成熟的重要力学因素,常用软骨生物反应器均据此设计而产生。由于不同类型生物反应器各具特点,研究和开发新型复合式生物反应器将成为未来的发展方向。对目前软骨组织工程生物反应器的研究现状做一综述。     

成骨细胞在旋转壁式生物反应器内的大规模扩增

目的 进行SD大鼠成骨细胞在旋转壁式生物反应器内大规模扩增培养的研究。方法利用微载体悬浮培养法在旋转壁式生物反应器内大规模扩增成骨细胞，检测其组织形态和生物功能后。作为接种到支架材料上并于反应器内三维环境中培养组织工程骨的种子细胞。结果成骨细胞在生物反应器中每代可以扩增十倍以上，同时经过倒置相差显微镜、SEM(扫描电镜)以及ALP(碱性磷酸酶)和MTT等生物学性能检测后，发现在旋转壁式生物反应器中三维培养的成骨细胞各种生物指标性能良好。结论新型旋转壁式生物反应器可以提供低剪切力的培养环境，而且细胞之间有三维联系的机会，成骨细胞表现出良好的体外扩增能力，适于建立一种理想的成骨细胞体外扩增的三维培养体系。     

应用转瓶和生物反应器培养表达HBsAg的哺乳动物细胞系的比较研究

大规模培养哺乳动物细胞是生产具有重要医用价值的生物制品 ,如疫苗、生长因子、单抗等的重要方法。哺乳动物细胞的大规模培养方式主要有传统的转瓶和现代的各种生物反应器。目前 ,我国乙型肝炎疫苗 (转基因中华地鼠卵巢细胞产品 )的生产采用转瓶培养方式。但近年来 ,应用载体和生物反应器大规模培养哺乳动物细胞已成为国际上细胞培养工业化最有发展前途的技术〔1〕 。本室引进了国外最新的篮式载体型生物反应器系统用于哺乳动物细胞系的大规模培养研究。本实验分别采用转瓶和生物反应器系统培养表达乙型肝炎表面抗原Ｓ和ＰｒｅＳ1的哺乳动…     

75L生物反应器制备乙型脑炎病毒工艺研究

目的初步探索应用75L生物反应器和Cytodex1型微载体大规模培养Vero细胞制备乙型脑炎病毒的工艺。方法将14L生物反应器中细胞移种至75L生物反应器培养至单层,接种乙脑病毒,培养96h收获乙脑病毒原液。结果 75L生物反应器采用6g/L微载体浓度,细胞数最高达5.5×10^6/ml,病毒收获液滴度最高达7.84LgPFU/ml。结论用75L生物反应器制备乙脑病毒原液工艺稳定且易于规模放大。     

新型生物人工肝反应器悬浮培养参数的优化测定

目的对新型生物人工肝反应器进行参数的优化测定,以寻找更适合肝细胞生长的工作条件。方法从实验和仿真两方面优化运行参数。通过调节生物反应器旋转速度、培养液流速,寻找能使细胞微载体均匀悬浮于反应器的合理运行参数。利用流体动力学仿真软件Fluent对新型生物反应器进行仿真,将仿真结果与实验结果进行对比得出合理工作范围。结果生物反应器的旋转往复周期Z越大,反应器内细胞微载体达到均匀悬浮状态时所需的培养液流速就越大,即控制培养液流动的蠕动泵转速￡越大。在确保细胞微载体均匀悬浮分布下,往复周期Z=0．5min时,没有合适的,J值满足要求;往复周期Z=0．4min时,三的工作范围为120～160r／min;往复周期Z=0．3min时,￡的工作范围为80～160r／min。结论合理的运行参数优化了生物人工肝的工作方式,为动物实验及临床实验奠定了基础。     

采用生物反应器体外构建大面积组织的接种技术

目的　采用培养袋生物反应器进行大面积支架材料细胞接种技术的研究。方法　以人体成纤维细胞和PET无纺布支架材料为模型,考察水平摇床的转速和起始细胞悬液密度对细胞接种动力学、细胞接种率、支架中细胞密度以及细胞分布的影响。结果　在实验条件范围内,成纤维细胞接种大面积PET支架材料的过程基本符合一级反应动力学;低细胞悬液密度接种时,接种率和支架中细胞密度随转速的增加而下降,高细胞悬液密度接种时则反之;细胞分布均匀度都随着转速的增加而下降,起始细胞悬液密度对细胞分布影响较小。结论　采用培养袋生物反应器进行大面积支架材料的细胞接种是可行的,研究结果为进一步优化适合大面积支架材料接种的方法奠定基础。     

血液流体动力学研究与生物反应器在组织工程化心脏瓣膜构建的应用

由于目前临床应用的心脏瓣膜替代物各有其固有的不足，探索以合适的方法构建具有生长活性的组织工程化心脏瓣膜一直是该领域各国学者研究报道的焦点。心脏瓣膜生物反应器模拟了心脏瓣膜在体内所处的血流动力学环境，并具有传质功能，所以在TEHV构建中除了要有足够健康的种子细胞和理想的生物支架材料，生物反应器是不可缺少的。对血液流动力研究进展，心脏瓣膜生物反应器的原理、构造与设计，生物反应器在心脏瓣膜组织工程中的应用范围进行了逐一概述。     

生物反应器的设计与组织工程肌腱的构建

目的设计一套生物反应器,能构建具有较好形态和机械力学性能的肌腱组织。方法根据肌腱细胞体内的生物和力学环境,建立了细胞和可降解材料复合物的力学模型,设计了一套能够模拟体内力学环境的生物反应器,采用鸡肌腱为种子细胞培养扩增后接种于聚羟基乙酸(PGA)材料上,形成细胞-材料复合物并置于反应器中培养。设静态培养对照组,通过实验取材进行大体观察、组织学和生物力学检测。结果生物反应器能够构建出具有一定组织结构和机械强度的肌腱。检测结果显示恒定交变应力作用下培养的肌腱优于静态培养的肌腱组织。结论细胞和可降解材料复合物的力学模型具有一定的正确性,通过分析也存在某些局限性;应力作用下可以促进肌腱细胞基质的分泌,蠕变特性成为促进胶原定向排列的重要因素。     

中空纤维生物反应器的构建及其体外灌流实验

设计原代培养的乳猪肝细胞构建生物反应器,并观察肝细胞生长特点,进行体外灌流实验。采用改良的原位胶原酶灌流法分离乳猪肝细胞及间质细胞,在中空纤维舱的纤维外间隙中共培养,并间断旋转抑制细胞贴壁。用该生物反应器建立人工肝系统,对肝硬化病人的腹水进行体外灌流实验。结果表明,乳猪原代肝细胞平均产量为(6.29±0.37)×108细胞,肝细胞的活性为84%;在纤维外间隙内间断转动培养3 h后肝细胞聚合成球。电镜可见,多个肝细胞聚合成团生长,培养的肝细胞有功能性结合,并向组织型转化。测定中空纤维舱内连续48 h培养液尿素浓度,证实肝细胞聚合体有很好的尿素合成功能。体外灌流后,生物反应器组腹水总胆红素下降,A ST升高,与对照组相比有显著性差异。生物反应器组葡萄糖浓度下降,对照组无显著变化,两组间有显著性差异。通过本组实验,证实了我们设计的生物反应器所构成的生物型人工肝(BAL)是有效的。     

利用hBMSCs在生物反应器中构建小口径血管的实验研究

目的 采用改进的生物反应器系统,应用人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)构建小口径的组织工程血管.方法 设计一套血管生物反应器系统,采用有限元方法对组织工程小血管托架材料进行分析,从而设计一套用于构建直径为2mm的小血管托架;收集人的原代骨髓基质干细胞进行体外扩增和培养,选用第3代细胞与聚羟基乙酸酯(PGA)复合后置于血管生物反应器中动态培养;培养4周后,对材料复合物取材,进行大体观察、HE染色、扫描电镜和平滑肌免疫组化等指标检测.结果 血管色泽明亮,有一定的弹性,用镊子反复压下血管能够反弹恢复原样;细胞分泌的胶原基质排列较规则,免疫组化结果表明血管含有平滑肌弹性肌动蛋白的成分.结论 改进的血管生物反应器能模拟血管的力学环境,并能利用hBMSCs成功构建组织工程化小血管组织.     

旋转灌注式生物反应器系统构建及在骨组织工程中的应用

构建一种旋转灌注式生物反应器系统，并设计制造具有相互连通微管道结构的大段支架。生物反应器在旋转的同时实现对大段支架的灌注，系统内外气体的实时交换通过安装在反应器两端的半透膜和可透气的蠕动泵软管实现。容器内的氧气和营养物质在得到充分混合之后，连续不断地输送到支架微管道内。使黏附在微管道内的细胞获得充足营养的同时受到一定流体剪应力的刺激，调节细胞功能的发挥。该系统克服了静态培养中存在的各种缺点，改善了培养环境，增加了培养过程的可控性，有助于促进黏附在微管道内部的细胞增殖、分化和产生大量基质。将成骨细胞／支架结构体在该生物反应器系统中培养14d后，用扫描电镜观察细胞在大段支架微管道内的生长情况，结果表明，支架微管道内有大量细胞长入。     

肝组织工程研究中生物反应器的研究进展

文章就生物反应器的特点、生物反应器在肝组织工程中的应用（肝组织重建、生物人工肝脏、药物筛选、生物反应器在肝组织工程其他相关方面的应用）进行综述,论述目前生物反应器亟待解决的问题是供氧问题、细胞密度和分布及微型化,指出生物反应器作为一个重要的媒介促进肝组织工程及生物人工肝的研究发展：同时肝细胞反应器可有效提高培养肝细胞的生物功能,其也将为肝再生医学的理论研究、肝脏的药物代谢及功能评价等提供有效的技术手段,肝细胞生物反应器的研发具有重要的理论意义和巨大的经济价值。     

生物反应器体外构建组织工程化尿路肌性管腔

背景：理想的组织工程尿道替代物应具有良好的力学特性,足以承受长时间的尿液排泄冲击,而静态培养的尿路肌性管腔强度不佳。已有研究表明,力学刺激能够促进细胞生长和细胞外基质的分泌。 目的：探讨生物反应器内构建组织工程化尿路肌性管腔的可行性。 方法：酶消化法获取脂肪干细胞,经体外培养和扩增后,流式细胞技术检测细胞表面抗原,将脂肪干细胞接种于聚羟基乙酸上,形成细胞-材料复合物,体外培养1周后,将其置于生物反应器内培养,实验组予以动态力学刺激培养;对照组为静态培养,先采用基础培养基培养3周,而后用成肌诱导培养液诱导4周,行大体观察及组织学检测。 结果与结论：流式细胞仪检测细胞表面CD90,CD44,CD105表达率分别为99.42%,98.12%,93.27%;CD34,CD45表达率分别为4.92%和0.38%,实验组培养的肌性管腔色泽明亮,管腔圆润,免疫组化染色显示,细胞材料复合物在诱导4周后,细胞表达结蛋白和α-平滑肌肌动蛋白阳性,细胞材料复合物胶原成分多。对照组构建的肌性管腔色泽暗淡,管腔轻度塌陷,细胞材料复合物胶原成分较少。提示脂肪干细胞复合聚羟基乙酸材料在生物反应器内动态培养可构建具有良好结构的尿路肌性管腔。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

含有HA或myc基因的融合表达载体构建及应用研究

目的：构建含有HA和myc编码序列的真核细胞融合表达载体,用于验证两种蛋白质之间的相互作用。方法利用寡核苷酸合成和PCR技术,扩增HA和myc的部分编码序列。在哺乳动物细胞表达载体pcDNA3的基础上,构建了pcDNA3(HA)和pcDNA3(myc)两种真核融合表达载体。结果将两种候选蛋白折编码序列分别克隆于上述融合载体,转染Cos-7细胞后的表达产物。可利用抗HA或myc的mAb进行Western-blot和免疫共沉淀。结论利用上述系统。可验证两种候选蛋白在哺乳动物细胞中是否具有相互作用。